CN109134517A - 14核金膦硫簇合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双核金膦氯配合物以及由该配合物作为原料制备的14核金膦硫簇合物，该簇合物为块状晶体，其分子式为C155H136Au14Cl2N10P10S6，化学式为[Au14S6(bdppmapy)5]Cl2，其中bdppmapy代表N,N‑二(二苯基膦甲基)‑2‑氨基吡啶；所述14核金膦硫簇合物为三斜晶系，空间群为Pī，晶胞参数为：α＝87.453(3)°，β＝76.042(2)°，γ＝75.797(2)°。本发明还公开了所述14核金膦硫簇合物作为溶酶体靶向探针的应用。本发明的14核金膦硫簇合物，具有较好的荧光性质和较高的量子产率，且具有较低的细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及金属簇合物技术领域，具体涉及一种14核金膦硫簇合物及其制备方法，以及其作为溶酶体靶向探针在细胞成像方面的应用。
背景技术
近年来，为了将细胞中的细胞器功能和活动可视化，细胞器特异性标记物已经引起了广泛的关注。其中，溶酶体作为重要的细胞器，是细胞内膜系统的一部分，在一系列的细胞生物活动，如质膜修复、免疫应答、能量代谢和细胞稳态等过程中起到了至关重要的作用(参见：J.Chan,S.C.Dodani,C.J.Chang, Nat.Chem.,2012,4,973-984.)。为了揭示溶酶体的形态和功能，具有溶酶体靶向的荧光探针的设计和合成也成为科学家们研究的热点。
传统的染料类荧光探针如罗丹明衍生物能够选择性地标记细胞内溶酶体，然而，这些探针往往具有较高的细胞毒性，且具有选择性低和光稳定性差等缺点(参见：J.Li,N.Kwon,Y.Jeong,S.Y.Lee,G.Kim,J.Yoon,ACS Appl.Mater. Inter.,2018,10,12150-12154.)。近年来，有些研究人员使用金属配合物或金纳米颗粒作为分子荧光探针，它能够解决传统染料的一些问题，例如，相对不稳定的金属配位键使它们具有可生物降解性。然而，金属配合物或金纳米颗粒类的荧光探针仍然受到包括溶解性差，尺寸不均匀和选择性低等方面的限制(参见：A.C.McKinlay,R.E.Morris,P.Horcajada,G.Férey,R.Gref,P.Couvreur,C. Serre,Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49,6260-6266.)。因此，开发能够克服以上缺点的荧光探针仍然是一个重大的挑战。
另一方面，探针的长期跟踪能力是评价荧光探针实用性的重要指标。大多数商业的小分子荧光探针例如Lyso Tracker DND系列和中性红系列在荧光标记中表现较高的pH依赖性，从而难以实现对于细胞器的长期追踪(参见：Y.P.Ho, K.W.Leong,Nanoscale,2010,2,60–68.)。量子点或金纳米粒子可以适当延长成像周期，但其具有的高细胞毒性仍然限制了其在长期跟踪中的应用。因此，开发具有低细胞毒性的荧光多核金簇合物用于活细胞中的溶酶体的长期追踪具有十分重要的研究意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种14核金膦硫簇合物的制备方法，该制备方法得到14核金膦硫簇合物，具有较好的荧光性质和较高的量子产率，且具有较低的细胞毒性。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种双核金膦氯配合物，该配合物能够作为制备前述的14核金膦硫簇合物的原料。
所述双核金膦氯配合物具有式(1)所示的结构式：
上述的双核金膦氯配合物由金、配体N,N-二(二苯基膦甲基)-2-氨基吡啶和氯组成，其分子式为C31H28Au2Cl2N2P2，化学式为[(AuCl)2bdppmapy]，其中，所述的配体N,N-二(二苯基膦甲基)-2-氨基吡啶简写为bdppmapy。
本发明还提供了上述双核金膦氯配合物的一种制备方法，包括以下步骤：将N,N-二(二苯基膦甲基)-2-氨基吡啶与Au(tht)Cl在溶剂中反应3～6小时，得到所述双核金膦氯配合物。
作为优选，原料N,N-二(二苯基膦甲基)-2-氨基吡啶与Au(tht)Cl的摩尔比为 1:1～3；更优选的，所述摩尔比为1:2。
作为优选，所述溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷；更优选的，所述溶剂为二氯甲烷。
