CN109122307A - 一种辐照诱变的构树种子诱导催芽方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种辐照诱变的构树种子的诱导催芽方法，涉及植物诱变领域，以碳离子束对构树种子辐照，辐照剂量为30～100Gy；诱变后的构树种子先以水或浓硫酸浸泡，洗净；再在光照培养至种子露白，将露白的种子播种至栽培基质中，获得发芽的构树幼苗。本发明将碳离子束的辐照剂量控制在30～100Gy，既可达到辐照诱变的目的也能降低碳离子束对于构树种子发芽率的影响。本发明所述诱导催芽方法的构树种子发芽率达到6.5～10.0％。辐照构树种子发芽幼苗中叶片叶型变异参数全缘/缺刻1～1.14，即构树种子辐照后幼苗叶片表型发生明显变异。为今后研究构树种子碳离子束诱变群体提供基础条件。

Description

一种辐照诱变的构树种子诱导催芽方法

技术领域

本发明涉及植物诱变技术领域，尤其涉及一种诱变的构树种子的诱导催芽方法。

背景技术

构树(Broussonetia papyrifera(L.)vent)别名彀、楮树、鹿仔树、谷浆树、野杨梅子等，为桑科(Moreceae)构树属(Broussonetia)多年生落叶乔木或灌木，雌雄异株，株高可达20m。构树属全世界共有5种，分布于亚洲东部和太平洋岛屿。我国有3种，即构树、小构树、藤构，分布于我国除东北北部、西北北部以外的大部分地区，大多数野生，少量栽培。构树为阳性树种，但具有一定的耐荫性，在郁闭度0.4以下的林下可正常生长，适应环境的能力极强，既耐干旱、贫瘠、盐碱，又耐干冷湿热气候，在酸性、中性或石灰质土、含盐0.4％以下的土地和深山荒地均能旺盛生长。

构树作为一种纸浆林、饲料原料林和绿化树种，具有广泛的经济价值和社会价值，然而构树一般处于野生状态，缺乏人工造林。为了加速构树资源的开发利用，人们对其繁殖的研究越来越多。目前，构树可以通过播种、根蘖、扦插和组织培养等方法进行繁殖。

构树果实成熟采集后，装在桶内或者盆内加水，用水揉搓去除外种皮等渣质，即得到了纯净的构树种子，经阴干即可播种。但是，构树种子较小，种皮坚硬，千粒重仅为2g，常规田间发芽率不足4％，造成了种子的大量浪费和造林中构树种苗的匮乏。

近年来，碳离子束作为一种新兴的辐照源，由于自身独特的优势使其在生命科学研究中具有重要地位，并在植物育种中取得了巨大的经济和社会效益，为植物育种提供了新途径。

高能碳离子束与中性辐照X，γ射线和中子等在物理学和生物学上差别很大，也与质量很轻、带负电荷的电子差别很大。碳离子束在穿越介质过程中具有较高的传能线密度(LET)，在其离子径迹上有较大的能量沉积，属致密电离辐照，能够诱发更多的生物损伤。因此，相同剂量辐照下，碳离子束比稀疏电离(如X/γ射线)具有高得多的相对生物学效应(RBE)2。高LET辐照引起DNA双链断裂增加，表现出局部损伤严重。碳离子束能量沉积过程中，其射程末端存在一个尖锐的能量损失峰，即Brag峰。由Bragg峰可知碳离子束能量沉积的空间分辨很好，它可以使生物体系受到严重影响的部位是局部的。因此，碳离子束辐照在有更多生物学效应的同时能提高存活率，有利于获得更多突变体。

构树种子在自然状态下的发芽率就低，并且构树种子个体较小，受到高能碳离子束辐照束诱变后构树种子由于遭受了较多的生物损伤，使得诱变后的构树种子发芽率极低，无法获得有效数量的诱变后构树种苗，阻碍了进一步的选育研究。

发明内容

本发明为了解决碳离子束辐照诱变后的构树种子发芽率低的问题，提供了一种诱变的构树种子的诱导催芽方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种构树种子的诱导催芽方法，包括以下步骤：

