CN109055522A

CN109055522A - C4orf38在制备用于检测或治疗神经性疼痛的产品中的应用

Info

Publication number: CN109055522A
Application number: CN201810714917.6A
Authority: CN
Inventors: 胡宇博; 王俊容; 刘大海; 叶聪
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2018-07-03
Filing date: 2018-07-03
Publication date: 2018-12-21

Abstract

本发明公开了一种与神经性疼痛相关的新的分子标志物：C4orf38，以及其在制备检测或治疗神经性疼痛产品中的应用；本发明还提供一种C4orf38的抑制剂，及其在制备治疗神经性疼痛药物中的应用。本发明提供的所述标志物可以对神经性疼痛的发生进行早期评估预测，不仅对神经性疼痛的治疗和医疗成本的节约有重要意义，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和新途径。

Description

C4orf38在制备用于检测或治疗神经性疼痛的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及C4orf38及其抑制剂在制备用于检测或治疗神经性疼痛的产品中的应用。

背景技术

疼痛是在人体受到各种伤害性刺激时所产生的感觉，是存在于人体内部的警戒与保护系统，它能引起机体产生被动性防御反应以躲避伤害刺激，对机体具有保护作用。但是过度的伤害性刺激不但会引起强烈的疼痛感觉而且还会导致机体生理功能的紊乱，甚至休克。人类疼痛分为急性疼痛和慢性疼痛，急性痛是人体免受伤害，是组织损伤的生理性预警信号。与组织损伤引起的急性疼痛不同，慢性疼痛治疗困难。慢性疼痛是一种病理状态，其主要分为伤害性或炎症性疼痛、神经(病理)性疼痛及癌痛。1994国际疼痛研究会将神经(病理)性疼痛(Neuropathic pain，NPP)定义为“周围或中枢神经系统原发性或继发性损害或功能障碍或短暂紊乱引起的疼痛”,其主要生理学特点是痛觉的反应性增高，主要表现为痛觉过敏(hyperalgesia)和超敏反应(allodynia)。神经性疼痛一直是困扰医学界的难题，发病机理不是十分清楚。

传统的镇痛药物主要有麻醉性镇痛药和非留体类消炎镇痛药两大类，由于这些药物特异性不高，长期使用可以引起严重的副作用，如药物依赖、呼吸抑制、致幻、胃肠道反应等，有相当一部分病人不得不停止使用。尽管新的镇痛药及药物的新剂型不断上市，仍未能从根本上解决疼痛治疗问题，临床上仍有大量病人在忍受着疼痛的煎熬，期待着镇痛新技术为其解除痛苦。尤其是神经性疼痛，治疗更为棘手。神经性疼痛对阿片类药物并不敏感，常用的抗抑郁药及抗癫痫药治疗神经病理性痛的临床效果有限。慢性疼痛的治疗仍然是困扰当今医学界的一大难题，尤其是神经性疼痛(如难治性带状疱疹后神经痛等)的治疗已成为临床急待研究和解决的重要课题。

随着分子生物技术的发展，基因治疗已经成为一种新的干预手段，已被广泛尝试应用多种疾病的治疗。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导细胞内的mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失，属于转录后的基因沉默机制。近年，随着对RNA干扰现象机制的深入研究，RNAi已经成为一种功能基因组研究的有效工具。RNA干扰是目前最有效的基因“沉默”技术，从理论上讲，在神经性疼痛通路中兴奋性增高的基因都可能成为RNA干扰靶位，从而降低其兴奋，达到治疗目的。但是，干扰效率高，特异性强的小RNA的获得较难，不同序列的差异即可导致有效性的丧失，从而影响其药理学价值。

因此，急需研究更有效的镇痛药物靶点或新的镇痛方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种与神经性疼痛相关的新的分子标志物：C4orf38，以及其在制备检测或治疗神经性疼痛的产品中的应用；本发明的另一个目的在于寻找预防或治疗神经性疼痛的的新途径：C4orf38抑制剂。

