CN109089877A - 一种利用ems诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于芸豆育种技术领域，具体涉及一种利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法。包括种子消毒处理、萌芽处理、诱变处理和田间种植，其中，萌芽处理步骤为：将无菌种子平铺放置在萌发基质内，并使萌发基质液面低于无菌种子上表面，使无菌种子萌发，待长出1～2个幼叶后，获得萌芽植物体；其中诱变处理步骤为：向每千克萌发基质添加EMS溶液，用EMS溶液诱变萌芽植物体，然后取出萌芽植物体，置于MS液体培养基中光周期培养5～7天，接着向每千克MS液体培养基中添加EMS溶液，用EMS继续诱变萌芽植物体，获得诱变处理植物体M0。本发明的方法为红芸豆专用高效诱变方法，提高诱变效率，减少EMS等致癌物的用量，减少对育种工作者的健康威胁。
Description
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法。
背景技术
诱变手段是植物育种较常用的手段之一，包括(1)物理诱变，如射线、激光微束、离子束、微波、超声波、热力等方法引起植物体内产生可遗传的变异。它主要是通过这些离子束对植物体内的DNA进行作用，使得DNA发生片段丢失、异位、倒位等；(2)化学诱变，是利用化学诱变剂处理植物材料。化学诱变剂的种类很多，如烷化剂、亚硝基化合物、叠氮化合物、碱基类似物、抗生素、轻胺等。目前，在这些化学诱变剂中，研究和应用最为广泛的主要是烷化剂，主要有、EMS、NaN3、DES和甲基亚MNU等。这些烷化剂的诱变作用主要是通过自身带有的一个或多个不稳定的烷基置换DNA分子上的氢原子，改变基因的分子结构，从而造成基因突变。这种置换主要发生在碱基的Nl、N3、N7位置上。目前，在植物突变体创建中，应用最多的烷化剂是EMS。
EMS诱变过程主要通过两个步骤来完成：首先鸟嘌呤的氧原子位置被烷基化；然后在DNA复制过程中，烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基替换，即G:C变为A:T。EMS的诱变效应可用“两高一广”来评价，即：效率高、频率高、范围广。EMS化学诱变产生点突变的频率较高，而染色体畸变相对较少，可以对作物的某一种特殊性状进行改良。此外它可以产生范围较广的突变类型，如:转换、颠换等。
芸豆学名菜豆，小扁豆学名兵豆，二者都是可食用的豆科植物，含有丰富的蛋白质和碳水化合物等，可为人体补充丰富的营养物质。随着这两种植物需求量的增高和质量品质要求的提高，需要对其进行不断改进，育出更符合要求的植物新品种。虽然上述EMS化学诱变方法具有产生点突变频率较高、染色体畸变较少、可以产生范围较广突变类型的优点。但是，由于不同植物有不同的生长习惯，其表型不仅受到基因型的影响，也受到环境的影响，比如一些芸豆属于短日照植物，一些小扁豆属于长日照植物，如果将改变环境的日照条件，那么其表型也会产生变化。所以单纯靠EMS诱变剂的化学诱变因素对芸豆和小扁豆进行诱变，无法模拟环境因素的影响。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供的一种利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，将EMS诱变剂与环境因素的影响相结合，提高了诱变效率。
本发明的第一个目的是提供一种利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，包括以下步骤：
S1，植物种子浸泡于水中6～12h，取出后进行消毒处理，得到无菌种子；
所述植物种子为芸豆种子或者小扁豆种子；
S2，萌芽处理
将无菌种子平铺放置在萌发基质内，并使萌发基质液面低于无菌种子上表面，使无菌种子萌发，待长出1～2个幼叶后，获得萌芽植物体；所述萌发基质按照以下方法制备而成：将MS固体培养基、无菌水、改性秸秆粉按照3～4：1000：20～30的质量比例混和，并使MS固体培养基充分溶解；所述改性秸秆粉是将秸秆粉碎成秸秆段，然后浸泡于氯化钙溶液中，最后烘干并粉碎成粉末后得到的；
S3，诱变处理
