CN109053859B - 一种针对中性疏水性多肽的纯化方法 - Google Patents

一种针对中性疏水性多肽的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种针对中性疏水性多肽的纯化方法，主要解决现有对于中性疏水性多肽难以纯化，难以获得高纯度产品或者产品得率极低的问题。本发明纯化包括中性疏水性多肽的强弱分类概念，溶解方法的选择，色谱柱的选择，分析与制备流动相的选择以及洗脱收集的步骤。所述的中性疏水性多肽序列中含有Ala,Ile,Val,Leu原料的多肽；中性疏水性多肽的溶解方法可以选择六氟异丙醇或尿素中的一种溶解，也可以选择丙酮或异丁醇中的一种大量稀释震荡搅拌，经过硅藻土与硅胶填料不同配比做成的PE柱过滤得清液；色谱柱的选择为以硅胶键合的固定相填料的色谱柱或者以聚苯乙烯二乙烯苯为基质的固定相填料的色谱柱，分析与制备流动相的选择根据溶解方法的不同来选择特有的体系，并进行疏水性多肽的洗脱收集。

Description

一种针对中性疏水性多肽的纯化方法
技术领域
本发明涉及到多肽纯化技术领域，尤其涉及到针对中性疏水性多肽的纯化方法。
背景技术
生物活性多肽是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。 人体很多活性物质都是以肽的形式存在的。多肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应。多肽是涉及人体内多种细胞功能的重要物质。多肽可以合成细胞，并调节细胞的功能活动。肽在人体作为神经递质，传递信息。多肽可在人体作为运输工具，将人体所食的各种营养物质与各种维生素、生物素、钙及对人体有益的微量元素输送到人体各细胞、器官和组织。多肽是人体重要的生理调节物，它可全面调节人体生理功能，增强和发挥人体生理活性，它具有重要的生物学功能。多肽对人的细胞活性、功能活动、生命存在太重要了。所以，目前对于多肽的生产研究就显得尤为重要。
目前对于多肽的纯化我们都有一定的了解，常规亲水性的多肽也有很好的纯化方法，得到很高的产品是收率。但是对于疏水性的多肽，尤其是多半含有Ala,Ile,Val原料的中性疏水性多肽，目前仍然会存在因为没有办法完全溶解多肽而无法纯化，或者是因为选择的溶解方法亦或是流动相的不同，造成中性疏水性多肽的收率极低，甚至无法达到高纯度的要求。现今中性疏水性多肽的溶解方法多数选择DMSO或者强酸强碱之类，但是DMSO黏度过大基本上很难使多肽吸附在色谱柱上，强酸强碱溶解的多肽不仅会降低色谱柱的使用寿命，而且大部分多肽会被强酸强碱带出色谱柱而造成极少量的洗脱分离。现有技术领域有选择正相色谱进行疏水性多肽的分离，但是正相色谱的分离效果很差，色谱柱的选择性也有局限，对于获得高纯的中性疏水性多肽有很大的难度。
本发明的提出为了解决现有的缺陷，针对性的解决目前针对中性疏水性多肽难纯化的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中性疏水性多肽的纯化方法，有针对性的解决中性疏水性多肽难纯化，难以获得高纯度的产品或者纯化收率极低的技术问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种针对中性疏水性多肽的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：
1.定义中性疏水性多肽的强弱性，分类如下：
1）多肽序列中含有Ala,Ile,Val,Leu疏水性氨基酸的个数占有30-50%，定义为弱中性疏水性多肽；
2）肽序列中含有Ala,Ile,Val,Leu疏水性氨基酸的个数占有50-100%，定义为强中性疏水性多肽。
2.根据中性疏水性多肽的强弱性选择不同的溶解方法，方法如下：
1）弱中性疏水性多肽：选择丙酮或异丁醇中的一种大量稀释震荡搅拌，经过硅藻土与硅胶填料不同配比做成的PE柱过滤得清液；
2）强中性疏水性多肽：选择六氟异丙醇或尿素中的一种溶解，经过硅藻土与硅胶填料不同配比做成的PE柱过滤得清液。
