CN109055432A - 慢病毒感染试剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种慢病毒感染试剂及其制备方法与应用，慢病毒感染试剂包括第一组合物和第二组合物；第一组合物包括二油酰基L‑α‑磷脂酰乙醇胺；第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；第一组合物和第二组合物分别独立包装。本发明提供的慢病毒感染试剂，创新地使用低毒性阳离子聚合物和非离子表面活性剂作为感染试剂，一方面可以降低传统感染试剂的细胞毒性，扩展感染试剂的使用范围，另一方面可以提高慢病毒感染效率和整合效率，感染效率和整合效率显著超过溴化己二甲铵，降低病毒使用量，降低制备成本，使用快速简便，具有很好的应用前景。

Description

慢病毒感染试剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种慢病毒感染试剂及其制备方法与应用。
背景技术
慢病毒技术是一种将外源基因或DNA片段整合到宿主细胞染色体上的基因工程技术，它借助于慢病毒，慢病毒是一种工程性的假病毒，在HIV-1病毒的基础上由基因工程方法改造而来。可以感染宿主细胞非常广泛，包括了各种人源和动物源的原代细胞、肿瘤细胞、干细胞、神经元细胞等多种类型的细胞。此外，在体内动物实验的研究中，慢病毒也已显示出良好的基因导入效果。
慢病毒技术的流程包括以下几个阶段：(1)慢病毒的载体质粒构建和纯化提取；(2)与辅助质粒共转染293T细胞，收集培养上清；(3)慢病毒颗粒的纯化和浓缩；(4)慢病毒颗粒感染宿主细胞，将目的的DNA片段整合宿主细胞染色体上。
慢病毒技术使用过程中，感染环节是最重要的环节之一。由于慢病毒颗粒制备费用较为昂贵，而直接用慢病毒感染很多细胞在感染效率和整合效率这两个环节都存在效率低下的问题，这个环节通常需要引入慢病毒感染试剂来增强慢病毒的感染效率和整合效率。目前常用的慢病毒感染试剂为溴化己二甲铵，是一种多聚阳离子聚合物，作用机理为中和细胞表面蛋白与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。该试剂存在两个方面不足：一是对很多细胞存在较大细胞毒性，限制了该试剂的使用范围，包括浓度范围和细胞使用范围；二是感染效率和整合效率提升一般只有3-10倍，还有很大的改进空间。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种慢病毒感染试剂及其制备方法与应用，以降低慢病毒感染试剂的细胞毒性，提高感染效率和整合效率，扩展感染试剂的使用范围，降低制备成本。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明提供了一种慢病毒感染试剂，试剂包括第一组合物和第二组合物；第一组合物包括二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-Phosphatidyl-ethanolamine-dioleoyl)；第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；第一组合物和第二组合物分别独立包装。需要说明的是，本发明采用的L-α-Phosphatidyl-ethanolamine-dioleoyl的购自西格玛奥德里奇公司，本发明采用的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物是购买自西格玛奥德里奇公司F127型号的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物。
优选地，第一组合物包括浓度为1-200mg/ml的二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺溶液。
优选地，第二组合物包括浓度为5-500mg/ml的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物溶液。
本发明还提供了慢病毒感染试剂的制备方法，第一组合物的制备方法包括步骤：将水和二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺混合，然后过滤除菌，配制得到浓度为1-200mg/ml的二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺溶液，4℃保存备用；其中，水为无菌水；第二组合物的制备方法包括步骤：将水和聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物混合，然后过滤除菌，配制得到浓度为5-500mg/ml的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物溶液，4℃保存备用；其中，水为无菌水。需要说明的是，过滤除菌优选采用0.22μm孔径过滤器过滤除菌。
本发明还保护慢病毒感染试剂在慢病毒技术中的应用。
本发明还提供了采用慢病毒感染试剂感染细胞的方法，包括步骤：S1：将待感染细胞消化离心后，接种到孔板的培养基中；S2：将第一组合物和第二组合物混合均匀，得到感染试剂；S3：将感染试剂加入至含待感染细胞的培养基中，然后加入融化后的慢病毒，混合均匀后，感染预设时间；S4：感染结束后，去除剩余的慢病毒和感染试剂，将感染后的细胞继续培养。需说明的是，步骤S1中，将待感染细胞进行消化离心，优选在慢病毒感染前一天进行；步骤S3中，融化后的慢病毒是指在冰上缓慢融化后的慢病毒，混合均匀优选为轻轻混合均匀。
优选地，步骤S1中，孔板为24孔板，每孔中待感染细胞的数量为20000-50000个。
优选地，步骤S2中，第一组合物和第二组合物的体积比为1：(0.3-3)。
优选地，步骤S3中，感染试剂和含待感染细胞的培养基的体积比为1：(100-5000)。
优选地，步骤S3中，感染的时间为24-72小时。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)本发明提供的慢病毒感染试剂，创新地使用低毒性阳离子聚合物和非离子表面活性剂作为感染试剂，一方面降低了传统感染试剂的细胞毒性，扩展了感染试剂的使用范围，另一方面提高了慢病毒感染效率和整合效率，感染效率和整合效率显著超过溴化己二甲铵，降低了病毒使用量，降低制备成本，使用快速简便；
