CN109053922A - 虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物 - Google Patents

虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物。该虾夷扇贝内脏多糖的主链为→6)Manp(1→3)Galp(1→，‑SO4存在于Man(1→的C‑4和/或→3Gal(1→的C‑4位。该多糖具有抑制凝血酶催化凝血纤维蛋白原的活性作用，能延长活化部分凝血酶原时间APTT和凝血酶时间TT，对凝血酶原时间PT无显著影响。

Description

虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物
技术领域
本发明总地涉及活性多糖技术领域，具体涉及虾夷扇贝内脏多糖、提取方法及其应用、以及药物组合物。
背景技术
虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)，主要产自我国的辽宁省及山东省的沿海地区。随着扇贝加工业的不断发展，加工产生的副产物的量也在不断增加。扇贝内脏是扇贝加工的副产物，包括扇贝的消化道，消化腺，性腺，肾和循环系统，约占去壳后扇贝总体重的30％。目前这些扇贝内脏通常被丢弃，不仅造成环境的污染，也是生物资源的浪费。因此，开发利用扇贝内脏具有重要意义。
已有研究报道扇贝内脏中具有活性多糖成分。王长云从海湾扇贝裙边中提取分离精制得到一种结构类似于肝素的多糖；李珊从栉孔扇贝和海湾扇贝裙边中提取得到一种糖胺聚糖，通过结构分析最终确定这种结构的糖胺聚糖为透明质酸；宋荪阳发现扇贝性腺中的酸性多糖具有抗氧化活性。
血栓形成是一个严重的威胁健康问题，也是心脏病发作、中风等诸多危险因素疾病的原因。在过去的几十年里，防止心脑血管的血栓成为备受关注的研究课题。肝素和华法林是目前临床广泛使用的抗凝血的药物，但仍存在很多局限性，比如可能导致严重出血、增加动脉粥样硬化和骨质疏松症风险等。因此，亟需开发新的抗凝血药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虾夷扇贝内脏多糖，以虾夷扇贝加工产生的内脏副产物为原料，通过酶解、季铵盐沉淀、色谱分离等过程制备得到一种多糖成分，其含有硫酸基，由多种单糖残基构成，主链结构为→6)Man(1→3)Gal(1→。这种多糖具有抑制凝血酶催化凝血纤维蛋白原的活性作用，能延长活化部分凝血酶原时间APTT和凝血酶时间TT，对凝血酶原时间PT无显著影响。
本发明提供了一种虾夷扇贝内脏多糖，其所述多糖的主链为→6)Manp(1→3)Galp(1→，-SO4存在于Man(1→的C-4和/或→3Gal(1→的C-4位。
优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖主链的→3)Galp(1→的C-4位被Xly或Glc取代。
更优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的硫酸基含量为7％-18％，糖醛酸含量为1％-10％。
更优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的分子量为50kDa-1000kDa，优选为63kDa-630kDa。
更优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的糖残基结构至少包括Rhap(1→、→4)Arap(1→、→4)Fucp(1→、Fucp(1→、Xylp(1→、→4)Rhap(1→、Manp(1→、Glcp(1→、→2,4)Arap(1→、→3)Fucp(1→、→4)Fucp(1→、→4)Galp(1→、Galp(1→、→3,4)Rhap(1→、→4)Manp(1→、→3)Galp(1→、→6)Manp(1→、→6)Galp(1→和→3,4)Galp(1→中的5种以上，存在己糖-糖醛酸，己糖-己糖和脱氧己糖-己糖重复二糖片段中的一个或多个。