向每千克萌发基质添加EMS溶液30～50ml，用EMS溶液诱变萌芽植物体，然后取出萌芽植物体，置于MS液体培养基中光周期培养5～7天，接着向每千克MS液体培养基中添加EMS溶液50～100ml，用EMS继续诱变萌芽植物体，获得诱变处理植物体M0；
S4，田间种植
(1)移栽诱变处理植物体M0至田间，筛选出性状发生突变的单株，收获M1代种子；
(2)分别田间种植M1代种子和未经诱变的种子，田间观察植株性状，筛选出与未经诱变的种子性状不同的突变株，得M2代种子；
(3)重复(2)的步骤，直至获得具有稳定突变性状的M6代植物种子，即筛选出性状稳定的芸豆或小扁豆突变体。
优选的，上述利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，S2中，所述改性秸秆粉的具体制备方法如下：将秸秆粉碎成3～5cm的秸秆段，然后浸泡于质量分数8％的氯化钙溶液中24h，取出后100℃烘干，最后粉碎成粉末，得到改性秸秆粉。
优选的，上述利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，S2中，粉碎成的粉末的粒径为80～100目。
优选的，上述利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，S2中，幼叶的长度为2～5mm。
优选的，上述利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，S3中，光周期培养的条件为光照时间10h/d，光强1500～2000lx。
优选的，上述利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，S3中EMS溶液的体积分数为0.01～0.05％。
优选的，上述利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，S3中用EMS溶液浸泡20～30min诱变萌芽植物体。
与现有技术相比，本发明提供的利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，具有以下有益效果：
本发明是将EMS诱变与光周期环境条件培养相结合，开发了新的诱变方式。直接以萌芽植物体进行EMS诱变可出现较多的表型突变植株，有利于新品种的筛选；利用光周期照射刺激植物生长，提高突变体的成活率；在MS培养基中添加了改性秸秆粉，提高了诱变植株的成活率较。
改性秸秆粉的作用有以下几点：第一，1～2天内秸秆粉的不溶物质可部分漂浮在液体表面减少培养基水分的蒸发，减少人工向培养基补水的次数；第二，由于长时间的浸泡(3～7天)，部分改性秸秆粉可沉降在液体内，为植物根系提供了附着力，促使根系快速生长，从而可有根系为植物体的生长补充营养；第三，秸秆粉颗粒之间的间隙较大，不影响液体的流动以及离子的移动。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。本发明下述实施例中采用的MS固体培养基为不含琼脂和蔗糖的粉末状培养基，下述实施例中所用的MS液体培养基时将市售不含琼脂和蔗糖的粉末状MS固体培养基按照使用说明溶于水后得到的，与常规MS液体培养基的配方和制备方法相同；其他各种试剂也为市售。
本发明提供的一种利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，具体包括以下步骤：
S1，植物种子浸泡于水中6～12h，取出后进行消毒处理，得到无菌种子；
所述植物种子为芸豆种子或者小扁豆种子；
S2，萌芽处理
将无菌种子平铺放置在萌发基质内，并使萌发基质液面低于无菌种子上表面，放入人工气候箱中使无菌种子萌发，待长出1～2个幼叶后，获得萌芽植物体；所述萌发基质按照以下方法制备而成：将MS固体培养基、无菌水、改性秸秆粉按照3～4：1000：20～30的质量比例混和，并使MS固体培养基充分溶解，允许改性秸秆粉漂浮在萌发基质表面；所述改性秸秆粉是将秸秆粉碎成秸秆段，然后浸泡于氯化钙溶液中，最后烘干并粉碎成粉末后得到的；
S3，诱变处理
向每千克萌发基质添加EMS溶液30～50ml，用EMS溶液诱变萌芽植物体，然后取出萌芽植物体，置于MS液体培养基中光周期培养5～7天，接着向每千克MS液体培养基中添加EMS溶液50～100ml，用EMS继续诱变萌芽植物体，获得诱变处理植物体M0；