3.根据选择不同的溶解方法选择不同的分析与制备的流动相体系，如下：
1）使用丙酮大量稀释震荡搅拌，过硅藻土与硅胶填料的配比为4:1做成的PE柱，过滤得清液的溶解方法，选择丙酮和高氯酸水溶液做为流动相，其中A相为纯丙酮溶液，B相为含有0.15%质量百分浓度的高氯酸水溶液，线性梯度10-65%；
2）使用异丁醇大量稀释震荡搅拌，过硅藻土与硅胶填料的配比为3:2做成的PE柱，过滤得清液的溶解方法，选择异丁醇和硫酸铵水溶液做为流动相，其中A相为纯异丁醇溶液，B相为含有0.18%质量百分浓度的硫酸铵水溶液，线性梯度12-70%；
3）使用六氟异丙醇溶解多肽，过硅藻土与硅胶填料的配比为4:3做成的PE柱，过滤得清液的溶解方法，选择三氟乙醇和盐酸水溶液做为流动相，其中A相为纯三氟乙醇溶液，B相为含有0.05%质量百分浓度的盐酸水溶液，线性梯度10-60%；
4）使用尿素溶解多肽，过硅藻土与硅胶填料的配比为1:4做成的PE柱，过滤得清液的溶解方法，选择乙腈和尿素水溶液做为流动相，其中A相为纯乙腈溶液，B相为含有0.02%质量百分浓度的尿素水溶液，线性梯度8-65%。
4.根据选择不同的分析与制备的流动相体积，确定合适的色谱柱：
1) 丙酮和高氯酸水溶液做为流动相体系，色谱柱选择以普通硅胶键合的固定相填料的色谱柱C18，孔径选择300A；
2）异丁醇和硫酸铵水溶液做为流动相体系，色谱柱选择以普通硅胶键合的固定相填料的色谱柱C8或C4，孔径选择300A；
3）三氟乙醇和盐酸水溶液做为流动相体系，色谱柱选择以聚苯乙烯二乙烯苯为基质的固定相填料的色谱柱（C18），孔径选择120A；
4）乙腈和尿素水溶液做为流动相体系，色谱柱选择以聚苯乙烯二乙烯苯为基质的固定相填料的色谱柱（C18），孔径选择300A。
5.确立好特定的纯化条件之后，对中性疏水性多肽进行洗脱收集，步骤如下：
1）配比硅藻土与硅胶填料不同比例的PE柱；
2）选择试剂溶解多肽样品，并使用相应的PE柱过滤得上清液，备用；
3）选择的流动相体系冲洗仪器与色谱柱，使整个系统达到平衡状态；
4）取上清液注入制备系统，通过仪器检测器信号采集收集样品，得中间体液体；
5）对中间体液体进行分析，确立纯度；
6）把合格的中间体液体过三氟醋酸盐树脂，得到常规的含有TFA盐的多肽产品；
7）对TFA样的多肽产品直接进行液氮冷冻；
8）把冷冻好的多肽产品进行低温冷冻干燥机干燥得固体粉末状成品。
本发明的有益效果是：
1.针对性的解决不同类型的中性疏水性多肽的溶解方法，因着不同的溶解方法而确立不同的纯化条件，可以有效的解决中性疏水性多肽收率极低的问题，降低了生产成本，并且具体可靠的操作性。
2.选用硅藻土与硅胶填料不同配比做成的PE柱作为过滤装置，一方面硅藻土对于疏水性的多肽有很好的过滤作用，另一方面硅胶填料对于选择的这些强极性溶剂溶解样品有一个很好的缓释作用，可以使制备时强极性溶剂对于色谱柱的伤害降到最低。这种混合装置做成的PE柱既简单易得，又对制备起到很好的预处理作用。
3.有效的解决目前纯化方法的局限性，对于多肽的纯化方法反相高效液相的分离效果是最好的，毕竟正相色谱对于多肽的分离度很差，不适合用于大规模多肽的分离制备。而本发明对于体系的优化选择，既适用于反相高效液相的分离，又可以使中性疏水性多肽在反相高效液相色谱的分离中获得高纯度产品。
附图说明
图1为本发明实施例1中间液体制备色谱图。
图2为本发明实施例1中间液体纯度确定液相色谱图。
图3为本发明实施例2中间液体制备色谱图。
图4为本发明实施例2中间液体纯度确定液相色谱图。
图5为本发明实施例3中间液体制备色谱图。
图6为本发明实施例3中间液体纯度确定液相色谱图。
图7为本发明实施例4中间液体制备色谱图。
图8为本发明实施例4中间液体纯度确定液相色谱图。
具体实施方式
实施例1
1.以弱中性疏水性多肽序列KDLL KDLL KDLL KDLL为例，具体实施步骤如下：
1）称取300mg多肽样品，加入30ml丙酮大量稀释震荡搅拌澄清，过硅藻土40g硅胶填料10g的PE柱，过滤得清液，备用。
2）配比丙酮和高氯酸水溶液做为流动相，其中A相为纯丙酮溶液，B相为含有0.15%质量百分浓度的高氯酸水溶液。