或更优选地，根据前述的多糖，其中，所述多糖的单糖组成包括鼠李糖(Rha)、岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)。前述单糖组成的摩尔比具体为氨基葡萄糖:氨基半乳糖:鼠李糖:岩藻糖:阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖＝(1.0-2.4):1.0:(2.2-3.5):(3.0-5.0):(1.7-3.2):(2.5-7.0):(4.5-5.3):(3.1-4.2):(7.6-9.4)。
本发明还提供了前述多糖的提取方法，其中，所述提取方法包括：
(1)将虾夷扇贝内脏干粉于无水乙醇和正己烷1:2体积比混合溶液中搅拌0.5-2小时，静置过夜，除去脂肪，将上层有机试剂去除并风干；
(2)向每10g风干的样品中加入5-10mL浓度为0.05mol/L的半胱氨酸-EDTA二钠溶液及25-40mL浓度为0.05mol/L，pH＝8的K2HPO4缓冲溶液，再向样品中加入相对于样品质量0.2-1.0％(m/m)的胰蛋白酶干粉,所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250N.F.U/mg，37℃水浴震荡酶解4h之后加入相对于样品质量0.2-1.0％(m/m)的木瓜蛋白酶干粉,所述木瓜蛋白酶干粉的酶活≥2000U/mg，65℃水浴震荡酶解2-4h制得混合溶液；
(3)步骤(2)所述混合溶液冷却到室温，离心，转速4000r/min,时间10min,温度4℃，取上清液；
(4)向上清液中，对应1g步骤(2)风干的样品加入1.0-2.0mL3-13％的氯化十六烷基吡啶溶液，室温下放置24h后，离心，转速8000r/min，时间15min，温度20℃，取沉淀；
(5)每g沉淀溶解于1-2mL NaCl-乙醇混合溶液，该混合溶液为2.5-3.5mol/L NaCl和90-100％乙醇以体积比100:15混合所得溶液，再加入2.5-4mL 90-100％乙醇溶液，4℃放置8h以上，离心，转速6000-10000r/min，时间10-30min，取沉淀；
(6)每g沉淀用2-5mL 80％和95％乙醇洗1-4次后，用水溶解，使用1000-10000Da透析袋蒸馏水透析24小时以上；
(7)加入0.5-1.5％亚硫酸氢钠作保护剂，用HCl调节pH至2.0，在4℃离心7-20min，转速8000-12000r/min脱除蛋白，将上清液冻干得到虾夷扇贝内脏粗糖；
(8)虾夷扇贝内脏粗糖加样于0.25M NaCl平衡过的DEAE-纤维素柱，依次用0.25-0.75M NaCl溶液洗脱1-4个柱体积，优选为依次用0.25、0.5M NaCl溶液洗脱1-2个柱体积，收集洗脱部分，冻干；
(9)将步骤(8)所述冻干样品采用Sephadex G-100凝胶柱进行分离，用0.1-0.2MNaCl作为洗脱液，收集得到虾夷扇贝内脏多糖。
优选地，根据前述的提取方法，其中，步骤(1)中的虾夷扇贝内脏包括虾夷扇贝的消化道，消化腺，性腺，肾和循环系统中的一种或多种。
本发明还提供了前述多糖在制备抗凝血药物中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，其中，包含前述多糖。
通过检测抑制凝血酶催化凝血纤维蛋白原的作用、活化凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)评估了本发明虾夷扇贝内脏多糖的抗凝血效果。
浓度大于0.1mg/mL的虾夷扇贝内脏多糖会对凝血酶催化凝血纤维蛋白原具有明显的抑制作用，且抑制率与剂量正相关，浓度为1mg/mL时，抑制率为50％-100％。
虾夷扇贝内脏多糖可以延长APTT，在浓度为200μg/mL时APTT为45-80s，在浓度为2000μg/mL时APTT超过200s。虾夷扇贝内脏多糖对PT没用延长作用，说明虾夷扇贝酸性多糖不能抑制外源性途径凝血。虾夷扇贝内脏多糖对TT有较弱的延长作用，在浓度为2000μg/mL时，TT为40-50s。以上结果也说明虾夷扇贝酸性多糖抗凝血的机制是抑制内源性和/或共同途径凝血和凝血酶活性或纤维蛋白原转化为纤维蛋白。
附图说明
图1为实施例1中SVP2-2的单糖组成分析；
图2为实施例1中SVP2-2的二糖片段分析；
图3为实施例2中SVP2-2对纤维蛋白原凝血的抑制作用；
图4为实施例3中SVP2-1单糖组成分析；
