CN109061027B - Hptlc-生物显影筛检油脂合成酚类抗氧化剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及HPTLC‑生物显影筛检油脂合成酚类抗氧化剂的方法，属于食品检测技术领域。根据酚类抗氧化剂可以通过清除自由基反应改变反应体系颜色的特点，建立了一种基于抗氧化活性显色的分析方法，对待测样品进行衍生化反应，并利用HPTLC作为开放的色谱分离载体，再使用薄层色谱扫描仪进行扫描定量。本发明的方法检测周期短，准确性好，检测结果基本与HPLC检测结果一致。

Description

HPTLC-生物显影筛检油脂合成酚类抗氧化剂的方法
技术领域
本发明涉及HPTLC-生物显影筛检油脂合成酚类抗氧化剂的方法，属于食品检测技术领域。
背景技术
自由基链式反应引起的油脂氧化是导致富含油脂食品在加工、储藏和货架期品质劣变的主要原因之一。油脂氧化除了造成食品酸败和不良风味，还产生大量醛酮等反应副产物，对消费者的身体健康产生严重威胁。为了阻止或减缓油脂氧化，现代食品工业中大量天然/合成的抗氧化剂被添加到食品基质中。相比其它种类的抗氧化剂，合成酚类抗氧化剂因其高效的自由基清除能力和对极端温度/pH环境的耐受性而收到广泛的关注，拥有极其诱人的应用前景。然而，已经有毒理学实验证明该类抗氧化剂具有特殊的细胞毒性，随食品摄入人体后，可能对健康产生潜在的不良作用。因此，欧盟等国的食品安全监控机构已经通过立法限制合成酚类抗氧化剂在食品中的用量（添加限量为200mg/kg）。因此，研究一种快速同时定量测定食品中不同种类的合成酚类抗氧化剂显得尤为重要。
目前，油脂中合成酚类抗氧化剂常用检测方法为高效液相色谱-紫外吸收法，此方法样品的需要繁琐的样品前处理步骤，且检测时间，特别是极限校正和平衡较长；其次，紫外吸收检测模式的选择性不够，因为食品中很多内源基质物质也具有较强的紫外吸收特征，因此很容易得到假阳性结果；同时，传统的柱色谱分析方法检测通量低，测定过程只能逐一进行样品检测，不符合大批量样品筛检的要求。
高效薄层色谱以其方便快捷的操作方式和高通量著称。但是用高效薄层色谱分析合成酚类抗氧化剂目前存在很大问题。由于合成酚类抗氧化剂分子结构本身不含有可见光生色团，也没有荧光特性，因此，多采用紫外吸收模式对其色谱分离结果进行定量。但是紫外吸收模式测定灵敏度和特异性都较低，极易受到来自食品基质物质的干扰。所以，急需建立一种适用于高效薄层色谱的特异性生物效应衍生和定量分析技术，以实现不同合成酚类抗氧化剂色谱展开后的快速同时检测。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种基于高效薄层色谱-生物显影法筛检食用油脂中合成酚类抗氧化剂的方法。该方法并非传统的基于对目标物的物理化学特征(例如光谱、质谱特性)的检测，而是基于目标物的生物活性(抗氧化能力)，因此具有很强的选择性和基质耐受性。具体来说，是将待测样品在硅胶板上点样，用展开液展开，干燥，再将生物显影液涂布在展开后的硅胶板上，置于白光灯下照射12~15分钟进行成像。
在本发明的一种实施方式中，所述硅胶板为默克F254分析型预制板，涂层厚度0.2mm。
本发明的第二个目的是提供一种定量测定食用油脂中合成酚类抗氧化剂的方法，所述方法是将待测样品在硅胶板上点样，用展开液展开，干燥，再将生物显影液涂布在展开后的硅胶板上，置于白光灯下照射12~15分钟进行成像，再采用薄层扫描仪将生物显影后的硅胶板置于薄层扫描仪中进行定量，光源为氘灯和钨灯，采用荧光-反射模式，发射波长为530nm。
在本发明的一种实施方式中，所述展开液为甲苯/乙酸乙酯/甲醇混合溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述甲苯/乙酸乙酯/甲醇混合溶液是以5：2：3的体积比混合。
在本发明的一种实施方式中，所述合成酚类抗氧化剂包括BHT和/或TBHQ。