S4，田间种植
(1)移栽诱变处理植物体M0至田间，筛选出性状发生突变的单株，收获M1代种子；
(2)分别田间种植M1代种子和未经诱变的种子，田间观察植株性状，筛选出与未经诱变的种子性状不同的突变株，得M2代种子；
(3)重复(2)的步骤，直至获得具有稳定突变性状的M6代植物种子，即筛选出性状稳定的芸豆或小扁豆突变体。
优选的，本发明提供的一种利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，包括以下实施例。
实施例1
一种利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，包括以下步骤：
S1，植物种子浸泡于水中12h，取出后进行消毒处理，得到无菌种子；所述植物种子为芸豆种子；具体步骤如下：
选择色彩一致、籽粒饱满、无虫蛀的红芸豆种子浸泡于水中12h，取出后放入0.1g/100ml的HgCl2溶液浸泡消毒6min，然后用无菌水冲洗干净，用滤纸吸干种子表面水分，得到无菌种子；
S2，萌芽处理
将无菌种子平铺放置在萌发基质内，并使萌发基质液面低于无菌种子上表面2mm，放入人工气候箱中使无菌种子萌发，待长出1个幼叶后，幼叶的长度为2mm获得萌芽植物体；所述萌发基质按照以下方法制备而成：将MS固体培养基、无菌水、改性秸秆粉按照3：1000：20的质量比例混和，并使MS固体培养基充分溶解，允许改性秸秆粉漂浮在萌发基质表面；所述改性秸秆粉是将秸秆粉碎成秸秆段，然后浸泡于氯化钙溶液中，最后烘干并粉碎成粉末后得到的；所述改性秸秆粉的具体制备方法如下：将秸秆粉碎成3～5cm的秸秆段，然后浸泡于质量分数8％的氯化钙溶液中24h，取出后100℃烘干，最后粉碎成80目粉末，得到改性秸秆粉；
S3，诱变处理
向每千克萌发基质添加体积分数为0.01％EMS溶液50ml，用EMS溶液浸泡30min诱变萌芽植物体，然后取出萌芽植物体，置于MS液体培养基中光周期培养7天，接着向每千克MS液体培养基中添加体积分数为0.01％EMS溶液100ml，用EMS继续浸泡30min诱变萌芽植物体，获得诱变处理植物体M0；其中，光周期培养的条件为光照时间10h/d，光强2000lx，其余时间为避光暗培养；
S4，田间种植
(1)移栽诱变处理植物体M0至田间，筛选出性状发生突变的单株，收获M1代种子；
(2)分别田间种植M1代种子和未经诱变的种子，田间观察植株性状，筛选出与未经诱变的种子性状不同的突变株，得M2代种子；
(3)重复(2)的步骤，直至获得具有稳定突变性状的M6代植物种子，即筛选出性状稳定的芸豆或小扁豆突变体。
实施例2
一种利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，包括以下步骤：
S1，植物种子浸泡于水中6h，取出后进行消毒处理，得到无菌种子；所述植物种子为芸豆种子；具体步骤如下：
选择色彩一致、籽粒饱满、无虫蛀的红芸豆种子浸泡于水中12h，取出后放入0.1g/100ml的HgCl2溶液浸泡消毒6min，然后用无菌水冲洗干净，用滤纸吸干种子表面水分，得到无菌种子；
S2，萌芽处理
将无菌种子平铺放置在萌发基质内，并使萌发基质液面低于无菌种子上表面1mm，放入人工气候箱中使无菌种子萌发，待长出2个幼叶后，幼叶的长度为5mm获得萌芽植物体；所述萌发基质按照以下方法制备而成：将MS固体培养基、无菌水、改性秸秆粉按照4：1000：30的质量比例混和，并使MS固体培养基充分溶解，允许改性秸秆粉漂浮在萌发基质表面；所述改性秸秆粉是将秸秆粉碎成秸秆段，然后浸泡于氯化钙溶液中，最后烘干并粉碎成粉末后得到的；所述改性秸秆粉的具体制备方法如下：将秸秆粉碎成3～5cm的秸秆段，然后浸泡于质量分数8％的氯化钙溶液中24h，取出后100℃烘干，最后粉碎成100目粉末，得到改性秸秆粉；
S3，诱变处理
向每千克萌发基质添加体积分数为0.05％EMS溶液30ml，用EMS溶液浸泡20min诱变萌芽植物体，然后取出萌芽植物体，置于MS液体培养基中光周期培养5天，接着向每千克MS液体培养基中添加体积分数为0.05％EMS溶液50ml，用EMS继续浸泡20min诱变萌芽植物体，获得诱变处理植物体M0；其中，光周期培养的条件为光照时间10h/d，光强2000lx，其余时间为避光暗培养；