图5为实施例3中SVP2-1二糖片段分析；
图6为实施例4中SVP2-1对纤维蛋白原凝血的抑制作用。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
虾夷扇贝内脏冻干，破碎成粉，将无水乙醇和正己烷1:2体积比混合配成溶液，扇贝内脏干粉的质量与混合溶液为1:15的比例混合，搅拌1小时，静置过夜，除去脂肪后，将上层有机试剂去除并风干。
向风干的1500g样品中加入1200mL半胱氨酸-EDTA二钠(0.05mol/L)溶液及4800mLK2HPO4(pH＝8；0.05mol/L)缓冲溶液，再向样品中加入相对于样品质量0.5％(m/m)的胰蛋白酶(≥250N.F.U/mg)，37℃水浴震荡酶解4h之后加入相对于样品质量0.5％(m/m)的木瓜蛋白酶(≥2000U/mg)，65℃水浴震荡酶解3h制得混合溶液。该混合溶液冷却到室温，离心，转速4000r/min,时间10min,温度4℃，取上清液。向上清液中，加入2400mL 10％的氯化十六烷基吡啶溶液，室温下放置24h后，离心(8000r/min，15min，20℃)取沉淀。沉淀溶解于2250mL3mol/L NaCl-95％乙醇(100:15，v/v)溶液中，再加入4500mL 95％乙醇溶液，4℃放置24h，离心(8000r/min，15min，20℃)，取沉淀用蒸馏水溶解,使用3500Da透析袋蒸馏水透析48小时，加入1％亚硫酸氢钠作保护剂，用HCl调节pH至2.0，在4℃离心10min(10000r/min)脱除蛋白，冻干得到15g粗糖。
称取0.2g粗糖溶于1mL去离子水中，吸附到用500mL的0.25M NaCl平衡过的DEAE-纤维素柱。依次用0.25和0.5M NaCl溶液各洗脱一个柱体积，收集0.5M NaCl溶液洗脱部分，冻干后得到SVP2。将SVP2溶液上样到Sephadex G-100凝胶柱，用0.15M NaCl作为洗脱液，得到两个色谱峰，收集的第二个色谱峰，透析冻干。将15g粗糖经过该纯化过程，最终得到0.15g虾夷扇贝内脏多糖SVP2-2。
采用明胶比浊法测定SVP2-2的硫酸基含量为13.8±0.56％；采用间羟基联苯法测定其糖醛酸含量为4.3±0.08％；采用TSK凝胶色谱法检测SVP2-2分子量为63kDa。
采用气相色谱法分析了SVP2-2的单糖组成，结果如图1所示，SVP2-2的单糖组成为氨基葡萄糖:氨基半乳糖:鼠李糖:岩藻糖:阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖＝1.0:1.0:2.2:3.0:1.7:2.5:4.5:3.1:7.6。
通过甲基化-GC-MS分析SVP2-2及其脱硫产物(dS-SVP2-2)的糖残基，结果如由表1所示。SVP2-2具有9种糖残基结构，其中主要的糖残基结构包括Xylp(1→、→3)Rhap(1→、→4)Manp(1→、→3)Rhap(1→和→3,4)Galp(1→等。通过对SVP2-2与其脱硫产物(dS-SVP2-2)的糖残基含量对比，可以推测-SO4位于Man(1→的C-4和→3)Gal(1→的C-4。
表1 SVP2-2和dS-SVP2-2的甲基化分析
采用1.3M三氟乙酸105℃水解3h后1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化，液相色谱-质谱分析二糖组成。由图2可知SVP2-2主要含有的二糖片段有→2)-Man(1→4)-β-GlcA(1→、未知的己糖-糖醛酸、己糖-己糖和脱氧己糖-己糖。
进一步根据SVP2-2部分酸水解产物甲基化分析结果(表2)可以推断SVP2-2的主链结构为：
表2 SVP2-2部分酸水解甲基化分析
实施例2
本实施例用于评估实施例1制备的虾夷扇贝内脏多糖SVP2-2的抗凝血效果。
具体实验方法如下：
纤维蛋白原、凝血酶和样品SVP2-2均溶解于0.05M Tris缓冲液中(盐酸调pH至7.2)，其中含有0.12mM NaCl。将0.1％纤维蛋白原溶液(140μL)和40μL不同浓度(如图3所示)的样品溶液加入板孔中，混合，测量吸光度作为样品空白值。然后，将10μL凝血酶溶液(12IU/mL)加入孔中开始血栓沉淀反应。反应10分钟后，再次测样品的吸光度。40μL Tris-HCl缓冲液(pH 7.2,0.05M)代替样品溶液作为对照空白组和对照组。肝素被用作阳性对照组。计算抑制率公式：抑制率(％)＝{[C-CB]-[S-SB]/C-CB}*100％，其中S，SB，C和CB分别代表样品吸光度，样品空白吸光度，对照吸光度和对照空白吸光度。
