CN109045312A - 放射氟化方法 - Google Patents
放射氟化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109045312A CN109045312A CN201811135640.8A CN201811135640A CN109045312A CN 109045312 A CN109045312 A CN 109045312A CN 201811135640 A CN201811135640 A CN 201811135640A CN 109045312 A CN109045312 A CN 109045312A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- agent
- tacn
- peptide
- btm
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/0474—Organic compounds complexes or complex-forming compounds, i.e. wherein a radioactive metal (e.g. 111In3+) is complexed or chelated by, e.g. a N2S2, N3S, NS3, N4 chelating group
- A61K51/0482—Organic compounds complexes or complex-forming compounds, i.e. wherein a radioactive metal (e.g. 111In3+) is complexed or chelated by, e.g. a N2S2, N3S, NS3, N4 chelating group chelates from cyclic ligands, e.g. DOTA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/082—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the peptide being a RGD-containing peptide
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/085—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the peptide being neurotensin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及通过氟与非放射性金属的大环金属络合物的连接,用18F标记生物分子的方法,其中金属络合物缀合到生物分子。本发明还提供体内成像的药物组合物、试剂盒和方法。
Description
本申请是申请日为2013年1月22日,申请号为201380015583.9,发明名称为“放射氟化方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及通过氟与非放射性金属的大环金属络合物的连接,用18F标记生物分子的方法,其中金属络合物缀合到生物分子。本发明还提供体内成像的药物组合物、试剂盒和方法。
背景技术
为得到适用于体内成像的放射示踪剂,18F放射性标记生物分子为持续受关注的领域[Schirrmacher等Mini-Rev.Org.Chem., 4(4), 317-329 (2007)]。虽然有很多方法用18F直接(单步)标记小分子,但这些方法一般不适用于应用于肽(和较大的大分子)。氨基酸(例如,赖氨酸和精氨酸)的存在使得通过亲核取代结合氟化物的标准策略困难,这是由于:
(i)氟化物和这些氨基酸官能体之间的氢键相互作用,从而减小氟化物离子的亲核性;和/或
(ii)需要使用较高温度,这可导致肽/蛋白质结构降解或破坏。
改进的放射氟化方法的无机化学途径已由Smith等综述[Dalton Trans., 40,6196-6205 (2011)]。
WO 2009/079024(McBride等)公开用18F标记分子的“无机”方法,所述方法包括:
a)使18F与金属反应,以形成18F金属络合物;和
b)使18F金属络合物连接到分子,以形成要给予受试者的一个或多个18F标记分子。
WO 2009/079024教导,用于金属络合物的适合金属选自铝、镓、铟、镥和铊。
WO 2009/079024的实施例3提供螯合物-肽缀合物IMP 272的各种金属络合物的18F标记:
DOTA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2
IMP 272
其中DOTA=1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸,