S4，田间种植
该步骤同实施例1。
实施例3
一种利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，包括以下步骤：
S1，植物种子浸泡于水中12h，取出后进行消毒处理，得到无菌种子；所述植物种子为小扁豆种子；具体步骤如下：
选择色彩一致、籽粒饱满、无虫蛀的小扁豆种子浸泡于水中12h，取出后放入0.1g/100ml的HgCl2溶液浸泡消毒6min，然后用无菌水冲洗干净，用滤纸吸干种子表面水分，得到无菌种子；
S2，萌芽处理
将无菌种子平铺放置在萌发基质内，并使萌发基质液面低于无菌种子上表面，放入人工气候箱中使无菌种子萌发，待长出2个幼叶后，幼叶的长度为4mm获得萌芽植物体；所述萌发基质按照以下方法制备而成：将MS固体培养基、无菌水、改性秸秆粉按照3：1000：20的质量比例混和，并使MS固体培养基充分溶解，允许改性秸秆粉漂浮在萌发基质表面；所述改性秸秆粉是将秸秆粉碎成秸秆段，然后浸泡于氯化钙溶液中，最后烘干并粉碎成粉末后得到的；所述改性秸秆粉的具体制备方法如下：将秸秆粉碎成3～5cm的秸秆段，然后浸泡于质量分数8％的氯化钙溶液中24h，取出后100℃烘干，最后粉碎成80目粉末，得到改性秸秆粉；
S3，诱变处理
向每千克萌发基质添加体积分数为0.03％EMS溶液40ml，用EMS溶液浸泡25min诱变萌芽植物体，然后取出萌芽植物体，置于MS液体培养基中光周期培养7天，接着向每千克MS液体培养基中添加体积分数为0.03％EMS溶液75ml，用EMS继续浸泡20min诱变萌芽植物体，获得诱变处理植物体M0；其中，光周期培养的条件为光照时间10h/d，光强1500lx，其余时间为避光暗培养；
S4，田间种植
该步骤同实施例1。
对比例1
一种利用EMS诱变产生芸豆突变体的方法，与实施例1的操作步骤基本相同，区别在于：没有S2步骤，S3步骤改为，用体积分数为0.01％EMS溶液浸泡无菌种子30min诱变无菌种子，然后取出无菌种子，置于MS液体培养基中光周期培养7天，接着向每千克MS液体培养基中添加体积分数为0.01％EMS溶液100ml，用EMS继续浸泡30min无菌种子，获得诱变处理植物体M0；其中，光周期培养的条件为光照时间10h/d，光强2000lx，其余时间为避光暗培养。
对比例2
一种利用EMS诱变产生芸豆突变体的方法，与实施例1的操作步骤基本相同，区别在于：S3步骤改为，向每千克萌发基质添加体积分数为0.01％EMS溶液50ml，用EMS溶液浸泡30min诱变萌芽植物体，然后取出萌芽植物体，置于MS液体培养基中避光培养7天，接着向每千克MS液体培养基中添加体积分数为0.01％EMS溶液100ml，用EMS继续浸泡30min诱变萌芽植物体，获得诱变处理植物体M0。
对比例3
一种利用EMS诱变产生芸豆突变体的方法，与实施例1的操作步骤基本相同，区别在于：S2步骤改为，将无菌种子平铺放置在MS液体培养基内，并使MS液体培养基液面低于无菌种子上表面2mm，放入人工气候箱中使无菌种子萌发，待长出1个幼叶后，幼叶的长度为2mm获得萌芽植物体。
下面以实施例1～3和对比例1～2为例，说明本发明方法的突变效果。
各实施例和对比例1分别取红芸豆种子200粒和小扁豆种子200粒进行试验，计算诱变处理植物体M0的成活率和畸变率。
其中成活率是指，种植诱变处理植物体M0后可生长至结实的植物体数量/种子总数量×100％；
畸变率种植诱变处理植物体M0后可产生表型畸变的植物体数量/种子总数量×100％；表型畸变包括长势弱、斑点叶等与正常植株表型不同的植株。
表1不同实施例的种子萌发、畸变率统计结果
传统的EMS诱变处理方式是直接将无菌种子浸泡于EMS溶液中，或者结合紫外线照射等诱变处理步骤，这种方式忽略了光环境变化为种子生长的影响，本发明是将EMS诱变与光周期环境条件培养相结合，开发了新的诱变方式。
表1结果显示，各组处理方法中的数据有差异。对比例1的设置是为了比较将种子萌发后再进行诱变处理和直接将种子进行诱变处理的区别，结果显示，实施例1～3畸变率显著高于对比例1，说明直接以萌芽植物体进行EMS诱变可出现较多的表型突变植株，有利于新品种的筛选。
对比例2的设置是为了额验证环境因素(光照变化)对诱变效果的影响，比较实施例1～3和对比例2的数据，我们可以发现，是否采用光周期培养，也会影响到畸变率和成活率，由于种子以萌芽，本发明利用光周期照射刺激植物生长，提高突变体的成活率。