(2)本发明提供的慢病毒感染试剂，包括了第一组合物和第二组合物两部分，分别配制和灌装，使用前混合，保证感染试剂长期稳定；其中，第一组合物包含一种新型多聚阳离子聚合物，经试验证明，细胞毒性远低于溴化己二甲铵，而细胞可耐受最高剂量为溴化己二甲铵的100倍以上；第二组合物含有一种新型的高分子非离子表面活性剂，可以提高细胞膜和细胞核膜的通透性，使慢病毒与细胞膜表面蛋白结合后，更多的被细胞内吞而进入细胞内。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例四中制备得到的感染后的细胞的流式细胞术检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
本发明提供一种慢病毒感染试剂，包括第一组合物和第二组合物；第一组合物包括二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-Phosphatidyl-ethanolamine-dioleoyl)；第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；第一组合物和第二组合物分别独立包装；
第一组合物的制备方法包括步骤：将无菌水和二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺混合，然后采用0.22μm孔径过滤器过滤除菌，配制得到浓度为1-200mg/ml的二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺溶液，4℃保存备用；
第二组合物的制备方法包括步骤：将无菌水和聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物混合，然后采用0.22μm孔径过滤器过滤除菌，配制得到浓度为5-500mg/ml的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物溶液，4℃保存备用。
另外，本发明还提供了采用慢病毒感染试剂感染细胞的方法，包括步骤：
S1：慢病毒感染前一天，将待感染细胞进行消化离心，然后接种到24孔板的培养基中，每孔中待感染细胞的数量为20000-50000个；
S2：将第一组合物和第二组合物以1：(0.3-3)的体积比混合均匀，得到感染试剂；
S3：将感染试剂加入至含待感染细胞的培养基中，感染试剂和含待感染细胞的培养基的体积比为1：(100-5000)，然后加入在冰上缓慢融化后的含GFP基因的慢病毒，轻轻混合均匀后，感染24-72小时；
S4：感染结束后，去除剩余的慢病毒和感染试剂，将感染后的细胞继续培养。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
实施例一
本实施例提供一种慢病毒感染试剂，包括第一组合物和第二组合物；第一组合物包括二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-Phosphatidyl-ethanolamine-dioleoyl)；第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；第一组合物和第二组合物分别独立包装；
第一组合物的制备方法包括步骤：将无菌水和二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺混合，然后采用0.22μm孔径过滤器过滤除菌，配制得到浓度为10mg/ml的二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺溶液，4℃保存备用；
第二组合物的制备方法包括步骤：将无菌水和聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物混合，然后采用0.22μm孔径过滤器过滤除菌，配制得到浓度为100mg/ml的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物溶液，4℃保存备用。
实施例二
本实施例提供一种慢病毒感染试剂，包括第一组合物和第二组合物；第一组合物包括二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-Phosphatidyl-ethanolamine-dioleoyl)；第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；第一组合物和第二组合物分别独立包装；
第一组合物的制备方法包括步骤：将无菌水和二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺混合，然后采用0.22μm孔径过滤器过滤除菌，配制得到浓度为200mg/ml的二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺溶液，4℃保存备用；
第二组合物的制备方法包括步骤：将无菌水和聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物混合，然后采用0.22μm孔径过滤器过滤除菌，配制得到浓度为500mg/ml的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物溶液，4℃保存备用。
实施例三
本实施例提供一种慢病毒感染试剂，包括第一组合物和第二组合物；第一组合物包括二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-Phosphatidyl-ethanolamine-dioleoyl)；第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；第一组合物和第二组合物分别独立包装；