HSG=组胺琥珀酰氨基乙酰基。
报告的18F放射性标记结果为:铟(24%)、镓(36%)、锆(15%)、镥(37%)和钇(2%)。
WO 2011/068965公开用18F或19F标记分子的方法,所述方法包括使18F或19F和第IIIA族金属的络合物连接到螯合部分,其中螯合部分缀合到分子,或者螯合部分以后缀合到分子。WO 2011/068965说明,第IIIA族金属(铝、镓、铟和铊)适用于F结合,但铝是优选的。
McBride等随后报告[J.Nucl.Med., 50(6), 991-998 (2009), 994页],Ga、In、Zr、Lu和Y不结合IMP 272肽和铝络合物,并且替代金属(Ga、In、Zr、Lu和Y)的金属络合物在水中不稳定。
更近来的公开文献已集中在铝作为所选金属,因为铝-氟化物键是最强的金属-氟化物键之一,并且AlFn络合物在体内稳定,并优化所用铝螯合剂[McBride等, Bioconj.Chem., 21(7), 1331-1340 (2010); Bioconj.Chem., 22, 1793-1803 (2011)和Appl.Rad.Isot., 70, 200-204 (2012)]。优选的螯合剂基于NODA系统,其中NODA-MPAEM用于缀合到生物分子:
然而,WO 2009/079024、WO 2011/068965和相关公布的现有技术方法确实有一些缺点:
(a)形成Al-18F键的动力学需要用较高温度用于18F放射性标记,而很多生物分子为温度敏感性;
(b)由于需要避免铝水解,18F放射性标记这些金属络合物的pH范围(pH 3.8至4.2)相对较窄。由于酸敏感不稳定性或聚集的风险,这将与所有的生物分子不相容。
因此,仍需要替代性18F放射性标记方法,其允许在温和条件下(例如,温度和pH)有效放射性氟化一定范围生物分子。这些方法理想适用于水性条件,因为18F一般可作为水溶液得到,并且一些生物分子可能不耐受有机溶剂。在水性或主要水性条件下进行标记的能力排除对干燥[18F]氟化物的需要,干燥氟化物一般是涉及“亲核取代”的传统18F化学所需的。这具有可通过减少过程步骤进一步简化18F方法化学过程的益处。减少过程步骤,特别是减少放射合成时间,具有使由于放射性衰变导致的产出损失最大限度地减小的益处。
发明内容
本发明提供一种放射性标记生物分子(特别是肽)的通用方法:
(i)在较低温度(优选室温);
(ii)在水性(或主要水性)条件;
(iii)在一定pH范围,pH可调节或适应以匹配肽的性质;
(iv)其中18F标记的剂显示高体内稳定性。
本发明人已发现,选择金属离子和螯合物支架二者均对设计高亲合性氟化物结合剂关键。本发明的金属离子和金属络合物有数个优点:
(a)金属离子对氟化物在水中和在中等pH显示高亲合性;
(b)金属中心具有优选的配位数和有限的氧化还原能力,这简化物类形成和化学组成;
(c)由氟化物离子代替的配位体的取代动力学快得足以(足够完全)在可利用时间内接纳氟化物(基于18F的半衰期),但得到的金属氟化物键强得足以使结合金属的氟化物不容易在纯化中或在体内损失;
(d)用于18F标记的前体是可容易合成和纯化的单一明确的物类。
本发明的金属络合物的以上特性意味所关注的非放射性金属络合物可缀合到生物靶向部分,并且在18F放射氟化步骤之前根据需要纯化。由于上述原因,这比起现有技术方法有利。
本发明人已发现,对于本发明中所述螯合物系统的金属络合物,镓和铟络合物比它们的铝对应物更适用。对于本发明中所述的螯合物结构,Ga(III)和In(III)氯化物络合物比它们的Al(III)类似物显著地更水解稳定。另外,在室温在MeCN和H2O两种溶剂中用四烷基氟化铵作为F-源形成Ga(III)和In(III)氟化物络合物,或者使用水性KF作为F-源,并且水解稳定。相比之下,在室温利用Al(III)络合物用四烷基氟化铵作为F-源在纯MeCN中不发生氯化物/氟化物交换。这是Ga(III)和Al(III)络合物之间的反应性上的重要差异,并且相信可能是由于Al(III)相对于Ga(III)较小的离子半径。
发明详述
在第一方面,本发明提供一种成像剂,所述成像剂包含式I的18F标记化合物:
(I)
其中:
Y1和Y2独立为O或NR1,
X1、X2和X3独立为Br、Cl、19F或18F,
条件为X1、X2和X3中至少之一为18F,
x、y和z独立为0、1或2;
M为Al3+、Ga3+、In3+、Sc3+、Y3+、Ho3+、Er3+、Tm3+、Yb3+或Lu3+;
R1为C1-3烷基或-CH2-Ar1,其中Ar1为C5-12芳基或C3-12杂芳基;
R2为R1或Q;
Q为-L-[BTM],并且可存在或不存在,当存在时,为R2或为连接到-(CH2)(CH2)x-、-(CH2)(CH2)y-或-(CH2)(CH2)z-基团的碳原子之一;
