CN109116015B - 一种免封闭elisa酶标板的制作方法及使用方法 - Google Patents

一种免封闭elisa酶标板的制作方法及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种免封闭ELISA酶标板的制作方法，包括以下步骤：步骤一、将浓度为0.1mg/mL～5mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液分别加入酶标板的实验孔中，浸泡，弃去残液，使用去离子水清洗；步骤二、将浓度为10μg/mL～40μg/mL的柠檬酸钠胶体金溶液加入步骤一中的酶标板的实验孔中，浸泡，弃去残液，使用去离子水清洗，制得聚乙烯亚胺‑金纳米颗粒修饰的酶标板；步骤三、将步骤二中所得酶标板进行干燥、密封封装，即得成品酶标板。本发明可以省去用户在进行ELISA过程中的封闭步骤，在不影响检测灵敏度和特异性的前提下缩短了蛋白质检测时间。

Description

一种免封闭ELISA酶标板的制作方法及使用方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，涉及一种免封闭ELISA酶标板的制作方法及使用方法。
背景技术
酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)是一种基于抗原抗体特异性相互作用的检测反应。利用ELISA检测靶标主要是通过双抗体夹心法或双抗原夹心法进行，主要包括以下步骤：(1)在固相基底(酶标板)上固定捕获抗体或抗原；(2)使用牛血清白蛋白溶液或脱脂奶粉溶液等进行封闭；(3)抗体或抗原孵育反应；(4)酶标二抗孵育反应；(5)通过检测抗体上标记的酶分子催化底物显色、发光或产气测定靶标浓度。其中，上述步骤(2)是必不可少的，因为不做封闭，会导致后续酶标二抗的非特异性吸附，即没有待检测的抗原或抗体的样品也会有信号，噪声高，影响检测的灵敏度。但是，封闭这一步通常需要耗费用户近两个小时，步骤繁琐，耗时长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种免封闭ELISA酶标板的制作方法及使用方法，可以省去用户在进行ELISA过程中的封闭步骤，在不影响检测灵敏度和特异性的前提下缩短了蛋白质检测时间。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种免封闭ELISA酶标板的制作方法，包括以下步骤：
步骤一、将浓度为0.1mg/mL～5mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液分别加入酶标板的实验孔中，浸泡，弃去残液，使用去离子水清洗；
步骤二、将浓度为10μg/mL～40μg/mL的柠檬酸钠胶体金溶液加入步骤一中的酶标板的实验孔中，浸泡，弃去残液，使用去离子水清洗，制得聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的酶标板；
步骤三、将步骤二中所得酶标板进行干燥、密封封装，即得成品酶标板。
作为优选方式，步骤一中，所述聚乙烯亚胺水溶液的溶度为2.5mg/mL。
作为优选方式，步骤二中，所述柠檬酸钠胶体金溶液的溶度为25μg/mL。
作为优选方式，所述柠檬酸钠胶体金溶液是向煮沸的柠檬酸三钠溶液中加入氯金酸反应制得。
本发明还提供一种免封闭ELISA酶标板的使用方法，包括以下步骤：
步骤一、取用经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰后的酶标板。
步骤二、取相应包被抗体分别加入至步骤一中所述酶标板的实验孔中，恒温静置；向所述酶标板的实验孔中分别加入包被缓冲液，将实验孔表层的包被抗体溶解在包被缓冲液中；步骤三、弃去步骤二实验孔中所述的上层溶液，使用PBST清洗实验孔中的下层剩余物质；再向实验孔中加入已知浓度标准品与酶标二抗的混合液和待测样品与酶标二抗的混合液，37℃恒温静置1h。
步骤四、弃去步骤三酶标板的实验孔中所述的上层溶液，使用PBST清洗酶标板的实验孔中下层剩余物质；再向酶标板中的实验孔加入TMB显色液，37℃恒温静置0.5h后，观察显示结果，并检测样品在620nm处吸光度值。