用0.9％的生理盐水将多糖SVP2-2配制成10、100、200、1000、2000μg/mL的多糖溶液。
活化凝血活酶时间(APTT)测定：分别取0.1mL的各个浓度的多糖溶液与待测兔血浆以1:4的比例混合。在0.1mL的混合血浆中加入相同体积的37℃孵育的APTT试剂，37℃的温度条件下保持3min。加入37℃预温0.025mol/L CaCl2溶液0.1mL，用凝血仪记录凝固时间。每组平行测5次。
凝血酶原时间(PT)测定：分别取0.1mL上述的各个浓度的多糖溶液与待测兔血浆以1:4的比例混合。在0.1mL的混合血浆中加入2倍体积的37℃孵育的PT试剂，立即用凝血仪记录凝固时间。每组平行测5次。
凝血酶时间(TT)测定：分别取0.1mL上述的各个浓度的多糖溶液与待测兔血浆以1:4的比例混合。在0.2mL的混合血浆中加入相同体积的37℃孵育的TT试剂，37℃的温度条件下保持1min，用凝血仪记录凝固时间。每组平行测5次。
通过检测抑制凝血酶催化凝血纤维蛋白原的作用、活化凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)评估了SVP2-2的抗凝血效果。
如图3所示，浓度大于0.1mg/mL的SVP2-2会对凝血酶催化凝血纤维蛋白原具有明显的抑制作用，且抑制率与剂量正相关，浓度为1mg/mL时，其抑制率为99％。
如表3所示，SVP2-2可以延长APTT，在浓度为200μg/mL时APTT为67.1±1.0s，在浓度为2000μg/mL时APTT超过200s。SVP2-2对PT没有延长作用，说明SVP2-2不能抑制外源性途径凝血。SVP2-2对TT有较弱的延长作用，在浓度为2000μg/mL时，TT为46.4±1.2s。以上结果说明SVP2-2抗凝血的机制是抑制内源性和/或共同途径凝血和凝血酶活性或纤维蛋白原转化为纤维蛋白。
表3 SVP2-2抗凝血活性结果
实施例3
虾夷扇贝内脏冻干，破碎成粉，将无水乙醇和正己烷1:2体积比混合配成溶液，扇贝内脏干粉的质量与混合溶液为1:15的比例混合，搅拌1小时，静置过夜，除去脂肪后，将上层有机试剂去除并风干。
向风干的1000g样品中加入800mL半胱氨酸-EDTA二钠(0.05mol/L)溶液及3200mLK2HPO4(pH＝8；0.05mol/L)缓冲溶液，再向样品中加入相对于样品质量0.5％(m/m)的胰蛋白酶(≥250N.F.U/mg)，37℃水浴震荡酶解4h之后加入相对于样品质量0.5％(m/m)的木瓜蛋白酶(≥2000U/mg)，65℃水浴震荡酶解3h制得混合溶液。混合溶液冷却到室温，离心，转速4000r/min,时间10min,温度4℃，取上清液。向上清液中，加入1600mL 10％的氯化十六烷基吡啶溶液，室温下放置24h后，离心(8000r/min，15min，20℃)取沉淀。沉淀溶解于1500mL3mol/L NaCl-95％乙醇(100:15，v/v)溶液中，再加入3000mL 95％乙醇溶液，4℃放置24h，离心(8000r/min，15min，20℃)，取沉淀用蒸馏水溶解,使用3500Da透析袋蒸馏水透析48小时，加入1％亚硫酸氢钠作保护剂，用HCl调节pH至2.0，在4℃离心10min(10000r/min)脱除蛋白，冻干得到粗糖10g。
称取0.2g粗糖溶于1mL去离子水中，吸附到用500mL的0.25M NaCl平衡过的DEAE-纤维素柱。依次用0.25，0.5M NaCl溶液洗脱1个柱体积，收集0.5M NaCl溶液洗脱部分得到SVP2，将SVP2溶液上样到NaCl平衡的Sephadex G-100凝胶柱上，用0.15M NaCl作为洗脱液收集，得到两个色谱峰，将收集的第一个色谱峰，透析冻干。将10g粗糖经过该纯化过程，最终得到0.07g虾夷扇贝内脏多糖SVP2-1。
采用明胶比浊法测定SVP2-1的硫酸基含量为8.1±0.18％；采用间羟基联苯法测定其糖醛酸含量为2.2±0.07％；采用TSK凝胶色谱法检测SVP2-1分子量为630kDa。