L为式-(A)m-的合成连接基,其中各个A独立为-CR2-、-CR=CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-CR=N-O-、-NR(C=O)NR-、-NR(C=S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基、C4-8环亚烷基、-Ar-、-NR-Ar-、-O-Ar-、-Ar-(CO)-、氨基酸、糖或单分散聚乙二醇(PEG)结构单元,
其中各个R独立选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟烷基;
m为值1至20的整数;
各个Ar独立为C5-12亚芳基或C3-12杂亚芳基;
BTM为生物靶向部分。
第一方面的成像剂包括非放射性三价金属离子(M)的金属络合物,即,其中金属处于M(III)氧化态。术语“金属络合物”是指非放射性金属的配位络合物。优选的这些络合物包括螯合剂。本发明的适合非放射性金属(M)包括铝、镓、铟、钪、钇、钬、铒、铽、镱或镥。
术语“成像剂”是指适用于哺乳动物身体成像的化合物。优选哺乳动物为完整的哺乳动物身体体内,更优选为人受试者。可优选将成像剂以最低侵入方式给予哺乳动物体,即,在专业医学技能下进行时对哺乳动物受试者没有实质健康风险。这种最低侵入给药优选静脉内给药到所述受试者的外周血管中,而不需要局部或全身麻醉。
本文所用术语“体内成像”是指非侵入性产生哺乳动物受试者内部面貌的全部或部分的图像的那些技术。本发明的优选成像技术为正电子发射层析成像(PET)。
术语“包含”在整个本申请中具有其常规意义,并且表示所述剂或组合物必须具有所列的基本成分或组分,但也可另外存在其它成分或组分。术语“包含”包括“基本由…组成”作为优选的子集,“基本由…组成”是指组合物具有所列的组分,而没有其它成分或组分存在。
术语“生物靶向部分”(BTM)是指给药后在哺乳动物身体体内的特定部位选择性吸收或定位的化合物。这些部位可例如涉及特定疾病状态或指示器官或代谢过程如何工作。
当Q不存在时,R2为R1基团。当Q存在时,为R2或为在-(CH2)(CH2)x-、-(CH2)(CH2)y-或-(CH2)(CH2)z-基团的碳原子之一处的主链取代基。例如,当x=1时,具有Q取代基的-(CH2)(CH2)x-基团可以为-(CHQ)(CH2)-或-(CH2)(CHQ)-。
优选实施方案
Q优选存在。更优选Q存在,并且R2=Q。
BTM可为合成或天然来源的,但优选为合成的。术语“合成”具有其常规意义,即人造,与从天然来源(例如从哺乳动物身体)分离相对。此类化合物的优点是可完全控制其制造和杂质分布。因此,天然来源的单克隆抗体及其片段在本文所用术语“合成”的范围外。BTM的分子量优选最高30,000道尔顿。更优选分子量在200至20,000道尔顿的范围内,最优选300至18,000道尔顿,400至16,000道尔顿尤其优选。当BTM为非肽时,BTM的分子量优选为最高3,000道尔顿,更优选200至2,500道尔顿,最优选300至2,000道尔顿,400至1,500道尔顿尤其优选。
生物靶向部分优选包括:3至100聚肽、肽类似物、拟肽或肽模拟物,其可以为线形或环状肽或它们的组合;单氨基酸;酶底物;酶拮抗剂、酶激动剂(包括部分激动剂)或酶抑制剂;受体结合化合物(包括受体底物、拮抗剂、激动剂或底物);寡核苷酸或寡DNA或寡RNA片段。酶和/或受体优选对哺乳动物受试者为内源性。
术语“肽”是指包含由肽键(即,将一个氨基酸的胺连接到另一个氨基酸的羧基的酰胺键)连接的两个或更多个如下限定的氨基酸的化合物。术语“肽模拟物”或“模拟物”是指以下生物活性化合物:其模拟肽或蛋白质的生物活性,但化学性质上不再是肽,即它们不再包含任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)。在本文中,术语肽模拟物以较宽意义使用,包括性质上不再完全为肽的分子,如假肽、半肽和拟肽。术语“肽类似物”是指包含一个或多个下述氨基酸类似物的肽。也见于“Synthesis of Peptides and Peptidomimetics”(肽和肽模拟物的合成), M. Goodman等, Houben-Weyl E22c, Thieme。
术语“氨基酸”是指L-或D-氨基酸、氨基酸类似物(例如,萘基丙氨酸)或氨基酸模拟物,其可天然存在或为纯合成来源,并且可为光学纯(即,单一对映异构体并因此为手性)或对映异构体的混合物。在本文中使用氨基酸的常规3字母缩写或单字母缩写。优选本发明的氨基酸为光学纯。术语“氨基酸模拟物”是指天然产生的氨基酸的合成类似物,其为等构物,即已设计成模拟天然化合物的立体和电子结构。此类等构物为本领域的技术人员所熟悉,包括但不限于酯肽、逆反转(retro-inverso)肽、硫代酰胺、环烷烃或1,5-二取代的四唑[见M. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)]。已知放射性标记的氨基酸例如酪氨酸、组氨酸或脯氨酸可用于体内成像剂。