3）色谱柱选择以普通硅胶键合的固定相填料的色谱柱C18，直径30mm，长度250mm，孔径选择300A；高压泵流速设定30ml/min，检测器波长220nm。
4）用纯甲醇冲洗色谱柱和仪器30-50min，直至系统无其他流动相的残留。
5）用配比好的丙酮和高氯酸水溶液平衡整个系统20-40min。
6）设定线性梯度丙酮的质量浓度变化从10%到65%，时间为30min。
7）对样品进行收集，得中间体液体。（图1）。
8）对中间体液体进行分析确定纯度。（图2）。
9）把确定好纯度的多肽样品液体直接进行液氮冷冻，上低温冷冻干燥机进行冷冻的粉末状固体多肽产品。
10）计算产品收率为58%。
实施例2
1.以弱中性疏水性多肽序列IIREEIIRIIRECQIIC为例，具体实施步骤如下：
1）称取500mg多肽样品，加入40ml异丁醇大量稀释震荡搅拌，过硅藻土30g硅胶填料20g的PE柱，过滤得清液，备用。
2）配比异丁醇和硫酸铵水溶液做为流动相，其中A相为纯异丁醇溶液，B相为含有0.18%质量百分浓度的硫酸铵水溶液。
3）色谱柱选择以普通硅胶键合的固定相填料的色谱柱C8（或C4），直径40mm，长度300mm，孔径选择300A；高压泵流速设定40ml/min，检测器波长220nm。
4）用纯甲醇冲洗色谱柱和仪器30-50min，直至系统无其他流动相的残留。
5）用配比好的异丁醇和硫酸铵水溶液平衡整个系统20-40min。
6）设定线性梯度异丁醇的质量浓度变化从12%到70%，时间为40min。
7）对样品进行收集，得中间体液体。（图3）。
8）把中间体液体过200g的三氟乙酸树脂，得到含有三氟乙酸盐的样品液体。
9）对含有三氟乙酸盐的样品液体进行分析确定纯度。（图4）。
10）把确定好纯度的多肽样品液体直接进行液氮冷冻，上低温冷冻干燥机进行冷冻的粉末状固体多肽产品。
11）计算产品收率为62%。
实施例3
1.以强中性疏水性多肽序列VFVVFVVFVVVFVVHVVD为例，具体实施步骤如下：
1）称取500mg多肽样品，加入10ml六氟异丙醇充分溶解多肽，过硅藻土20g硅胶填料15g的PE柱，过滤得清液，备用。
2）配比三氟乙醇和盐酸水溶液做为流动相，其中A相为纯三氟乙醇溶液，B相为含有0.05%质量百分浓度的盐酸水溶液。线性梯度10-60%。
3）以聚苯乙烯二乙烯苯为基质的固定相填料的色谱柱（C18），直径30mm，长度250mm，孔径选择120A。高压泵流速设定35ml/min，检测器波长220nm。
4）用纯甲醇冲洗色谱柱和仪器30-50min，直至系统无其他流动相的残留。
5）用配比好的三氟乙醇和盐酸水溶液平衡整个系统20-40min。
6）设定线性梯度三氟乙醇的质量浓度变化从10%到60%，时间为35min。
7）对样品进行收集，得中间体液体。（图5）。
8）对中间体液体进行分析确定纯度。（图6）。
9）把确定好纯度的多肽样品液体直接进行液氮冷冻，上低温冷冻干燥机进行冷冻的粉末状固体多肽产品。
10）计算产品收率为55%。
实施例4
1.以强中性疏水性多肽序列AAAAAAAAAAAA为例，具体实施步骤如下：
1）称取300mg多肽样品， 加入8ml尿素溶液充分溶解多肽，过硅藻土5g硅胶填料20g的PE柱，过滤得清液，备用。
2）配比乙腈和尿素水溶液做为流动相，其中A相为纯乙腈溶液，B相为含有0.02%质量百分浓度的尿素水溶液。
3）以聚苯乙烯二乙烯苯为基质的固定相填料的色谱柱（C18），直径30mm，长度250mm，孔径选择300A。高压泵流速设定30ml/min，检测器波长220nm。
4）用纯甲醇冲洗色谱柱和仪器30-50min，直至系统无其他流动相的残留。
5）用配比好的乙腈和尿素水溶液平衡整个系统20-40min。
6）设定线性梯度乙腈的质量浓度变化从8%到65%，时间为40min。
7）对样品进行收集，得中间体液体。（图7）。
8）把中间体液体过200g的三氟乙酸树脂，得到含有三氟乙酸盐的样品液体。
9）对含有三氟乙酸盐的样品液体进行分析确定纯度。（图8）。
10）把确定好纯度的多肽样品液体直接进行液氮冷冻，上低温冷冻干燥机进行冷冻的粉末状固体多肽产品。
11）计算产品收率为48%。