采用气相色谱法分析了SVP2-1的单糖组成，结果如图4所示，SVP2-1的主要组成单糖是氨基葡萄糖:氨基半乳糖:鼠李糖:岩藻糖:阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖＝2.4:1.0:3.5:5.0:3.2:7.0:5.3:4.2:9.4。
由图5可知SVP2-1主要含有的二糖片段有→2)-Man(1→4)-β-GlcA(1→、未知的己糖-糖醛酸、己糖-己糖、脱氧己糖-己糖。
通过甲基化-GC-MS分析SVP2-1及其脱硫产物(dS-SVP2-1)的糖残基，结果如由表4所示。SVP2-1具有16种糖残基结构，其中主要的糖残基结构包括Xylp(1→、→4)Rhap(1→、Glcp(1→、→4)Manp(1→、→2,4)Fucp(1→、Manp(1→和→6)Manp(1→等。通过SVP2-1与其脱硫产物(dS-SVP2-1)的糖残基含量对比(表4)，可以推测-SO4位于Manp(1→的C-4和→3)Galp(1→的C-4。
表4 SVP2-1和dS-SVP2-1甲基化结果分析
SVP2-1与SVP2-2的主要单糖组成和二糖组成基本一致，因此推测SVP2-1也存在→6)Manp(1→3)Galp(1→的主链结构。
实施例4
本实施例用于评估实施例3制备的虾夷扇贝内脏多糖SVP2-1的抗凝血效果。
具体实验方法如下：
纤维蛋白原、凝血酶和样品SVP2-1均溶解在0.05M Tris缓冲液中(盐酸调pH至7.2)，其中含有0.12mM NaCl。将0.1％纤维蛋白原溶液(140μL)和40μL不同浓度(如图6所示)的样品溶液加入板孔中，混合，测量吸光度作为样品空白值。然后，将10μL凝血酶溶液(12IU/mL)加入孔中开始血栓沉淀反应。反应10分钟后，再次测样品的吸光度。40μL Tris-HCl缓冲液(pH 7.2,0.05M)代替样品溶液作为对照空白组和对照组。肝素被用作阳性对照组。计算抑制率根据公式：抑制率(％)＝{[C-CB]-[S-SB]/C-CB}*100％，其中S，SB，C和CB分别代表样品吸光度，样品空白吸光度，对照吸光度和对照空白吸光度。
用0.9％的生理盐水将多糖SVP2-1配制成10、100、200、1000、2000μg/mL的多糖溶液。
活化凝血活酶时间(APTT)测定：分别取0.1mL的各个浓度的多糖溶液与待测兔血浆以1:4的比例混合。在0.1mL的混合血浆中加入相同体积的37℃孵育的APTT试剂，37℃的温度条件下保持3min。加入37℃预温0.025mol/L CaCl2溶液0.1mL，用凝血仪记录凝固时间。每组平行测5次。
凝血酶原时间(PT)测定：分别取0.1mL上述的各个浓度的多糖溶液与待测兔血浆以1:4的比例混合。在0.1mL的混合血浆中加入2倍体积的37℃孵育的PT试剂，立即用凝血仪记录凝固时间。每组平行测5次。
凝血酶时间(TT)测定：分别取0.1mL上述的各个浓度的多糖溶液与待测兔血浆以1:4的比例混合。在0.2mL的混合血浆中加入相同体积的37℃孵育的TT试剂，37℃的温度条件下保持1min，用凝血仪记录凝固时间。每组平行测5次。
通过检测抑制凝血酶催化凝血纤维蛋白原的作用、活化凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)评估了SVP2-1的抗凝血效果。
如图6所示，浓度大于0.1mg/mL的SVP2-1会对凝血酶催化凝血纤维蛋白原具有明显的抑制作用，且抑制率与剂量正相关，浓度为1mg/mL时，其抑制率为63％。
如表5所示，SVP2-1可以延长APTT，在浓度为200μg/mL时APTT为51.5±1.1s，在浓度为2000μg/mL时APTT超过200s。SVP2-1对PT没用延长作用，说明SVP2-1不能抑制外源性途径凝血。SVP2-1对TT有较弱的延长作用，在浓度为2000μg/mL时，TT为44.7±1.0s。以上结果说明SVP2-1抗凝血的机制是抑制内源性和/或共同途径凝血和凝血酶活性或纤维蛋白原转化为纤维蛋白。
表5 SVP2-1抗凝血活性结果
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种虾夷扇贝内脏多糖，其特征在于，所述多糖的主链为→6)Manp(1→3)Galp(1→，-SO4存在于Man(1→的C-4和/或→3Gal(1→的C-4位。