在本发明的一种实施方式中，所述生物显影液是含有生物显影物质的甲醇溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述生物显影液为2,2-联苯基-1-苦基肼基溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述生物显影溶液的浓度为1-40mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述生物显影溶液的浓度为25mg/mL。
本发明的第三个目的是提供一种快速定量筛检食用油脂中BHT和TBHQ的方法，所述方法是将色谱分离后的样品经过浸渍衍生进行生物效应显色处理，再经过薄层色谱扫描定量。
在本发明的一种实施方式中，所述薄层色谱的分离具体是：将2-8 μL样品点样，点样后用体积比为9:1:1的甲苯/乙酸乙酯/甲醇展开，上行展开至硅胶板的60mm高度处，取出后硅胶板置于50℃平板加热器上充分干燥3 min。
在本发明的一种实施方式，经生物显影溶液浸渍衍生后的样品置于白光灯下每隔3分钟拍照成像，15分钟后具有清晰黄白色条带的样品中含有BHT和TBHQ。针对检测到抗氧化活性斑点的阳性样品，使用光密度扫描仪，在荧光-反射模式，激发波长530nm，无遮光板的条件下进行定量分析。
在本发明的一种实施方式中，将经过分离、生物显影后所得的硅胶板置于薄层扫描仪中进行扫描定量，通过在每一块薄层板上制作标准曲线，计算样品BHT和TBHQ含量。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将待测样品先在薄层色谱上展开，再进行生物效应显色衍生，最后通过薄层色谱光密度扫描定量。
在本发明的一种实施方式中，所述待测样品包括大豆油和葵花籽油。
在本发明的一种实施方式中，所述食用油脂在点样前经过预处理；所述预处理是将食用油脂按照1g：10 mL甲醇的比例混合，涡旋混合器震荡3分钟，5000r/min离心，0.45微米膜过滤后进行色谱分离，浸渍衍生和光密度扫描。
本发明的有益效果：本发明建立了一种基于高效薄层色谱-生物显影法定量筛检油脂中合成酚类抗氧化剂方法，可实现单次实验同时检测多种样品，实现高通量筛检。单次筛检过程从样品准备到获得最终结果仅需1-2小时，同时筛检20个左右样品，检测限低于50mg/kg，远低于欧盟规定的200 mg/kg的添加标准；同时检测方法可实现重复性RSD<10%，此方法具有快速、准确、经济的优点；同时基于生物效应显色衍生方法的建立为平面高效薄层色谱分析开辟了新的视野。
附图说明
图1为生物显影液浸渍后不同反应时间显色效果对比图；
图2为生物显影液浸渍后光密度扫描参数优化；
图3为生物显影液浸渍后目标物BHT和TBHQ的光密度扫描信号；
图4为BHT和TBHQ标准溶液展开图；
图5为BHT和TBHQ薄层色谱扫描定量图；
图6为BHT和TBHQ的标准曲线；
图7为大豆油、葵花籽油萃取样品和标准品展开图；
图8为大豆油、葵花籽油的薄层扫描定量图。
具体实施方式
实施例1
（1）BHT和TBHQ标准液的制备：用甲醇为溶剂，用甲醇稀释制备浓度为0.01mg/mL的标准溶液；
（2）高效薄层色谱分离：将2-8ul标准溶液和食用油脂样品萃取液用Linomat 5进行非接触吹扫点样，点样完成后用展开液（甲苯/乙酸乙酯/甲醇，9/1/1, v/v/v）展开，上行展开60mm取出硅胶板置于50℃平板加热器上充分干燥3 min；
（3）特异性生物显影：将生物显影液通过浸渍的方式均匀涂布到展开后的硅胶板上，取出后放入薄层成像系统，置于白光灯的照射下每3分钟对硅胶板成像，连续监测不同反应时间对显影效果的影响。如图1所示，在最初的10 min内，薄层板表面颜色迅速从浅紫色变为深紫色；在15-20 min时段，背景区域的紫色逐渐变得明亮，与表现出抗氧化能力的目标物斑点(浅黄色)形成鲜明的对比；此后，随着时间的延长，颜色无明显变化。因此确定20分钟为最佳的反应时间。
（4）光密度扫描分析：通过测定背景物质的吸光谱（如图2）确定最佳的发射波长为530nm，为了避免形成倒峰，采用荧光-反射模式对展开轨道进行光密度扫描，得到具有良好信噪比的光密度信号（如图3）。
实施例2
（1）将分别含有0.01mg/ml BHT和0.01mg/ml TBHQ的标准溶液呈条带状（6mm）点在硅胶板上，形成50-200 ng/zone浓度梯度的5个校准点，做两个平行，然后将硅胶板用体积比为9/1/1的甲苯/乙酸乙酯/甲醇展开，烘干，浸渍到生物显影液中；