在BTM为酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂、酶抑制剂或受体-结合化合物时,优选其为非肽,更优选是合成的。术语“非肽”是指不含任何肽键(即,两个氨基酸残基之间的酰胺键)的化合物。适合的酶底物、拮抗剂、激动剂或抑制剂包括葡萄糖和葡萄糖类似物、脂肪酸或弹性蛋白酶、血管紧张素II或金属蛋白酶抑制剂。酶底物、拮抗剂、激动剂或抑制剂的酶优选对哺乳动物受试者为内源性。适合的合成受体结合化合物包括雌二醇、雌激素、黄体酮、孕酮和其他类固醇激素;多巴胺D-1或D-2受体的配体,或多巴胺转运体,如莨菪烷;和5-羟色胺受体的配体。受体结合化合物的受体优选对哺乳动物受试者为内源性。
BTM最优选为3-100聚肽或肽类似物。在BTM为肽时,优选为4-30聚肽,最优选5至28聚肽。
在BTM为酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂或酶抑制剂时,优选本发明的这些生物靶向分子是合成的类似药的小分子,即药物分子。优选的多巴胺转运体配体如莨菪烷、脂肪酸、多巴胺D-2受体配体、苯甲酰胺、苯丙胺、苄基胍、碘西尼、苯并呋喃(IBF)或马尿酸。莨菪烷剂由Morgan和Nowotnik描述[Drug News Perspect., 12(3), 137-145 (1999)]。
在BTM为肽时,优选此类肽包括:
- 生长抑素、奥曲肽和类似物,
- 结合到ST受体的肽,其中ST指由大肠杆菌和其他微生物产生的热稳定毒素;
- 铃蟾肽;
- 血管活性肠肽;
- 神经降压素;
- 层粘连蛋白片段,例如YIGSR、PDSGR、IKVAV、LRE和KCQAGTFALRGDPQG,
- 用于白细胞积累的靶向部位的N-甲酰基趋化肽,
- 血小板因子4(PF4)及其片段,
- 含RGD(Arg-Gly-Asp)的肽,可例如靶向血管生成[R.Pasqualini等, NatBiotechnol. 1997 Jun; 15(6): 542-6]; [E. Ruoslahti, Kidney Int. 1997 May; 51(5): 1413-7],
- α2-抗纤溶酶、纤连蛋白或β-酪蛋白、纤维蛋白原或血小板反应蛋白的肽片段。α2-抗纤溶酶、纤连蛋白、β-酪蛋白、纤维蛋白原和血小板反应蛋白的氨基酸序列可见于以下参考文献:α2-抗纤溶酶前体[M.Tone等, J.Biochem, 102, 1033, (1987)];β-酪蛋白[L.Hansson等, Gene, 139, 193, (1994)];纤连蛋白[A.Gutman等, FEBS Lett. , 207,145, (1996)];血小板反应蛋白-1前体[V.Dixit等, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83,5449, (1986)];R.F.Doolittle, Ann. Rev. Biochem. , 53, 195, (1984);
- 为血管紧张素的底物或抑制剂的肽,例如血管紧张素II Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(E. C. Jorgensen等, J. Med. Chem. , 1979, Vol 22, 9, 1038-1044)
[Sar, Ile]血管紧张素II:Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile(R.K. Turker等,Science, 1972, 177, 1203)。
- 血管紧张素I:Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu。
优选的BTM肽为RGD肽。更优选的此类RGD肽包括片段:
在BTM为肽时,最优选的此类RGD肽为式(A)的肽:
其中X1为–NH2或
其中a为1至10的整数。
在式A中,a优选为1。
在BTM为肽时,肽的一个或两个末端(优选两个末端)已缀合到代谢抑制基(MIG)。具有以此方式保护的两个肽末端对体内成像应用重要,因为否则预料会快速代谢,随之对BTM肽的选择性结合亲和性有损失。术语“代谢抑制基”(MIG)是指抑制或阻止BTM肽在氨基末端或羧基末端的酶(尤其是肽酶,如羧肽酶)代谢的生物相容基团。此类基团对体内应用特别重要,并且为本领域的技术人员所熟悉,对于肽胺末端,所述基团适合选自:
N-酰化基团-NH(C=O)RG,其中酰基-(C=O)RG具有选自C1-6烷基、C3-10芳基的RG,或者包括聚乙二醇(PEG)结构单元。以下关于连接基(L1)描述适合的PEG基团。优选的这些PEG基团为式Bio1或Bio2(以下)的生物改性剂。优选的此类氨基末端MIG基团为乙酰基、苄基氧基羰基或三氟乙酰基,最优选乙酰基。
用于肽羧基末端的适合代谢抑制基包括甲酰胺、叔丁酯、苄酯、环己酯、氨基醇或聚乙二醇(PEG)结构单元。对于BTM肽的羧基末端氨基酸残基适合的MIG基团,其中氨基酸残基的末端胺用C1-4烷基(优选甲基)N-烷基化。优选此类MIG基团为甲酰胺或PEG,最优选此类基团为甲酰胺。