本发明涉及一种免封闭ELISA酶标板的制作方法及使用方法，与现有设计相比，其优点在于：本发明酶标板的实验孔内修饰有聚乙烯亚胺-金纳米颗粒，用户使用上述成品板进行ELISA操作时，由于酶标二抗在PBS缓冲环境中所带电荷不利于其在修饰后的酶标板的表面吸附，相当于聚乙烯亚胺-金纳米颗粒表层对酶标二抗起到了封闭作用，即在没有封闭的前提下，酶标二抗的特异性信号不受影响，同时没有非特异信号；而当体系中存在抗原时，形成抗原-酶标二抗复合物，该复合物可以特异地识别板上的包被抗体，进而连在板上，即在没有封闭步骤的前提下，并不影响检测灵敏度与最低检测限，因此大大节省了用户在使用时的时间，操作更加简便，精度可靠。
附图说明
图1为本发明经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰酶标板修饰后的酶标板与常规未经修饰的酶标板对比示意图。
图2为本发明实施例6不同浓度抗原使用聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的酶标板进行免封闭ELISA检测的结果示意图。
图3为本发明实施例7酶标二抗在经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的酶标板与常规未经修饰的酶标板的表面吸附效果对比示意图。
图4为本发明对比例1不同浓度抗原使用未经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的常规酶标板进行ELISA检测的结果示意图。
图5为本发明对比例2不同浓度抗原使用未经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的常规酶标板进行免封闭ELISA检测的结果示意图。
图6为本发明经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰酶标板修饰后的酶标板与常规未经修饰的酶标板进行免封闭ELISA检测的结果对比示意图。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。
实施例1
本具体实施例1提供一种免封闭ELISA酶标板的制作方法，本发明中酶标板使用96孔板，步骤如下：
步骤一、制备柠檬酸钠胶体金溶液；将用于合成柠檬酸钠胶体金的圆底烧瓶用王水浸泡24h，使用去离子水洗净备用。向上述圆底烧瓶内加入1000mL去离子水、12mL 0.01g/mL柠檬酸三钠溶液，煮沸；然后加入10mL0.01g/mL氯金酸，继续煮沸15min后，自然冷却，即制得浓度为40μg/mL的柠檬酸钠胶体金溶液，将其放置于4℃的冷藏室内备用。
步骤二、将100μL浓度为5mg/mL的PEI(聚乙烯亚胺)水溶液分别加入96孔板(未做封闭的普通酶标板)的实验孔中，浸泡2h，弃去残液，使用去离子水清洗三遍。
步骤三、将100μL步骤一中所述的柠檬酸钠胶体金溶液加入步骤二中的96孔板的实验孔中，浸泡0.5h，弃去残液，使用去离子水清洗三遍，即得聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的酶标板。
步骤四、将步骤三中所得酶标板在37℃下进行干燥，密封封装，即得成品酶标板。
如图1所示，经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的酶标板略显红色。
实施例2
本具体实施例2与实施例1基本相同，所不同的是，步骤二中PEI水溶液的浓度为0.1mg/mL。
实施例3
本具体实施例3与实施例1基本相同，所不同的是，步骤三中柠檬酸钠胶体金溶液的浓度为10μg/mL。
实施例4
本具体实施例4与实施例1基本相同，所不同的是，步骤二中PEI水溶液的浓度为0.1mg/mL，步骤三中柠檬酸钠胶体金溶液的浓度为10μg/mL。
实施例5
本具体实施例5与实施例1基本相同，所不同的是，步骤二中PEI水溶液的浓度为2.5mg/mL，步骤三中柠檬酸钠胶体金溶液的浓度为25μg/mL。
实施例6
本具体实施例6提供一种将聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰后的酶标板应用于ELISA，其中，在检测过程中省去封闭步骤，本具体实施例以双抗体夹心检测癌胚抗原CEA为例，包括以下步骤：
步骤一、取用实施例1-5中任一经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰后的96孔酶标板成品。
步骤二、取100μL浓度为2μg/mL的癌胚抗原CEA包被抗体分别加入至步骤三中所述96孔板的8个实验孔中，4℃恒温静置过夜；向上述96孔板的8个实验孔中分别加入100μL包被缓冲液，将96孔板实验孔表层的包被抗体溶解在包被缓冲液中；具体地，包被缓冲液为pH值为9.6、浓度为0.05mol/L碳酸盐缓冲液。