基于此，本发明通过高通量测序筛选出在神经性疼痛患者和正常人血液样本中差异表达的C4orf38，并且通过实时荧光定量PCR验证C4orf38在神经性疼痛患者血液样本中表达上调；进一步，发明人通过构建大鼠神经性疼痛CCI模型，探讨C4orf38的抑制剂siRNA对大鼠神经性疼痛的治疗作用，为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和新思路。

首先，本发明提供了C4orf38在制备用于检测神经性疼痛的产品中的应用。

优选的，所述C4orf38在神经性疼痛患者的血液样本中表达上调。

优选的，所述产品包括试剂、试剂盒和药物。

优选的，所述神经性疼痛包括以下一种或多种：疱疹后神经痛、神经性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、癌痛、幻肢痛。

优选的，所述试剂盒包括检测C4orf38水平的试剂，所述试剂包括特异性扩增C4orf38的引物。

本发明所述C4orf38的引物是根据NCBI参考序列:NR_024008.1设计的；该引物可以采用软件来设计，如使用Primer5、Oligo6等，也可以找公司设计。

优选的，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

进一步地，本发明提供了一种C4orf38的抑制剂，所述抑制剂选自：C4orf38核酸的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA以及C4orf38的活性或功能抑制剂。

优选的，所述抑制剂为siRNA，所述siRNA序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染人神经细胞进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，它们分别具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列。

进一步地，本发明还提供了所述的抑制剂在制备预防或治疗神经性疼痛药物中的应用。

进一步地，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括C4orf38抑制剂，和/或所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明提供的药物组合物可用于预防或治疗神经性疼痛，所述神经性疼痛包括(但不限于)疱疹后神经痛、神经性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、癌痛、幻肢痛。

神经性疼痛的标志是慢性异常性疼痛和痛觉过敏。

异常性疼痛指由通常不会引发疼痛响应的刺激例如轻压力造成的疼痛。

痛觉过敏指对正常的疼痛刺激的增加的敏感性。

本发明所述载体包括(但不限于)稀释剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂。

本发明药物组合物可以是各种口服或胃肠外制剂形式。使用包括填料，填充剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂，和表面活性剂在内的常规稀释剂或赋形剂配制药物组合物。固体口服制剂包括片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊等。这些固体制剂可通过将至少一种化合物与一种或多种赋形剂，例如，淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖，明胶等混合来制备。此外，液体口服制剂包括悬浮液，溶液，乳剂和糖浆等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡外，还可包括各种赋形剂，例如，润湿剂，甜味剂，香料，防腐剂等。肠胃外给药的制剂包括灭菌水溶液，非水溶剂，悬浮剂，乳剂，冻干剂，栓剂等。丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射酯如油酸乙酯等可以用作非水溶剂和悬浮剂。栓剂主要成分可以包括witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂脂，甘油明胶等。

本发明药物组合物可具有选自下组的任意一种制剂：片剂，丸剂，粉末，颗粒，胶囊，溶液，悬浮剂，乳剂，糖浆，灭菌水溶液，乳液，冻干制剂和栓剂。

本发明的药物组合物还可以与其他治疗神经性疼痛的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将C4orf38的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带C4orf38的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA)递送到靶点上，并使之抑制C4orf38的功能或表达，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

有益效果

本发明公开了一种与神经性疼痛相关的新的分子标志物：C4orf38，并进一步证实C4orf38在患有神经性疼痛患者血液样本中高表达；本发明还公开了所述标记物C4orf38的抑制剂在制备治疗神经性疼痛药物中的应用；本发明提供的所述标志物可以对神经性疼痛的发生进行早期评估预测，不仅对神经性疼痛的治疗和医疗成本的节约有重要意义，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和新途径。