作为优选，反应在搅拌的条件下进行。
作为优选，反应的时间优选为3h。
作为优选，所述反应在避光的条件下进行，有利于提高产物的产率。
另外，将上述制备过程中得到的反应液经浓缩、溶剂扩散后，得到上述双核金膦氯配合物的晶体，其为无色块状晶体，单斜晶系，空间群为C 2/c，晶胞参数为：β＝94.56(3)°。
作为优选，所述扩散所用的溶剂为正己烷或乙醚。
本发明另一方面提供了一种14核金膦硫簇合物(Au14)，该簇合物为黄绿色块状晶体，其分子式为C155H136Au14Cl2N10P10S6，化学式为[Au14S6(bdppmapy) 5]Cl2，其中bdppmapy代表N,N-二(二苯基膦甲基)-2-氨基吡啶；所述14核金膦硫簇合物为三斜晶系，空间群为Pī，晶胞参数为： α＝87.453(3)°，β＝76.042(2)°，γ＝75.797(2)°。
上述簇合物是基于P-N混合配体N,N-二(二苯基膦甲基)-2-氨基吡啶，μ3配位硫原子以及14个Au所组成，其阳离子骨架的结构如式(Ⅱ)所示：
本发明还提供了上述14核金膦硫簇合物的一种制备方法，该制备方法包括以下步骤：
将前述的双核金膦氯配合物、硫化钠或其水合物在溶剂中反应3～6小时，得到的反应液经过滤、浓缩和溶剂扩散后，得到所述14核金膦硫簇合物。
作为优选，原料双核金膦氯配合物、硫化钠或其水合物的摩尔比为1:1～2，更优选的，所述摩尔比为1:1。
作为优选，所述原料之一为九水合硫化钠。
作为优选，所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的混合溶剂，其体积比为1:1～4；更优选的，所述二氯甲烷和乙醇的体积比为1:1。
作为优选，反应在搅拌的条件下进行。
作为优选，反应的时间优选为3h。
作为优选，所述扩散的溶剂为乙醚或正己烷。
作为优选，所述反应在避光的条件下进行，有利于提高产物的产率。
本发明的14核金膦硫簇合物具有良好的荧光特性，在420nm激发波下，在最大发射波长535nm处有很强的荧光峰。另外，该簇合物还具有良好的溶酶体靶向性和较低的细胞毒性。因此，本发明还提供了所述14核金膦硫簇合物在细胞荧光标记方面的应用，例如作为溶酶体靶向探针。
本发明的有益效果：
1.本发明公开了一种新的14核金膦硫簇合物的制备方法，该制备方法的合成工艺简单，反应条件温和。在合成时选取P-N混合配体N,N-二(二苯基膦甲基)-2-氨基吡啶作为稳定桥连配体，为合成稳定的金膦硫簇合物提供了新的思路。
2.本发明公开的14核金膦硫簇合物，具有较好的荧光性质和较高的量子产率，且在细胞实验中展现出了较低的细胞毒性，为新型荧光探针的研究提供了新选择，同时拓宽了该类金膦硫簇合物的应用范围。
3.本发明公开的14核金膦硫簇合物，在细胞成像的研究中具有较高的靶向性和较强的光稳定性。同时簇合物能够实现对于溶酶体的长时间标记，当标记实验延长至36h时，荧光强度没有明显的衰减，明显优于商品溶酶体染料 Lyso-Tacker Red。
附图说明
图1为实施例1中[(AuCl)2bdppmapy]的晶体结构图；
图2为实施例1中Au14的制备反应示意图；
图3为实施例2中Au14的晶体结构图；
图4为实施例2中Au14的晶体结构正视图及俯视图；
图5为实施例3中Au14的荧光光谱图；
图6为实施例4中CCK8法测定Au14对于Hela细胞的细胞毒性结果；
图7为实施例5中Au14与商品溶酶体染料Lyso-Tacker Red对活细胞溶酶体的共定位成像实验结果图；其中，图7A为明场图，图7B为Au14对活细胞溶酶体成像图，图7C为Lyso-Tacker Red对活细胞溶酶体成像图，图7D为Au14 和Lyso-Tacker Red对活细胞溶酶体成像图的叠加，图7E为Au14和Lyso-Tacker Red对活细胞溶酶体的共定位标记中，ROI划线区域信号的叠加；
图8为实施例6中Au14和Lyso-Tacker Red的长期跟踪能力测试的细胞成像实验结果图；
图9为实施例6中Au14和Lyso-Tacker Red的长期跟踪能力测试中的荧光强度变化柱状图。
图10为实施例7中对Au14和Lyso-Tacker Red的光稳定性测试的细胞成像实验结果；
图11为实施例7中对Au14和Lyso-Tacker Red的光稳定性测试的荧光强度损失柱状图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：双核金膦氯配合物[(AuCl)2bdppmapy]的制备