当连接基(L)包括1至10个氨基酸残基的肽链时,氨基酸残基优选选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。当L包括PEG部分时,优选包括衍生自式Bio1或Bio2的单分散类PEG结构的低聚反应的单元:
式Bio1的17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七烷酸
其中p为1至10的整数。或者,可使用基于式Bio2的丙酸衍生物的类PEG结构:
其中p如对式Bio1所限定,q为3至15的整数。
在式Bio2中,p优选为1或2,并且q优选为5至12。
当连接基不包括PEG或肽链时,优选的L基团具有组成-(A)m-部分的连接原子的主链,-(A)m-部分有2至10个原子,最优选2至5个原子,2或3个原子尤其优选。
不能购得的BTM肽可通过固相肽合成法合成,如描述于P. Lloyd-Williams, F.Albericio和E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides andProteins(合成肽和蛋白质的化学方法), CRC Press, 1997。
在一个优选的实施方案中,第一方面的剂为式IA:
(IA)
其中M、Q及其优选的方面如对式I限定。
在式I和IA的剂中,优选Y1和Y2至少之一为NR1,更优选Y1=Y2=NR1。在式I和IA的剂中,x、y和z分别优选为1。更优选x=y=z=1。
在式I和IA的剂中,R1优选为-CH3或–CH2C6H5,更优选-CH3。
在一个更优选的实施方案中,第一方面的剂为式IB:
(IB)
其中M、Q及其优选的方面如对式I限定。
在式I、IA和IB中,X1、X2和X3优选独立为Cl、19F或18F。更优选X1、X2和X3中的两个为19F,第三个为18F。
在式I、IA和IB中,M优选为Al3+、Ga3+、In3+、Sc3+或Y3+,更优选为Ga3+、In3+、Sc3+或Y3+,最优选为Ga3+或In3+,Ga3+是理想的。
优选成像剂以无菌形式提供,即,以适用于哺乳动物给药的形式提供,如第四方面(以下)中所述。
第一方面的成像剂可如第二方面(以下)中所述得到。
在第二方面,本发明提供制备第一方面的剂的方法,所述方法包括任选在[19F]氟化物存在下在适合的溶剂中使式II的前体与供应的[18F]氟化物或[18F]NaF反应:
(II)
其中M、Y1、Y2、Q、x、y和z及其优选的实施方案如对第一方面的式I、IA和IB所限定,并且X1a、X2a和X3a独立为Br或Cl。与式I一样,在式II中可存在或不存在Q。当式II中不存在Q时,R2为R1基团。
[18F]氟化物可:
I)直接从回旋加速器得到,并用离子交换管和适合的洗脱剂配制;或者
II)以GMP [18F]NaF形式产生于GMP设备上的自动平台中。
适用于放射性药物应用的[18F]氟化物的制备在本领域熟知,并已由Hjelstuen等[Eur.J.Pharm.Biopharm., 78(3), 307-313 (2011)]和Jacobson等[Curr.Top.Med.Chem., 10(11), 1048-1059 (2010)]综述。[18F]NaF可用“自动合成器” 制备,如第五方面(以下)中所述。
“适合的溶剂”包括乙腈、C1-4烷基醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二甲亚砜或它们的任何水性混合物或水。水性缓冲剂可用于4-8,更优选5-7的pH范围。优选的溶剂在性质上为水性,更优选为生物相容性载体溶剂,如第四方面中所限定(以下)。
19F载体(在使用时)可以为以下形式:
I)碱金属盐(例如,NaF、KF、CsF等);或
II)在“非金属反离子”存在下,例如,[R4N]F(其中R=烷基)、[Ar4P]F、[Ar3S]F;
III)金属穴状配体反离子,例如[K(穴状配体2.2.2)]F、[Na(穴状配体2.2.2)]F、[N(18-冠-6)]F等。
在式II的前体中,Q优选存在。为了制备优选的式IA和IB的剂,相应使用式IIA和IIB的前体:
在式II、IIA或IIB的前体中,优选X1a=X2a=X3a=Cl。
第二方面中使用的前体为非放射性。优选前体以无菌形式提供,以帮助以药物组合物形式制备成像剂,如第四方面(以下)中所述。
当Q不存在时,可通过常规金属配位化学,使用对双官能螯合物方法所述的类似金属络合条件,得到第二方面的前体。