附图说明

图1利用QPCR检测C4orf38在神经性疼痛患者血液样本中的表达情况；

图2 C4orf38siRNA对C4orf38表达的抑制作用；

图3各组大鼠机械性刺激痛阈和热痛阈的变化；其中A为机械痛阈的变化；B为热痛阈的变化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

实施例1高通量测序筛选差异表达基因

1、取样

取在吉林大学中日联谊医院诊断为神经性疼痛的10例患者的血液样本，以及10例正常对照的血液样本。获得的样本在编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究中所用的临床样本，均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。

2、对血液样本进行总RNA提取

采用TRIzol^TM LS Reagent(Invitrogen,USA)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

①0.25mL血液样本中加入0.75mLTRIzol LS，高速搅拌器混匀样品；

②室温静置5min；加氯仿0.2mL，用力振荡离心管15s，室温下放置2-15min；

③4℃下，12000rpm高速离心15min后倾斜离心管45°，小心吸取上层水相到另一新离心管中，注意不要吸到中间层或有机层。移入新管，加入0.5mL 100％异丙醇，充分颠倒混匀，室温静置10分钟；

④4℃下，12000rpm高速10min后小心弃掉上清液，加入1mL75％乙醇洗RNA沉淀。涡旋，混匀样品，4℃下7500*g离心5min，弃上清液；

⑤室温下放置5min以充分晾干沉淀，用无RNase水重悬RNA沉淀；

⑥用分光光度计(IMPLEN,CA,USA)测量RNA纯度及使用RNA Assay Kit in2.0Flurometer检测试剂盒(Life Technologies,CA,USA)浓度，冻存于-80℃。通过分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.8-2.2。

RNA质量判定标准：RNA样本的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

RNA完整性评估使用RNANano 6000检测试剂盒以及生物分析仪2100系统(AgilentTechnologies,CA,USA)。正常组和病例组各样本稀释至同一浓度用于制备文库和测序。

4、高通量测序

高通量测序是由北京诺禾致源公司完成。

每个RNA样品输入3μg。首先利用Epicentre Ribo-zero^TM rRNA Removal试剂盒(Epicentre,USA)将上步提取的总RNA去除rRNA，然后用乙醇沉淀法清除rRNA游离残留物。再利用Ultra^TM Directional RNA Library Prep试剂盒(NEB,USA)按照说明书制备测序文库，并在每个样品的属性序列中加入索引编码。将测序文库在NEBNext的第一链合成反应缓冲液(First Strand Synthesis Reaction Buffer，5×)中利用二价阳离子进行高温下裂解。利用随机引物(random hexamer primer)和M-MuLV反转录酶合成第一链cDNA。随后用DNA聚合酶I和RNase H进行第二链cDNA合成，反应缓冲液中，用dUTP代替dNTPS中的dTTP。再用聚合酶和外切核酸酶把cDNA片段转换成平末端。将DNA片段3’端磷酸化之后，与带有发夹结构的NEBNext Adaptor连接以备杂交。为了选择长度约为150～200bp的cDNA片段，用ApHealthXP系统(Beckman Coulter,Beverly,USA)对文库片段进行纯化。然后用3μL的USER Enzyme(NEB，USA)进行大小选择，在37℃下连接cDNA进行15分钟，再在95℃下进行5分钟。使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR。根据说明书在cBot ClusterGeneration系统上使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂盒(Illumia)进行索引编码样本的聚类，再通过Illumina Hiseq 4000平台进行高通量测序，获得SequencedReads,之后在参考有关物种参考序列或基因组的情况下，进行生物信息分析，对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG₂FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，本发明对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释，鉴于以上数据分析的结果，结合文献发明人筛选了差异表达C4orf38，其在神经病理性疼痛患者的血液样本中表达上调。

进一步，发明人通过实时定量PCR验证C4orf38在神经性疼痛患者的血液样本中表达上调，如图1所示。

其中，所述实时定量PCR采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)和PowerGreen PCR Master Mix试剂盒的进行实验，具体步骤参照说明书进行。