室温下将Au(tht)Cl(0.1605g,0.5mmol)和配体bdppmapy(0.1225g,0.25 mmol)加入到10mL的二氯甲烷溶剂中，用磁力搅拌器搅拌三小时后形成澄清溶液，将此清液置于扩散管中，利用扩散法将25mL正己烷覆盖到滤液上层， 2天后析出无色块状晶体[(AuCl)2bdppmapy]。收集该晶体，然后用正己烷充分洗涤，最后置于30℃真空干燥箱中干燥，产率：0.2223g(纯度93.1％，基于金计算)
元素分析(％)：C31H28Au2Cl2N2P2(M.W.＝955.33)，理论值：C,38.95；H,2.93； N,2.93％；实测值：38.79；H,3.03；N,2.87％。
红外光谱(溴化钾压片法)：3416(m),3146(m),3051(m),1599(s),1544(m), 1496(s),1482(s),1435(vs),1344(s),1262(m),1186(w),1099(s),1027(s),998 (w),851(w),759(m),692(m),512(w)cm-1。
对该产物进行X射线单晶衍射试验，其晶体学参数见表1，配合物 [(AuCl)2bdppmapy]的晶体结构如图1所示。
表1.配合物[(AuCl)2bdppmapy]的晶体学参数
上述数据表明，本实施例成功得到了双核金膦氯配合物[(AuCl)2bdppmapy]。
实施例2：14核金膦硫簇合物Au14的制备
室温下将前驱体[(AuCl)2bdppmapy](0.0955g,0.1mmol)的二氯甲烷溶液 (5mL)加入到Na2S·9H2O(0.0240g,0.1mmol)的乙醇溶液(5mL)中，用磁力搅拌器搅拌3小时后得到黄色溶液和灰色沉淀，过滤得黄色清液。将此清液置于扩散管中，利用扩散法将25mL乙醚覆盖到滤液上层，3到5天后析出黄绿色块状晶体[Au14S6(bdppmapy)5]Cl2。收集该晶体，然后用乙醚充分洗涤，最后置于30℃真空干燥箱中干燥，产率：0.0710g(纯度91.0％，基于金计算)。
簇合物[Au14S6(bdppmapy)5]Cl2的结构如图3所示，为了更好的展示其结构，图4示出了其正视图和俯视图。
实施例3：14核金膦硫簇合物Au14的基本表征及荧光测试
对Au14进行了红外、元素分析和X-射线单晶衍射的表征，且研究了其荧光性质，具体结果如下。
表2.簇合物[Au14S6(bdppmapy)5]Cl2的晶体学参数
元素分析(％)：C155H136Au14Cl2N10P10S6(M.W.＝5469.22)，理论值：C,34.01； H,2.49；N,2.56％；实测值：C,33.97；H,2.33；N,2.67％。
红外光谱(溴化钾压片法)：3442(s),1628(m),1592(s),1474(s),1435(s), 1400(m),1384(m),1314(w),1218(w),1158(w),1099(s),1084(s),998(m),859 (s),741(m),691(m),508(m),481(w)cm-1。
上述数据表明，本实施例成功得到了14核金膦硫簇合物Au14，即 [Au14S6(bdppmapy)5]Cl2。
由图5所示，在波长为420nm的光激发下，Au14在535nm处出现很强的荧光发射。
实施例4：Au14的细胞毒性测试
生物相容性是生物成像应用中的重要参数之一，我们使用CCK8法评估其对Hela细胞的细胞毒性。由图6所示，当Hela细胞在Au14簇合物浓度范围为 0-50μM的条件下培养24小时后，细胞存活率均大于95％，表明其较好的生物相容性，可以应用于后续的细胞成像实验。
实施例5：Au14与商品溶酶体染料Lyso-Tacker Red对活细胞溶酶体的共定位成像实验
将本发明中的Au14作为荧光探针应用于Hela细胞中进行荧光成像应用。具体操作步骤:将含有Au14的培养液(浓度为10μM)加入Hela细胞中，在二氧化碳培养箱中培养6小时后用PBS溶液洗涤三次，并用激光共聚焦显微镜进行成像。由图7所示，首先进行明场成像，图7A可以看到细胞大致的轮廓，随后用458nm的光进行激发观察，可以观察到绿色通道的荧光成像图，如图 7B所示，有明亮的荧光在绿色通道发出。随后将50nM的商业用荧光标记物Lyso-Tacker Red加入到上述培养液中，孵育5分钟后用512nm的光进行激发，如图7C所示，可以观察到明亮的荧光在红色通道发出。将红色通道和绿色通道的荧光图进行叠加可得到图7D。将图7D进行ROI划线确定其红色通道和绿色通道的信号叠加，由图7E可看出信号重合度较高，由此说明Au14作为荧光探针可以用于细胞成像，并对于溶酶体有较好的靶向作用。