Claims (6)

1.一种针对中性疏水性多肽的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、定义中性疏水性多肽的强弱性：
1）多肽序列中含有Ala,Ile,Val,Leu疏水性氨基酸的个数占有30-50%，定义为弱中性疏水性多肽；
2）多肽序列中含有Ala,Ile,Val,Leu疏水性氨基酸的个数占有50-100%，定义为强中性疏水性多肽；
b、根据中性疏水性多肽的强弱性选择不同的溶解方法：
1）针对弱中性疏水性多肽：选择丙酮或异丁醇中的一种大量稀释震荡搅拌，经过硅藻土与硅胶填料不同配比做成的PE柱过滤得清液；
2）针对强中性疏水性多肽：选择六氟异丙醇或尿素中的一种溶解，经过硅藻土与硅胶填料不同配比做成的PE柱过滤得清液；
c、根据选择不同的溶解方法选择不同的分析与制备的流动相体系：
1）丙酮大量稀释震荡搅拌，过硅藻土与硅胶填料的配比为4:1做成的PE柱，过滤得清液的溶解方法，选择丙酮和高氯酸水溶液做为流动相；
2）异丁醇大量稀释震荡搅拌，过硅藻土与硅胶填料的配比为3:2做成的PE柱，过滤得清液的溶解方法，选择异丁醇和硫酸铵水溶液做为流动相；
3）六氟异丙醇溶解多肽，过硅藻土与硅胶填料的配比为4:3做成的PE柱，过滤得清液的溶解方法，选择三氟乙醇和盐酸水溶液做为流动相；
4）尿素溶解多肽，过硅藻土与硅胶填料的配比为1:4做成的PE柱，过滤得清液的溶解方法，选择乙腈和尿素水溶液做为流动相；
d、根据选择不同的分析与制备的流动相体积，确定合适的色谱柱：
1) 丙酮和高氯酸水溶液做为流动相体系，色谱柱选择以普通硅胶键合的固定相填料的色谱柱C18，孔径选择300A；
2）异丁醇和硫酸铵水溶液做为流动相体系，色谱柱选择以普通硅胶键合的固定相填料的色谱柱C8或C4，孔径选择300A；
3）三氟乙醇和盐酸水溶液做为流动相体系，色谱柱选择以聚苯乙烯二乙烯苯为基质的固定相填料的色谱柱C18，孔径选择120A；
4）乙腈和尿素水溶液做为流动相体系，色谱柱选择以聚苯乙烯二乙烯苯为基质的固定相填料的色谱柱C18，孔径选择300A；
e、确立好纯化条件之后，对中性疏水性多肽进行洗脱收集，步骤如下：
1）配比硅藻土与硅胶填料不同比例的PE柱；
2）选择试剂溶解多肽样品，并使用相应的PE柱过滤得上清液，备用；
3）选择的流动相体系冲洗仪器与色谱柱，使整个系统达到平衡状态；
4）取上清液注入制备系统，通过仪器检测器信号采集收集样品，得中间体液体；
5）对中间体液体进行分析，确立纯度；
6）把合格的中间体液体过三氟醋酸盐树脂，得到常规的含有TFA盐的多肽产品；
7）对TFA样的多肽产品直接进行液氮冷冻；
8）把冷冻好的多肽产品进行低温冷冻干燥机干燥得固体粉末状成品。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：选择使用硅藻土与硅胶填料不同配比做成的PE柱作为过滤装置。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：丙酮和高氯酸水溶液做为流动相，其中A相为纯丙酮溶液，B相为含有0.15%质量百分浓度的高氯酸水溶液，线性梯度10-65%。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：异丁醇和硫酸铵水溶液做为流动相，其中A相为纯异丁醇溶液，B相为含有0.18%质量百分浓度的硫酸铵水溶液，线性梯度12-70%。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：三氟乙醇和盐酸水溶液做为流动相，其中A相为纯三氟乙醇溶液，B相为含有0.05%质量百分浓度的盐酸水溶液，线性梯度10-60%。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：乙腈和尿素水溶液做为流动相，其中A相为纯乙腈溶液，B相为含有0.02%质量百分浓度的尿素水溶液，线性梯度8-65%。
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