所述PCR引物序列如SEQ ID NO:1AAGCGGAGAGGGCACAAAG和SEQ ID NO:2GTCTCAGCCGAGGTCATCGAG所示。

实施例2 RNAi干扰C4orf38表达

人神经细胞(HN)购自美国ScienCell；常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。本发明C4orf38的siRNA是由上海生工生物技术有限公司合成。

所述C4orf38的siRNA序列如AAAUAAAUGCCUAUGCAACAG SEQ ID NO:3和GUUGCAUAGGCAUUUAUUUAU SEQ ID NO:4所示。

取对数生长期的HN细胞，以2×10⁶个/孔接种于六孔板中，过夜培养后，弃掉旧培养基，根据Lipofectamine 3000转染试剂进行细胞转染，实验分为空白对照组Con、阴性对照组siNC、实验组si-C4orf38，具体操作如下：①使用7.5μL Opti-MEM培养基稀释125μL3000试剂，轻轻混匀，室温下孵育5分钟；②实验各组分别取5μL siRNA加入250μL Opti-MEM中进行稀释，并轻轻摇动将其混匀；③将稀释的siRNA和3000混合(1:1比例)后在室温下孵育5分钟；④加入3000复合物至细胞中；⑤37℃，CO₂培养箱内孵育48小时后，在荧光显微镜下观察实验组细胞的荧光强度并计算转染效率。并应用Real-time PCR方法检测转染前后C4orf38表达的变化。

结果如图2所示，与空白对照组相比，阴性对照组对HN细胞中C4orf38表达无明显抑制作用，转染的C4orf38siRNA实验组对HN细胞中C4orf38表达起到显著性抑制作用。

实施例3 C4orf38siRNA经鞘内注射对大鼠热痛阈、机械痛阈的影响

采用大鼠右侧坐骨神经结扎构建神经病理性疼痛模型(CCI)，并行L5～L6鞘内置管，观察C4orf38的siRNA经鞘内注射对该大鼠热痛阈和机械痛阈的影响。大鼠分为假手术组(Sham组，不结扎坐骨神经)、坐骨神经结扎组(CCI组)、Mm siRNA组(CCI+鞘内注射错配siRNA)及siRNA组(CCI+鞘内注射C4orf38siRNA)，siRNA组大鼠从CCI术前1d开始鞘内注射脂质体包裹的有效C4orf38siRNA，20μg/d，连续7d。CCI组、Mm siRNA组分别注射等量生理盐水和错配siRNA。

1.CCI模型的构建

健康成年雄性SD大鼠，体质量200～250g，购自南京君科生物工程有限公司。实验前禁食12h，自由饮水。

采用戊巴比妥(40mL/kg)腹腔注射麻醉，分离右侧坐骨神经，用4-0的羊肠线依次轻轻地捆扎4个结，结的间距大约2mm，打结的力度为出现大腿肌肉抽动或发生蹬腿反射为止。依次缝合肌肉和皮肤，对合皮肤后碘氟消毒，腹腔注射0.3mL氨苄青霉素(浓度100mg/mL)，手术操作均在无菌的条件下进行。麻醉醒前单独置于龙中，饲养观察。假损伤组大鼠仅暴露坐骨神经干而不予结扎。

2.鞘内置管

大鼠麻醉后腰中线备皮消毒后切开约2.5cm的小口，剪开筋膜，一手托起动物，尽量暴露L5～L6间隙，用小剪刀垂直L5棘突剪开，再在L6棘突上斜向L5方向向下剪开肌肉，剪除部分L6棘突，暴露L5～L6间的三角间隙，用小针穿破硬膜，可见动物嘶叫或甩尾，夹取PE10导管延穿刺孔插入，插入时可见动物嘶叫或甩尾或蹬腿，置入约1cm，可见脑脊液流出或注入生理盐水可见水回流，即可封闭管口。导管周围敷以氨苄青霉素粉末，依次缝合妥善固定导管于肌肉和皮肤，在皮下再敷以氨苄青霉素粉末，缝合皮肤对合完整，腹腔注射0.3mL氨苄青霉素(100mg/mL)。术后单笼饲养。