第一组合物的制备方法包括步骤：将无菌水和二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺混合，然后采用0.22μm孔径过滤器过滤除菌，配制得到浓度为1mg/ml的二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺溶液，4℃保存备用；
第二组合物的制备方法包括步骤：将无菌水和聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物混合，然后采用0.22μm孔径过滤器过滤除菌，配制得到浓度为5mg/ml的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物溶液，4℃保存备用。
实施例四
本实施例提供一种采用实施例一的慢病毒感染试剂感染细胞的方法，包括步骤：
S1：慢病毒感染前一天，将待感染细胞进行消化离心，然后接种到24孔板的培养基中，每孔中待感染细胞的数量为20000-50000个；
S2：将第一组合物和第二组合物以1:1的体积比混合均匀，得到感染试剂；
S3：将感染试剂加入至含待感染细胞的培养基中，感染试剂和含待感染细胞的培养基的体积比为1:1000，然后加入在冰上缓慢融化后的含GFP基因的慢病毒，轻轻混合均匀后，感染48小时；
S4：感染结束后，去除剩余的慢病毒和感染试剂，将感染后的细胞继续培养。
实施例五
本实施例提供一种采用实施例二的慢病毒感染试剂感染细胞的方法，包括步骤：
S1：慢病毒感染前一天，将待感染细胞进行消化离心，然后接种到24孔板的培养基中，每孔中待感染细胞的数量为20000-50000个；
S2：将第一组合物和第二组合物以1:0.3的体积比混合均匀，得到感染试剂；
S3：将感染试剂加入至含待感染细胞的培养基中，感染试剂和含待感染细胞的培养基的体积比为1:100，然后加入在冰上缓慢融化后的含GFP基因的慢病毒，轻轻混合均匀后，感染24小时；
S4：感染结束后，去除剩余的慢病毒和感染试剂，将感染后的细胞继续培养。
实施例六
本实施例提供一种采用实施例三的慢病毒感染试剂感染细胞的方法，包括步骤：
S1：慢病毒感染前一天，将待感染细胞进行消化离心，然后接种到24孔板的培养基中，每孔中待感染细胞的数量为20000-50000个；
S2：将第一组合物和第二组合物以1:3的体积比混合均匀，得到感染试剂；
S3：将感染试剂加入至含待感染细胞的培养基中，感染试剂和含待感染细胞的培养基的体积比为1:5000，然后加入在冰上缓慢融化后的含GFP基因的慢病毒，轻轻混合均匀后，感染72小时；
S4：感染结束后，去除剩余的慢病毒和感染试剂，将感染后的细胞继续培养。
将本发明实施例四制备得到的感染后的细胞进行流式细胞术检测。
检测结果如图1所示(三条曲线，从左到右分别对应的是：Hep3B，Hep3B+GFP慢病毒+Polybrene，Hep3B+GFP慢病毒+Patent)。从图1可以看到，当使用该发明(Patent)的慢病毒感染试剂后，在Hep3B细胞上大大提供高了GFP表达的强度，相比于市场上最常见的Polybrene，信号从1.25×104提高到3.42×104，提高了2.74倍。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种慢病毒感染试剂，其特征在于：
所述试剂包括第一组合物和第二组合物；
所述第一组合物包括二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺；
所述第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；
所述第一组合物和所述第二组合物分别独立包装。
2.根据权利要求1所述的慢病毒感染试剂，其特征在于：
所述第一组合物包括浓度为1-200mg/ml的二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺溶液。
3.根据权利要求2所述的慢病毒感染试剂，其特征在于：
所述第二组合物包括浓度为5-500mg/ml的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物溶液。
4.权利要求1-3任一项所述的慢病毒感染试剂的制备方法，其特征在于：
所述第一组合物的制备方法包括步骤：将水和二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺混合，然后过滤除菌，配制得到浓度为1-200mg/ml的二油酰基L-α-磷脂酰乙醇胺溶液，4℃保存备用；其中，所述水为无菌水；
所述第二组合物的制备方法包括步骤：将水和聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物混合，然后过滤除菌，配制得到浓度为5-500mg/ml的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物溶液，4℃保存备用；其中，所述水为无菌水。
5.权利要求1-3任一项所述的慢病毒感染试剂在慢病毒技术中的应用。
6.一种采用权利要求1-3任一项所述的慢病毒感染试剂感染细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
S1：将待感染细胞消化离心后，接种到孔板的培养基中；
S2：将所述第一组合物和所述第二组合物混合均匀，得到感染试剂；
S3：将所述感染试剂加入至含待感染细胞的培养基中，然后加入融化后的慢病毒，混合均匀后，感染预设时间；
S4：感染结束后，去除剩余的慢病毒和感染试剂，将感染后的细胞继续培养。
7.根据权利要求6所述的采用慢病毒感染试剂感染细胞的方法，其特征在于：
步骤S1中，所述孔板为24孔板，每孔中待感染细胞的数量为20000-50000个。
8.根据权利要求6所述的采用慢病毒感染试剂感染细胞的方法，其特征在于：
步骤S2中，所述第一组合物和所述第二组合物的体积比为1：(0.3-3)。
9.根据权利要求6所述的采用慢病毒感染试剂感染细胞的方法，其特征在于：
步骤S3中，所述感染试剂和所述含待感染细胞的培养基的体积比为1：(100-5000)。
10.根据权利要求6所述的采用慢病毒感染试剂感染细胞的方法，其特征在于：
步骤S3中，所述感染的时间为24-72小时。
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