实施例6：Au14与商品溶酶体染料Lyso-Tacker Red的长期追踪测试
为了定量测量Au14和商业用荧光标记物Lyso-Tacker Red的在长期追踪标记方面的表现，我们做了相关的测试。选取两组对比的Hela细胞，培养24小时至细胞贴壁后，分别加入含有10μM Au14或50nM商业用荧光标记物 Lyso-Tacker Red的培养液进行染色。分别在加入染色物质后15分钟、30分钟、 1小时、1.5小时、3小时、6小时、12小时、24小时和36小时通过共聚焦显微镜观察其成像情况并计算其荧光强度。如图8-9所示，利用Au14染色的Hela 细胞随时间的延长荧光强度逐步增加，在12小时到达最大值并持续至36小时强度变化不大。而利用商业用荧光标记物Lyso-Tacker Red标记的Hela细胞随时间的延长荧光强度显著下降，在标记1.5小时后强度衰减至初始强度的20％。显然，本发明中提及的Au14簇合物更有利于用作长期溶酶体跟踪器。
实施例7：Au14与商品溶酶体染料Lyso-Tacker Red的耐光性测试
为了定量测量Au14和商业用荧光标记物Lyso-Tacker Red的光稳定性，我们通过共聚焦显微镜连续扫描细胞。Hela细胞用10μM Au14或50nM商业用荧光标记物Lyso-TackerRed分别染色6小时和15分钟，随后458nm和512nm 通道分别用于照射Au14或Lyso-TackerRed染色的细胞。将Au14或Lyso-Tacker Red染色细胞的初始荧光强度归一化，在连续照射后计算荧光信号损失的百分比。如图10-11所示，10分钟后，14核金膦硫簇合物的信号损失约为20％，第一分钟和第10分钟之间并没有明显差异，相比之下，商业用荧光标记物 Lyso-Tacker Red组的荧光细胞则损失约80％，在10分钟的连续扫描后仅观察到非常弱的信号，说明相较于商业用荧光标记物Lyso-Tacker Red，Au14簇合物作为荧光探针展示出更好的光稳定性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种双核金膦氯配合物，其特征在于，所述双核金膦氯配合物具有式(1)所示的结构式：
2.根据权利要求1所述的双核金膦氯配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将N,N-二(二苯基膦甲基)-2-氨基吡啶与Au(tht)Cl在溶剂中反应3～6小时，得到所述双核金膦氯配合物。
3.如权利要求2所述的双核金膦氯配合物的制备方法，其特征在于，所述溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷。
4.如权利要求2所述的双核金膦氯配合物的制备方法，其特征在于，所述N,N-二(二苯基膦甲基)-2-氨基吡啶与Au(tht)Cl的摩尔比为1:1～3。
5.如权利要求2所述的双核金膦氯配合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将得到的反应液进行浓缩和溶剂扩散的步骤，扩散所用的溶剂为正己烷或乙醚。
6.一种14核金膦硫簇合物，其特征在于，所述14核金膦硫簇合物为块状晶体，其分子式为C155H136Au14Cl2N10P10S6，化学式为[Au14S6(bdppmapy)5]Cl2，其中bdppmapy代表N,N-二(二苯基膦甲基)-2-氨基吡啶；所述14核金膦硫簇合物为三斜晶系，空间群为Pī，晶胞参数为： α＝87.453(3)°，β＝76.042(2)°，γ＝75.797(2)°。
7.根据权利要求6所述的14核金膦硫簇合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将双核金膦氯配合物、硫化钠或其水合物在溶剂中反应3～6小时，得到的反应液经过滤、浓缩和溶剂扩散后，得到所述14核金膦硫簇合物；
其中，所述双核金膦硫配合物具有式(1)所示的结构式：
8.如权利要求7所述的14核金膦硫簇合物的制备方法，其特征在于，所述双核金膦氯配合物、硫化钠或其水合物的摩尔比为1:1～2。
9.如权利要求7所述的14核金膦硫簇合物的制备方法，其特征在于，所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的混合溶剂，其体积比为1:1～4。
10.权利要求6所述的14核金膦硫簇合物作为溶酶体靶向探针的应用。
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