2.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于，所述多糖主链的→3)Galp(1→的C-4位被Xly或Glc取代。
3.根据权利要求1或2所述的多糖，其特征在于，所述多糖的硫酸基含量为7％-18％，糖醛酸含量为1％-10％。
4.根据权利要求1或2所述的多糖，其特征在于，所述多糖的分子量为50kDa-1000kDa，优选为63kDa-630kDa。
5.根据权利要求1或2所述的多糖，其特征在于，所述多糖的糖残基结构至少包括Rhap(1→、→4)Arap(1→、→4)Fucp(1→、Fucp(1→、Xylp(1→、→4)Rhap(1→、Manp(1→、Glcp(1→、→2,4)Arap(1→、→3)Fucp(1→、→4)Fucp(1→、→4)Galp(1→、Galp(1→、→3,4)Rhap(1→、→4)Manp(1→、→3)Galp(1→、→6)Manp(1→、→6)Galp(1→和→3,4)Galp(1→中的5种以上，存在己糖-糖醛酸，己糖-己糖和脱氧己糖-己糖重复二糖片段中的一个或多个。
6.根据权利要求1或2所述的多糖，其特征在于，所述多糖的单糖组成包括鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。
7.权利要求1所述多糖的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：
(1)将虾夷扇贝内脏干粉于无水乙醇和正己烷1:2体积比混合溶液中搅拌0.5-2小时，静置过夜，除去脂肪，将上层有机试剂去除并风干；
(2)向每10g风干的样品中加入5-10mL浓度为0.05mol/L的半胱氨酸-EDTA二钠溶液及25-40mL浓度为0.05mol/L，pH＝8的K2HPO4缓冲溶液，再向样品中加入相对于样品质量0.2-1.0％(m/m)的胰蛋白酶干粉,所述胰蛋白酶干粉的酶活≥250N.F.U/mg，37℃水浴震荡酶解4h之后加入相对于样品质量0.2-1.0％(m/m)的木瓜蛋白酶干粉,所述木瓜蛋白酶干粉的酶活≥2000U/mg，65℃水浴震荡酶解2-4h制得混合溶液；
(3)步骤(2)所述混合溶液冷却到室温，离心，转速4000r/min,时间10min,温度4℃，取上清液；
(4)向上清液中，对应1g步骤(2)风干的样品加入1.0-2.0mL3-13％的氯化十六烷基吡啶溶液，室温下放置24h后，离心，转速8000r/min，时间15min，温度20℃，取沉淀；
(5)每g沉淀溶解于1-2mL NaCl-乙醇混合溶液，该混合溶液为2.5-3.5mol/L NaCl和90-100％乙醇以体积比100:15混合所得溶液，再加入2.5-4mL 90-100％乙醇溶液，4℃放置8h以上，离心，转速6000-10000r/min，时间10-30min，取沉淀；
(6)每g沉淀用2-5mL 80％和95％乙醇洗1-4次后，用水溶解，使用1000-10000Da透析袋蒸馏水透析24小时以上；
(7)加入0.5-1.5％亚硫酸氢钠作保护剂，用HCl调节pH至2.0，在4℃离心7-20min，转速8000-12000r/min脱除蛋白，将上清液冻干得到虾夷扇贝内脏粗糖；
(8)虾夷扇贝内脏粗糖加样于0.25M NaCl平衡过的DEAE-纤维素柱，依次用0.25-0.75MNaCl溶液洗脱1-4个柱体积，收集洗脱部分，冻干；
(9)将步骤(8)所述冻干样品采用Sephadex G-100凝胶柱进行分离，用0.1-0.2M NaCl作为洗脱液，收集得到虾夷扇贝内脏多糖。
8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中的虾夷扇贝内脏包括虾夷扇贝的消化道，消化腺，性腺，肾和循环系统中的一种或多种。
9.权利要求1-6任一所述多糖在制备抗凝血药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-6任一所述多糖。
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