当Q存在时,可通过双官能螯合物方法得到第二方面的前体。术语“双官能螯合物”具有其常规意义,是指具有与其共价连接的悬垂官能团的螯合剂。官能团用作反应活性部位以使螯合剂连接到BTM。双官能螯合物方法和相关合成已由Bartholoma等[Chem.Rev.,110(5), 2903-2920 (2010)]、Chakraborty等[Curr.Top.Med.Chem., 10(11), 1113-1134(2010)]和Brechbiel等[Quart.J.Nucl.Med.Mol.Imaging, 52(2), 166-173 (2008)]描述。本发明的官能团优选为胺、羧酸或经活化的酯,更优选为伯胺或经活化的酯。具有悬垂胺官能团的双官能螯合剂可缀合到BTM的羧基。具有羧基或经活化酯官能团的双官能螯合剂可缀合到BTM的胺基。
术语“经活化的酯”或“活性酯”是指被设计成为较佳离去基团,并因此允许与亲核体(如胺)更容易反应的相关羧酸的酯衍生物。适合活性酯的实例为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、磺基琥珀酰亚氨基酯、五氟苯酚、五氟苯硫酚、对硝基苯酚、羟基苯并三唑和PyBOP(即,苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸盐)。优选的活性酯为N-羟基琥珀酰亚胺或五氟苯酚酯,尤其N-羟基琥珀酰亚胺酯。
在具有羧基官能团的双官能螯合剂缀合到BTM的胺基时,使用活化剂。术语“活化剂”是指用于促进胺和羧酸之间偶合以产生酰胺的剂。适合的此类活化剂在本领域已知,包括碳二亚胺,例如EDC[N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺和N,N′-二烷基碳二亚胺,例如二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺;和三唑,例如HBTU[O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐]、HATU[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐]和PyBOP[苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基磷六氟磷酸盐]。此类活化剂可以购得。更多细节提供于March’s Advanced Organic Chemistry(马奇高等有机化学), 第5版, 508-510页, Wiley Interscience (2001)。优选的此类活化剂为EDC。
制备式II的前体的优选方法是通过用式III的螯合剂或螯合剂-BTM缀合物形成金属络合物,其中Q可存在或不存在:
(III)
其中Y1、Y2、Q3、x、y和z及其优选的实施方案如第一方面(以上)中所述。
在式III中,Q优选以第一方面(以上)中所述Q的优选实施方案存在。
式III的螯合剂和螯合剂缀合物可通过文献方法制备。Sakamoto等[J.Org.Chem., 51, 4974 (1986)]公开具有NO2供体组的此类螯合剂的合成。具有NO2供体组的式III的螯合剂,例如1,4-二氮杂-7-氧杂-环壬烷,由Hancock等[J. Am. Chem. Soc., 104,291-292 (1982)]和Sessler等[Tetrahedron, 49(39), 8727–8738 (1993)]描述。
较大环尺寸的N3供体大环(及其N-甲基衍生物)描述于Macrocycle Synthesis a Practical Approach(大环合成:实用方法), Ed. D. Parker, OUP, 1996, p 20及其中的参考文献。
在式III内优选的螯合剂-BTM缀合物为式IIIA:
(IIIA)
式IIIA的螯合剂-BTM缀合物可用与McBride等[Bioconj.Chem., 21(7), 1331-1340(2010); Bioconj.Chem., 22, 1793-1803 (2011)和Appl.Rad.Isot., 70, 200-204(2012)]类似的化学反应制备,例如:
原料1,4-二甲基-tacn可通过Wieghardt等[Inorg.Synth., 32, 75-81 (1998);Z.Anorg.Allg.Chem., 608, 60-68 (1992)]的方法获得。Tacn和Me3-tacn可以购得。Me3-tacn也可通过Wieghardt等[Inorg Chem., 21, 3086 (1982)]的方法得到。N-官能化tacn螯合剂可通过Martin等[J. Org. Chem., 47, 412 (1982)]或Mahapatra等[J.Am. Chem.Soc., 118, 11555 (1996)]的方法得到。主链-官能化tacn螯合剂由Kuppers等[Inorg.Chem., 25, 2400 (1986)]描述。
在第三方面,本发明提供如第二方面中限定的式IIA或IIB的前体,其中Q包括BTM,选自3-100聚肽、酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂、酶抑制剂或受体结合化合物。