对比例3的设置是为了证明不同的萌发基质对EMS诱变的影响，结果可知，单纯以MS液体培养基作为萌发基质虽然可以为种子萌发提供一定的营养，但是由于后续步骤有EMS的诱变处理，EMS一定程度的可抑制植物体的生长，甚至导致植物体死亡，本发明在MS培养基中添加了改性秸秆粉，故而成活率较高。改性秸秆粉的作用有以下几点：第一，1～2天内秸秆粉的不溶物质可部分漂浮在液体表面减少培养基水分的蒸发，减少人工向培养基补水的次数；第二，由于长时间的浸泡(3～7天)，部分改性秸秆粉可沉降在液体内，为植物根系提供了附着力，促使根系快速生长，从而可有根系为植物体的生长补充营养；第三，秸秆粉颗粒之间的间隙较大，不影响液体的流动以及离子的移动。
另外，我们还比较了普通秸秆粉和改性秸秆粉的效果差异，发现普通秸秆粉易漂浮的水面，5天内不易沉降，采用上述萌发基质进行萌发处理，5天内芸豆根系最长仅为3cm，而采用改性秸秆粉2天后有部分沉降，5天内芸豆根系最长可达为4cm。
需要说明的是，上述实施例中所用秸秆为玉米秸秆，但是本发明的方法不局限于玉米秸秆，也可改用小麦秸秆或者水稻秸秆。
需要说明的是，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例及效果，尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，植物种子浸泡于水中6～12h，取出后进行消毒处理，得到无菌种子；
所述植物种子为芸豆种子或者小扁豆种子；
S2，萌芽处理
将无菌种子平铺放置在萌发基质内，并使萌发基质液面低于无菌种子上表面，使无菌种子萌发，待长出1～2个幼叶后，获得萌芽植物体；所述萌发基质按照以下方法制备而成：将MS固体培养基、无菌水、改性秸秆粉按照3～4：1000：20～30的质量比例混和，并使MS固体培养基充分溶解；所述改性秸秆粉是将秸秆粉碎成秸秆段，然后浸泡于氯化钙溶液中，最后烘干并粉碎成粉末后得到的；
S3，诱变处理
向每千克萌发基质添加EMS溶液30～50ml，用EMS溶液诱变萌芽植物体，然后取出萌芽植物体，置于MS液体培养基中光周期培养5～7天，接着向每千克MS液体培养基中添加EMS溶液50～100ml，用EMS继续诱变萌芽植物体，获得诱变处理植物体M0；
S4，田间种植
(1)移栽诱变处理植物体M0至田间，筛选出性状发生突变的单株，收获M1代种子；
(2)分别田间种植M1代种子和未经诱变的种子，田间观察植株性状，筛选出与未经诱变的种子性状不同的突变株，得M2代种子；
(3)重复(2)的步骤，直至获得具有稳定突变性状的M6代植物种子，即筛选出性状稳定的芸豆或小扁豆突变体。
2.根据权利要求1所述的利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，其特征在于，S2中，所述改性秸秆粉的具体制备方法如下：将秸秆粉碎成3～5cm的秸秆段，然后浸泡于质量分数8％的氯化钙溶液中24h，取出后100℃烘干，最后粉碎成粉末，得到改性秸秆粉。
3.根据权利要求2所述的利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，其特征在于，S2中，粉碎成的粉末的粒径为80～100目。
4.根据权利要求1所述的利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，其特征在于，S2中，幼叶的长度为2～5mm。
5.根据权利要求2所述的利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，其特征在于，S3中，光周期培养的条件为光照时间10h/d，光强1500～2000lx。
6.根据权利要求5所述的利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，其特征在于，S3中EMS溶液的体积分数为0.01～0.05％。
7.根据权利要求6所述的利用EMS诱变产生芸豆或小扁豆突变体的方法，其特征在于，S3中用EMS溶液浸泡20～30min诱变萌芽植物体。
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