(1)以碳离子束对构树种子进行辐照，得到辐照种子；所述碳离子束的辐照剂量为30～100Gy；

(2)以水或浓硫酸浸没辐照种子，洗净，得到诱变后的构树种子；

(3)将诱变后的构树种子以水浸泡，光照培养至构树种子露白，将露白的构树种子播种至栽培基质中，得到发芽的构树种子。

优选的，所述步骤(1)中，碳离子束的辐照剂量为50Gy。

优选的，所述步骤(1)中，碳离子束的能量为80MeV/u、传能线密度为31keV/μm。

优选的，所述步骤(2)中，所述浓硫酸浸没的时间为3～5min。

优选的，所述浓硫酸浸没同时还伴随搅拌。

优选的，所述步骤(3)中，所述光照培养所需的光照为自然光照。

优选的，所述步骤(3)中，用于浸泡诱变后的构树种子的水，每2～4d更换一次。

优选的，所述步骤(3)中，所述播种方式为条播。

本发明取得的有益效果：

本发明提供了一种诱变的构树种子的诱导催芽方法，以碳离子束对构树种子进行辐照，得到辐照种子；所述碳离子束的辐照剂量为30～100Gy；以水或浓硫酸浸没辐照种子，洗净，得到诱变后的构树种子；将诱变后的构树种子以水浸泡，光照培养至构树种子露白，将露白的构树种子播种至栽培基质中，得到发芽的构树种子。本发明所述诱导催芽方法的诱变后构树种子发芽率可以达到6.5～10.0％，发芽的构树种子均生长正常。本发明所述方法诱变催芽得到的辐照构树种子，其发芽幼苗中叶片叶型变异参数全缘/缺刻1～1.14，即构树种子辐照后幼苗叶片表型发生明显变异。

本发明将碳离子束的辐照剂量控制在30～100Gy范围，既可以达到有效辐照诱变的目的，还可以降低碳离子束对于构树种子发芽率的影响，从而间接提高诱变后构树种子的发芽率。

构树种子种皮物理致密，种子吸水性透气性差，本发明利用浓硫酸对辐照后的构树种子进行处理能够增加种子的透气性和吸水性。

本发明以水浸泡与自然光照的结合进行催芽，能够缩短一定催芽时间。

附图说明

图1为实施例1中待处理的构树种子；

图2为实施例1中诱变后的构树种子以水浸泡并光照催芽时的照片；

图3为实施例1中播种后的构树种子出芽的照片；

图4为实施例1中出芽的构树种子移栽后的生长情况。

具体实施方式

本发明提供了一种诱变的构树种子的诱导催芽方法，包括以下步骤：

(1)以碳离子束对构树种子进行辐照，得到辐照种子；所述碳离子束的辐照剂量为30～100Gy；

(2)以水或浓硫酸浸没辐照种子，洗净，得到诱变后的构树种子；

(3)将诱变后的构树种子以水浸泡，光照培养至构树种子露白，将露白的构树种子播种至栽培基质中，得到发芽的构树种子。

本发明采用碳离子束对构树种子进行辐照诱变，本发明优选的采用碳离子束加速器提供高能¹²C离子束对构树种子进行辐照。在本发明中，所述碳离子束的辐照剂量为30～100Gy，更优选为50Gy。在本发明中，所述碳离子束的能量为80MeV/u、传能线密度为31keV/μm。在50Gy辐照剂量下能够获得最优的诱变效率，并且通过本发明所述诱导催芽方法的诱变构树种子发芽率可达到10.0％，有效地平衡了诱变需求以及诱变后构树种子发芽率的问题。

在本发明中，对于被辐照的构树种子没有特殊限定，采用本领域市售商品或自行剥离制备的即可。

本发明以碳离子束对构树种子进行辐照后得到辐照种子，以水或浓硫酸浸没得到的辐照种子，洗净，即得诱变后的构树种子。本发明以水或浓硫酸浸没辐照种子是为了增加种子的透气性和吸水性，为后续以水浸泡以及自然光照培养催化种子发芽提供条件，提高种子发芽率。

在本发明中，所述水或浓硫酸浸没同时优选的伴随搅拌；更优选的，所述搅拌速率为5～15r/min，更优选为10r/min。本发明对所用水或浓硫酸的量无特殊限定，能够浸没辐照种子即可。在本发明中，所述水或浓硫酸浸没时间优选为3～5min，更优选为4min。在本发明所述水或浓硫酸浸没时间范围内对构树种子的发芽率提升效果更佳。

浓硫酸浸没后，本发明优选的先弃去水或浓硫酸再对所得构树种子进行清洗，清洗至构树种子为褐色时即为洗净，得到诱变后的构树种子。

得到诱变后的构树种子后，本发明将诱变后的构树种子以水浸泡，光照培养至构树种子露白，将露白的构树种子播种至栽培基质中，得到发芽的构树种子。培养至构树种子露白需要30d左右；露白的构树种子播种15d左右时有少量构树种子发芽，再经过7d左右能够发芽的基本上均发芽出土。