步骤三、弃去步骤二96孔板的实验孔中所述的上层溶液，使用200μL PBST(加吐温的磷酸盐缓冲液)清洗两次实验孔中的下层剩余物质；再向96孔板的8个实验孔中依次加入50μL浓度为33ng/mL、16.5ng/mL、8.25ng/mL、4.13ng/mL、2.06ng/mL、1.03ng/mL、0.52ng/mL、0ng/mL的CEA和50μL HRP酶标二抗的混合液，37℃恒温静置1h。此处的HRP酶标二抗是将其原液用PBS稀释5000倍后使用。
步骤四、弃去步骤三96孔板的实验孔中所述的上层溶液，使用200μL PBST(加吐温的磷酸盐缓冲液)清洗四次96孔板的实验孔中下层剩余物质；再向96孔板中的8个实验孔分别加入200μL TMB显色液，37℃恒温静置0.5h后，观察显示结果，如图2。然后将8个实验孔中的液体转移至干净的96孔板的对应的8个实验孔中(避免实施例1中96孔板本身的显色对吸光度检测的影响)，并且利用酶标仪测定8个样品在620nm处吸光度值，结果见图2。
如图2所示，在PEI-金纳米颗粒修饰的96孔板中敷包被抗体，加入抗原和酶标二抗的混合液后，形成抗原-酶标抗体复合物，与96孔板上的包被抗体发生免疫反应，显色信号随着抗原浓度降低而递减，PEI-金纳米颗粒修饰的96孔板并不影响包被抗体的吸附，后续反应依然是抗原抗体的特异性反应，因此灵敏度和特异性未受影响。
实施例7
本具体实施例7验证酶标二抗在聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的96孔板表面吸附效果。
I组：向未经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的96孔板的实验孔内，直接加酶标二抗(原液使用PBS稀释5000倍使用)37℃孵育1h，清洗后加TMB显色液，显色结果见图3；
II组：向经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的96孔板的实验孔内，直接加酶标二抗(原液使用PBS稀释5000倍使用)37℃孵育1h，清洗后加TMB显色液，显色结果见图3。
如图3所示，I组中4个实验孔均显蓝色，表示酶标二抗可以吸附在未经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的96孔板的实验孔表面；II组中4个实验孔均无色，表示酶标二抗不能吸附在经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰修饰的96孔板的实验孔表面，即没有非特异信号。
对比例1
本具体实施例提供一种常规ELISA过程，本具体实施例描述的ELISA是以双抗体夹心检测癌胚抗原(下文简称CEA)为例，包括以下步骤：
步骤一、准备市购常规的96孔板。
步骤二、取100μL 2μg/mL的包被抗体分别加入至步骤一所述96孔板的8个实验孔中，4℃恒温静置过夜，包被抗体溶解在包被缓冲液中，具体地，包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液。
步骤三、弃去步骤二中所述96孔板实验孔的上层溶液，向96孔板中的每个实验孔分别加入200μL 5wt％的牛血清白蛋白(简称BSA)溶液，孵育2h。
步骤四、弃去步骤三96孔板的实验孔中所述的上层溶液，使用200μL PBST(加吐温的磷酸盐缓冲液)清洗两次实验孔中的下层剩余物质；再向96孔板的8个实验孔中依次加入50μL浓度为33ng/mL、16.5ng/mL、8.25ng/mL、4.13ng/mL、2.06ng/mL、1.03ng/mL、0.52ng/mL、0ng/mL的CEA和50μL HRP酶标二抗的混合液，37℃恒温静置1h。此处的HRP酶标二抗是将其原液用PBS稀释5000倍后使用。
步骤五、弃去步骤四96孔板的实验孔中所述的上层溶液，使用200μL PBST(加吐温的磷酸盐缓冲液)清洗四次96孔板的实验孔中下层剩余物质；再向96孔板中的8个实验孔分别加入200μL TMB显色液，37℃恒温静置0.5h后，将8个实验孔中的液体转移至干净的96孔板的对应的8个实验孔中，观察显色，并利用酶标仪测定8个样品在620nm处吸光度值。
如图4所示，可以看出使用常规试剂盒进行ELISA过程，无抗原的孔显无色。即保留封闭步骤后，酶标二抗没有非特异性吸附，也不影响检测的灵敏度。