（2）薄层扫描仪扫描定量：将生物显影后的硅胶板置于薄层扫描仪中进行定量分析，选择光源为氘灯和钨灯，荧光-反射模式，发射波长为530nm，得到光密度扫描图如图5所示。扫描结束后，以扫描面积为y轴，目标物质量为x轴，制作标准曲线。结果如图6所示。
实施例3
（1）分别对大豆油和葵花籽油中的BHT和TBHQ进行同时检测。
食用油脂样品的预处理：所述食用油脂1g与10毫升甲醇混合，涡旋混合器震荡3分钟，5000rmp/分钟离心，0.45微米膜过滤后进行色谱分离，4℃中冷藏。
（2）采用0.5 MPa氮气为载体，用100μl注射器(CAMAG)将样品和抗氧化剂标准品用Linomat 5进行精确点样于10×10cm的硅胶板上，点样的条带长6 mm，条带距离底部8mm，距离左端12mm，条带间距1.7mm。点样完成后用ADC-2 (CAMAG)展开仪展开，展开前，通过在另一槽注入10mL的流动相使缸内达到饱和状态。取10 mL优化后的展开液（甲苯/乙酸乙酯/甲醇=9/1/1（v/v/v）），上行展开60mm取出，置于50℃平板加热器上充分干燥3 min。随后通过浸渍将生物显影液均匀涂布到硅胶板上，避光反应15分钟，置于DD70成像系统(Biostep)上，在投射白光照明下获取硅胶板的图像，然后用薄层色谱扫描仪进行扫描定量，扫描条件与实施例1中（4）相同。结果如图7所示，含有合成酚类抗氧化剂的不同样品均能够获得清晰的成像，图8结果显示，根据A-E的检测结果可计算获得叶酸的标准曲线（与图3相同），将两种食用油脂的色谱峰值代入标准曲线，经计算，大豆油中TBHQ和BHT含量分别为65±3mg/kg和102±5mg/kg，葵花籽油中TBHQ和BHT含量分别为75±6mg/kg和131±4mg/kg，应用HPLC对相同的样品进行检测，检测方法参考1994年公开的AOAC 标准方法 983.15。检测结果分别为大豆油中TBHQ和BHT含量分别为61±3 mg/kg和98±6 mg/kg，葵花籽油中TBHQ和BHT含量分别为71±2mg/kg和135±2mg/kg，表明本发明的方法与HPLC检测结果一致。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种定量测定食用油脂中合成酚类抗氧化剂的方法，其特征在于，利用高效薄层色谱对油脂中的二丁基羟基甲苯和特丁基对苯二酚进行分离，使用生物显影液进行生物效应衍生显影，显影后颜色由紫色变为黄色的即含有合成酚类抗氧化剂，之后采用薄层扫描仪将生物显影后的成像结果进行定量，光源为氘灯和钨灯，采用荧光-反射模式，发射波长为530nm；
所述生物显影液为2,2-联苯基-1-苦基肼基溶液；
利用高效薄层色谱对油脂中的二丁基羟基甲苯和特丁基对苯二酚进行分离是将待测样品在薄层色谱上展开，具体步骤为：按2-8μL在硅胶板上点样，点样后用体积比为9/1/1的甲苯/乙酸乙酯/甲醇混合液展开60mm，展开后将硅胶板干燥2～5min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤为：将待测样品在硅胶板上点样，用展开液展开，干燥，再将生物显影液涂布在展开后的硅胶板上，置于白光灯下照射12～15分钟进行成像，再采用薄层扫描仪将生物显影后的硅胶板置于薄层扫描仪中进行定量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物显影液的浓度为1-40mg/mL。
4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，待测样品包括大豆油或葵花籽油。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，待测样品在点样前经过预处理；所述预处理是将食用油脂按照1g：10mL甲醇的比例混合，涡旋混合器震荡3分钟，5000r/min离心，0.45微米膜过滤。
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