本发明以清水浸泡构树种子的目的是为了使构树种子的种皮软化，促进构树种子发芽。本发明对用于浸泡构树种子的水的用量没有特殊限定，能够润湿或浸没构树种子即可；本发明优选的，每隔2～4d更换一次用于浸泡构树种子的水，更优选的间隔3d。

在本发明，所述光照培养所需的光照优选为自然光照，本发明采用自然光照培养基于自然光照状态下构树种子能够正常发芽，光照有利于构树种子发芽。

在本发明中，所述栽培基质优选为泥炭土。在本发明中，所述露白的构树种子播种方式优选为条播；本发明优选的，所述播种深度优选为1～3公分，更优选为2公分。在本发明中，所述露白的构树种子优选的播种在大棚中；本发明优选的，所述大棚温度控制在22～32℃，更优选为26℃；所述大棚湿度控制在65～75％，更优选为70％。种植大棚温度24-33℃，湿度在60～65％。

本发明提供的诱导催芽方法可以将碳离子束辐照后的诱变构树种子发芽率提升至6.5～10.0％，可以较短时间内获得诱变群体，为后续的构树诱变育种以及构树诱变群体研究提供基础条件。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将2000粒构树种子(如图1所示)装入直径15公分，厚度1.5公分培养皿中进行碳离子束辐照实验，该实验在中国科学院近代物理所进行，辐照时碳离子束处理的辐照剂量为50Gy，碳离子束的能量为80MeV/u、传能线密度为31keV/μm。

将5ml浓硫酸用移液器吸入到研钵中，再将步骤1中辐照后的构树种子倒进浓硫酸溶液中，同时研钵棒不停的搅拌，处理5分钟。再将研钵中浓硫酸废液用移液器吸出，构树种子倒入塑料筛中流水冲洗，冲洗至构树种子原本颜色褐色为准，得到诱变后的构树种子。

将冲洗干净的构树种子倒入塑料透光直径15公分，厚度1.5公分培养皿中进行催芽，用移液器吸入3毫升无菌水注入盛有构树种子培养皿中，盖好培养皿盖子，放在实验室自然光照条件下培养，每3天换水1次(如图2所示)。

30天后，培养皿中少量构树种子露白，未露白种子继续在培养基中催芽。

将露白的构树种子条播于大棚装有泥炭土基质育苗，播种深度约2公分。大棚温度为26℃，湿度为65％。

经过15天后，大棚内少量构树种子发芽出土(如图3所示)。

再经过7天后，大棚内构树种子发芽出土结束。统计发芽率并移栽。移栽基质为泥炭土:红壤土2:1(如图4所示)。

构树种子共发芽200粒，构树种子的发芽率为10.0％，即理论上构树种子的诱变率为10.0％。其中幼苗叶片叶型变异参数全缘/缺刻＝1.01。

实施例2

将2000粒构树种子装入培养皿中进行碳离子束辐照实验，该实验在中国科学院近代物理所进行，辐照时碳离子束处理的辐照剂量为100Gy，碳离子束的能量为80MeV/u、传能线密度为31keV/μm。

将5ml浓硫酸用移液器吸入到研钵中，再将步骤1中辐照后的构树种子倒进浓硫酸溶液中，同时研钵棒不停的搅拌，处理5分钟。再将研钵中浓硫酸废液用移液器吸出，构树种子倒入塑料筛中流水冲洗，冲洗至构树种子原本颜色褐色为准，得到诱变后的构树种子。

将冲洗干净的构树种子倒入塑料透光培养皿中进行催芽，用移液器吸入3毫升无菌水注入盛有构树种子培养皿中，盖好培养皿盖子，放在实验室自然光照条件下培养，每3天换水1次。

32天后，培养皿中少量构树种子露白。

将露白的构树种子条播于大棚装有泥炭土基质育苗，播种深度约2公分。大棚温度为28℃，湿度为32％。

经过20天后，大棚内少量构树种子发芽出土。

再经过8天后，大棚内构树种子发芽出土结束。统计发芽率并移栽。移栽基质为泥炭土:红壤土2:1。

构树种子共发芽130粒，构树种子的发芽率为6.5％，即理论上构树种子的诱变率为6.5％。其中幼苗叶片叶型变异参数全缘/缺刻＝1。

对比例1

以清水浸泡2000粒构树种子2h，弃去清水；将清水浸泡后的构树种子倒入塑料透光培养皿中进行催芽，用移液器吸入3毫升无菌水注入盛有构树种子培养皿中，盖好培养皿盖子，放在实验室自然光照条件下培养。每3天换水1次。