对比例2
本具体实施例提供一种常规ELISA过程，但是省去了BSA封闭过程，本具体实施例描述的ELISA是以双抗体夹心检测癌胚抗原(下文简称CEA)为例，包括以下步骤：
步骤一、准备市购常规的96孔板。
步骤二、取100μL 2μg/mL的包被抗体分别加入至步骤一所述96孔板的8个实验孔中，4℃恒温静置过夜，包被抗体溶解在包被缓冲液中，具体地，包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液。
步骤三、弃去步骤三96孔板的实验孔中所述的上层溶液，使用200μL PBST(加吐温的磷酸盐缓冲液)清洗两次实验孔中的下层剩余物质；再向96孔板的8个实验孔中依次加入50μL浓度为33ng/mL、16.5ng/mL、8.25ng/mL、4.13ng/mL、2.06ng/mL、1.03ng/mL、0.52ng/mL、0ng/mL的CEA和50μL HRP酶标二抗的混合液，37℃恒温静置1h。此处的HRP酶标二抗是将其原液用PBS稀释5000倍后使用。
步骤四、弃去步骤四96孔板的实验孔中所述的上层溶液，使用200μL PBST(加吐温的磷酸盐缓冲液)清洗四次96孔板的实验孔中下层剩余物质；再向96孔板中的8个实验孔分别加入200μL TMB显色液，37℃恒温静置0.5h后，将8个实验孔中的液体转移至干净的96孔板的对应的8个实验孔中，利用酶标仪测定8个样品在620nm处吸光度值。
如图5-6所示，可以看出不处理96孔板，不做BSA封闭，无抗原的孔也显淡蓝色，说明有酶标二抗的非特异吸附，即没有待检测的抗原或抗体的样品也会有信号，噪声高，影响检测的灵敏度。
如图5-6所示的由线性曲线看出，不做BSA封闭的酶标板进行ELISA过程，对线性曲线的R2影响不大；但是，当CEA的浓度为0，即没有抗原时，但还是出现了和有抗原差不多的信号，与几个低浓度的点几乎重合，即影响了抗原的最低检测限。

Claims (5)

1.一种免封闭ELISA酶标板的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将浓度为0.1mg/mL～5mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液分别加入酶标板的实验孔中，浸泡，弃去残液，使用去离子水清洗；所述酶标板是未做封闭的普通酶标板；
步骤二、将浓度为10μg/mL～40μg/mL的柠檬酸钠胶体金溶液加入步骤一中的酶标板的实验孔中，浸泡，弃去残液，使用去离子水清洗，制得聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰的酶标板；
步骤三、将步骤二中所得酶标板进行干燥、密封封装，即得成品酶标板。
2.根据权利要求1所述的一种免封闭ELISA酶标板的制作方法，其特征在于：步骤一中，所述聚乙烯亚胺水溶液的溶度为2.5mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种免封闭ELISA酶标板的制作方法，其特征在于：步骤二中，所述柠檬酸钠胶体金溶液的溶度为25μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种免封闭ELISA酶标板的制作方法，其特征在于：所述柠檬酸钠胶体金溶液是向煮沸的柠檬酸三钠溶液中加入氯金酸反应制得。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法制作的酶标板的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、取用经聚乙烯亚胺-金纳米颗粒修饰后的酶标板；
步骤2、取相应包被抗体分别加入至步骤1中所述酶标板的实验孔中，恒温静置；向所述酶标板的实验孔中分别加入包被缓冲液，将实验孔表层的包被抗体溶解在包被缓冲液中；
步骤3、弃去步骤2实验孔中的上层溶液，使用PBST清洗实验孔中的下层剩余物质；再向实验孔中加入已知浓度标准品与酶标二抗的混合液和待测样品与酶标二抗的混合液，37℃恒温静置1h；
步骤4、弃去步骤3酶标板的实验孔中的上层溶液，使用PBST清洗酶标板的实验孔中下层剩余物质；再向酶标板中的实验孔加入TMB显色液，37℃恒温静置0.5h后，观察显示结果，并检测样品在620nm处吸光度值。
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