3.热痛阈测定

大鼠放置于透明的有机玻璃笼中，笼子无底壁，将笼子放在一块3mm厚的玻璃板上，这样动物足底直接接触玻璃板，而测定探头紧挨着玻璃板的下面测定，减少系统误差。将热痛刺激仪(BME-410A型，中国医学科学院生物医学工程研究所)光源焦距通过玻璃板照射动物足趾的着力点。电子记录开始照射到出现缩爪反应的时间区间。以大鼠在辐射热照射下出现缩爪反射的潜伏时间(paw withdrawl latency,PWL)为热痛阈，分别于CCI术前1d及术后1、3、7、10、14d测定各组大鼠足趾的热痛阈，测定值精确到0.1s。所有动物照射内侧第1足趾的着力点，每个时点测定3次，每次间隔5min，取平均值作为热痛阈。单次照射不超过20s，以免损伤照射部位。所有测定由同一位不知情实验人员在相同时间段和相同实验条件下完成。

4.机械痛阈测定

采用vonFrey纤维丝参照chaplan介绍的up-and-down法(Chaplan S R,Bach F W,Pogrel J W,et al.Quantitative assessment oftactile allodynia in the rat paw.[J].J Neurosci Methods,1994,53(1):55-63.)测量大鼠机械缩足反应阈值(pawwithdrawal threshold，PWT)。用大鼠的缩足反应阈值表示大鼠机械刺激痛阈。将大鼠置于升高的金属网上，盖以透明的有机玻璃罩。先让大鼠适应环境15min，待大鼠的梳理和探究活动基本消失后，用一系列标准化的vonFrey纤维丝垂直刺激大鼠后肢足底中部，使之稍成s形，持续6～8s，观察是否出现缩足反应。大鼠在刺激时间内或在移开vonFrey纤维丝时立即出现快速的缩足反应，记为阳性反应，而身体活动所引起的缩爪反应不记作阳性反应。直至找到该鼠出现50％(测量10次至少有5次缩足)缩足反应的纤维丝强度(g)，即为缩足反应阈值。重复3次试验，每次间隔10min，取三次平均值作为PWT值。

5.数据处理及统计分析

采用SPSS 22.0统计软件进行统计处理，计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用未配对t检验，p<0.05为有统计学差异。

6.结果

结果如图3表明：与假手术组相比，坐骨神经结扎后1、3、7、10、14d，大鼠右足PWL和PWT值明显下降(P<0.05)；与CCI组相比，结扎后1、3、7d，siRNA组大鼠右足PWL、PWT升高(P<0.05)，而第10、14d与CCI组相比较无明显差异。结果说明，结扎后大鼠出现热痛觉过敏及机械性异常性疼痛，鞘内注射C4orf38siRNA具有一定镇痛作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> C4orf38在制备用于检测或治疗神经性疼痛的产品中的应用

<130> p18028

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagcggagag ggcacaaag 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtctcagccg aggtcatcga g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaauaaaugc cuaugcaaca g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

guugcauagg cauuuauuua u 21

Claims

1.C4orf38在制备用于检测神经性疼痛产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述C4orf38在神经性疼痛患者的血液样本中表达上调。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒和药物。

4.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述神经性疼痛包括以下一种或多种：神经性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、癌痛、幻肢痛。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测C4orf38水平的试剂，所述试剂包括特异性扩增C4orf38的引物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示。

7.一种C4orf38的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂选自：C4orf38核酸的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA以及C4orf38的活性或功能抑制剂。

8.如权利要求7所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为siRNA，所述siRNA序列如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

9.权利要求7或8所述的抑制剂在制备预防或治疗神经性疼痛药物中的应用。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括C4orf38抑制剂，和/或所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。