30天后，培养皿中少量构树种子露白。

将露白的构树种子条播于大棚装有泥炭土基质育苗，播种深度约2公分。大棚温度为26℃，湿度为65％。经过15天后，大棚内少量构树种子发芽出土。再经过7天后，大棚内构树种子发芽出土结束。统计发芽率并移栽。移栽基质为泥炭土:红壤土2:1。

构树种子共发芽300粒，即构树种子的发芽率为15％。

对比例2

将2000粒构树种子倒入塑料透光培养皿中进行催芽，用移液器吸入3毫升无菌水注入盛有构树种子培养皿中，盖好培养皿盖子，放在实验室自然光照条件下培养。每3天换水1次。

32天后，培养皿中少量构树种子露白。

将露白的构树种子条播于大棚装有泥炭土基质育苗，播种深度约2公分。大棚温度为28℃，湿度为70％。

经过18天后，大棚内少量构树种子发芽出土。

再经过10天后，大棚内构树种子发芽出土结束。统计发芽率并移栽。移栽基质为泥炭土:红壤土2:1。

构树种子共发芽400粒，即构树种子的发芽率为20％。

对比例3

除辐照剂量为200Gy外，其他操作均与实施例相同。

催芽30天后，少量构树种子露白；播种后15天大棚内少量构树种子发芽出土，7天后大棚内构树种子发芽出土结束。

构树种子共发芽53粒，构树种子的发芽率为2.65％，即理论上构树种子的诱变率为2.65％。其中幼苗叶片叶型变异参数全缘/缺刻＝1.14。

对比例4

除辐照剂量为400Gy外，其他操作均与实施例相同。

催芽30天后，少量构树种子露白；播种后15天大棚内少量构树种子发芽出土，7天后大棚内构树种子发芽出土结束。

构树种子共发芽2粒，构树种子的发芽率为0.10％，即理论上构树种子的诱变率为0.01％。其中幼苗叶片叶型变异参数全缘/缺刻＝1。

综合上述实施例和对比例可以看出，对比例1未对构树种子进行辐照诱变，其种子发芽率为15％；对比例2未对构树种子进行碳离子束处理但进行了浓硫酸浸没，其种子发芽率为20％。表明本发明采用浓硫酸对构树种子进行处理能够提高其发芽率。

对比例3和对比例4分别采用200Gy、400Gy的碳离子束进行辐照，构树种子的发芽率分别为2.65％和0.10％，这是由于对比例3和对比例4采用的碳离子束辐照剂量过高，对构树种子造成了严重的生物损伤，从而无法大量获得构树种子诱变变异群体。

本发明实施例1和实施例2的方案能够将经过碳离子束辐照的构树种子发芽率控制在6.5～10.0％，既能够满足辐照变异的需要，又能够提供较多的诱变变异株，幼苗叶片叶型变异参数全缘/缺刻＝1～1.14。为今后对构树种子诱变育种以及构树种子碳离子束诱变变异群体提供基础。

同时，由实施例1、2还可以看出，采用本发明所述诱导催芽方法得到的构树发芽苗生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种构树种子的诱导催芽方法，包括以下步骤：

(1)以碳离子束对构树种子进行辐照，得到辐照种子；所述碳离子束的辐照剂量为30～100Gy；

(2)以水或浓硫酸浸没辐照种子，洗净，得到诱变后的构树种子；

(3)将诱变后的构树种子以水浸泡，光照培养至构树种子露白，将露白的构树种子播种至栽培基质中，得到发芽的构树种子。

2.根据权利要求1所述诱导催芽方法，其特征在于，所述步骤(1)中，碳离子束的辐照剂量为50Gy。

3.根据权利要求1或2所述诱导催芽方法，其特征在于，所述步骤(1)中，碳离子束的能量为80MeV/u、传能线密度为31keV/μm。

4.根据权利要求1所述诱导催芽方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述浓硫酸浸没的时间为3～5min。

5.根据权利要求1或4所述诱导催芽方法，其特征在于，所述浓硫酸浸没同时还伴随搅拌。

6.根据权利要求1所述诱导催芽方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述光照培养所需的光照为自然光照。

7.根据权利要求1或6所述诱导催芽方法，其特征在于，所述步骤(3)中，用于浸泡诱变后的构树种子的水，每2～4d更换一次。

8.根据权利要求1所述诱导催芽方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述播种方式为条播。