在第三方面中式IIA或IIB的前体的优选方面如本发明的第二方面(以上)中所述。在第三方面中Q基团和BTM的优选方面如本发明的第一方面(以上)中所述。
第三方面的前体优选为下面限定的“适用于哺乳动物给药的形式”,最优选冻干形式。
在第四方面,本发明提供一种放射性药物组合物,所述放射性药物组合物包含第一方面的成像剂,以及适用于哺乳动物给药形式的生物相容性载体。
第四方面中成像剂的优选方面如本发明的第一方面(以上)中所述。
短语“适用于哺乳动物给药的形式”是指无菌、无热原、没有产生毒性或不利作用的化合物并且在生物相容pH(约pH 4.0至10.5)配制的组合物。此类组合物没有可导致体内栓塞风险的颗粒,并经配制,以便在与生物流体(例如,血液)接触时不出现沉淀。此类组合物也只包含生物相容性赋形剂,并且优选是等渗的。
“生物相容载体”为其中成像剂可悬浮或优选溶解,使得组合物在生理学上可耐受(即,可给予哺乳动物身体而没有毒性或过度不适)的流体,尤其是液体。生物相容载体适合为可注射载体液体,如用于注射的无菌无热原水;水溶液,如盐水(可有利地平衡,以便用于注射的最终产物为等渗性);包含生物相容缓冲剂的缓冲水溶液(例如,磷酸盐缓冲剂);一种或多种渗透压调节物质(例如,血浆阳离子与生物相容反离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露糖醇)、二醇(例如甘油)或其它非离子多元醇物质(例如,聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。优选生物相容载体为注射用的无热原水、等渗盐水或磷酸盐缓冲剂。
成像剂和生物相容载体分别在包括密封容器的适合的瓶或器皿中提供,密封容器允许保持无菌完整性和/或放射安全性以及任选的惰性顶部空间气体(例如,氮或氩),同时允许由注射器或套管加入和抽取溶液。优选的此容器为隔膜密封瓶,其中气密封闭部用顶封(一般为铝)卷边。封闭部适合用皮下注射针头单次或多次穿刺(例如,卷边的隔膜密封封闭部),同时保持无菌完整性。此类容器的另外优点是,如果需要,封闭部能够经受真空(例如,为了改变顶部空间气体或使溶液脱气),并且经受压力变化,如减压,而不允许外部大气气体进入,如氧或水蒸气。
优选的多剂量容器包括单一大瓶,这种瓶包含多患者剂量,从而在制剂的实际可用寿命期间以不同时间间隔将单患者剂量抽入临床级注射器,以适合临床情况。预填充注射器设计成含有单人剂量或“单位剂量”,因此优选为适合临床使用的一次性或其它注射器。本发明的药物组合物优选具有适合单个患者的剂量,并且在上述适合的注射器或容器中提供。
药物组合物可包含任选的另外的赋形剂,如抗微生物防腐剂、pH调节剂、填料、辐射防护剂、增溶剂或同渗重摩调节剂。术语“辐射防护剂”是指通过捕获高反应性自由基(例如从水辐解产生的含氧自由基)抑制降解反应(例如氧化还原过程)的化合物。本发明的辐射防护剂适合选自抗坏血酸、对氨基苯甲酸(即,4-氨基苯甲酸)、龙胆酸(即,2,5-二羟基苯甲酸)及其与上述生物相容阳离子的盐。术语“增溶剂”是指在组合物中存在的增加溶剂中成像剂的溶解度的添加剂。优选的此类溶剂为水性介质,因此,增溶剂优选提高在水中的溶解度。适合的此类增溶剂包括C1-4醇、甘油、聚乙二醇(PEG)、丙二醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、山梨糖醇单油酸酯、聚山梨酯、聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)嵌段共聚物(PluronicsTM)、环糊精(例如,α、β或γ环糊精、羟丙基-β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精)和卵磷脂。
术语“抗微生物防腐剂”是指抑制潜在有害微生物(如细菌、酵母或霉菌)生长的剂。根据所用剂量,抗微生物防腐剂也可显示一些杀菌性质。本发明的抗微生物防腐剂的主要作用是抑制药物组合物中任何此类微生物的生长。然而,抗微生物防腐剂也可任选用于抑制在给药前制备所述组合物所用试剂盒的一种或多种组分中潜在有害微生物的生长。适合的抗微生物防腐剂包括对羟基苯甲酸酯,即对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯或它们的混合物;苄醇;苯酚;甲酚;溴化十六烷基三甲铵和硫柳汞。优选的抗微生物防腐剂为对羟基苯甲酸酯。
术语“pH调节剂”是指可用于保证组合物的pH在对于人或哺乳动物给药可接受的限度(约pH 4.0至10.5)内的化合物或化合物的混合物。适合的此类pH调节剂包括药学上可接受的缓冲剂,如两性离子缓冲液(tricine)、磷酸盐或TRIS[即,三(羟基甲基)氨基甲烷];和药学上可接受的碱,如碳酸钠、碳酸氢钠或它们的混合物。
术语“填料”是指可便于在制备和冻干期间物质处理的药学上可接受的填充剂。适合的填料包括无机盐(如氯化钠)和水溶性糖或糖醇(如蔗糖、麦芽糖、甘露糖醇或海藻糖)。
第四方面的放射性药物组合物可在无菌生产(即净室)条件下制备,以得到所需的无菌无热原产物。优选使关键组分无菌,尤其是相关试剂以及接触成像剂的装置的那些部分(例如瓶)。组分和试剂可通过在本领域已知的方法灭菌,包括无菌过滤、用例如γ辐照终端灭菌、压热处理、干热或化学处理(例如,利用环氧乙烷)。优选预先将一些组分灭菌,以便需要进行最少操作数。然而,作为预防措施,优选在制备药物组合物中包括至少一个无菌过滤步骤作为最后步骤。
本发明的放射性药物组合物可通过多种方法制备:
(i)其中18F-放射性标记步骤在净室环境进行的无菌生产技术;
(ii)终端灭菌,其中18F-放射性标记在不用无菌生产下进行,然后在最后步骤灭菌[例如,通过γ照射、压热处理、干热或化学处理(例如,利用环氧乙烷)];
(iii)其中18F-放射性标记步骤用自动合成器装置进行的无菌生产技术。
方法(iii)是优选的,并且更完全地描述于第五方面(以下)。
在第五方面,本发明提供一种制备第四方面的放射性药物组合物的方法,所述方法包括用自动合成器装置进行第三方面的制备方法。
第五方面中成像剂、前体和组合物的优选方面分别如本发明的第一、第三和第四方面中所述。
术语“自动合成器”是指基于单元操作原理的自动模块,如Satyamurthy等[Clin.Positr.Imag., 2(5), 233-253 (1999)]所述。术语“单元操作”是指复杂过程减少到可应用于一定范围材料的一系列简单操作或反应。此类自动合成器优选用于本发明的方法,尤其在需要放射性药物组合物时。它们可购自一系列供应商[Satyamurthy等,以上],包括GE Healthcare、CTI Inc、Ion Beam Applications S.A.(Chemin du Cyclotron 3, B-1348 Louvain-La-Neuve, Belgium)、Raytest(Germany)和Bioscan(USA)。
市售自动合成器也提供由放射性药物制备产生的液体放射性废物的适合容器。自动合成器一般不提供有辐射护罩,因为它们设计用于适当布置的放射性工作间。放射性工作间提供适合的辐射护罩,以保护操作者不受潜在辐射剂量侵害,也提供通风装置,以去除化学和/或放射性蒸气。自动合成器优选包括盒。术语“盒”是指设计为可移除和可交换地装配到自动合成器装置(如上限定)上的装置部件,采用使得合成器的活动部分的机械移动从盒外侧(即,外部)控制盒操作的方式。适合的盒包括阀的线性阵列,阀分别连接到孔口,在此可通过针刺倒置的隔膜密封瓶或通过气密配合接头来连接试剂或瓶。各阀具有与自动合成器的相应活动臂界面连接的凸-凹接头。因此,在盒连接到自动合成器时,臂的外部旋转控制阀的打开或关闭。自动合成器的另外的活动部分设计成夹在注射器柱塞端上,并因此提起或压下注射器筒。
盒是通用的,一般具有可连接试剂的数个位置,并且有数个位置适用于连接试剂的注射瓶或层析管(例如,固相萃取或SPE)。盒始终包括反应容器。这种反应容器优选为1至10cm3,最优选2至5cm3体积,并且经构造,使得盒的3或更多个孔口与其连接,以允许从盒上的不同孔口转移试剂或溶剂。优选盒在线性阵列中具有15至40个阀,最优选20至30个,25个尤其优选。优选盒的阀分别是相同的,最优选为三通阀。盒设计成适合放射性制药制造,因此,由药物级并且理想地为抗辐解的材料制造。
本发明的优选自动合成器包括一次性或单次使用的盒,盒包括进行放射氟化放射性药物的指定批料制备所必需的所有试剂、反应容器和装置。盒意味着自动合成器具有能够通过简单地调换盒以最小交叉污染风险制备多种不同放射性药物的灵活性。盒方法也具有以下优点:简化装配,因此减小操作者失误的风险;提高GMP(良好作业规范)顺应性;多示踪剂能力;在生产过程之间快速改变;盒和试剂的预试自动诊断检查;化学试剂相对于要进行的合成的自动条形码交叉检查;试剂示踪能力;单次使用,因此没有交叉污染风险、防篡改和滥用。
在本发明的该方面包括用自动合成器装置制备第二方面的放射性药物组合物。
在本发明的该方面包括用适用的盒结合自动合成器装置制备第二方面的放射性药物组合物。
在第六方面,本发明提供一种制备第四方面的放射性药物组合物的方法,所述方法包括进行第三方面的方法,其中前体以无菌、冻干的形式提供。
第六方面中成像剂、前体和组合物的优选方面分别如本发明的第一、第三和第四方面中所述。第六方面的冻干前体优选作为在药物级容器(优选隔膜密封瓶)中的非放射性试剂盒提供,如第四方面(以上)中所述。
在第七方面,本发明提供一种使人或动物身体成像的方法,所述方法包括用PET产生所述身体的至少一部分的图像,已将第一方面的成像剂或第四方面的组合物分布到所述身体,其中所述成像剂或组合物已预先给予所述身体。
第七方面中成像剂或组合物的优选方面分别如本发明的第一和第四方面(以上)中所述。
本发明通过以下详述的非限制实施例说明。除非另作说明,所有反应用标准Schlenk玻璃仪器、真空或手套箱技术在氮气气氛下操作。溶剂经标准干燥剂通过回流干燥和脱气,并在蒸馏后立即使用。Tacn和Me3-tacn可以购得,例如购自Aldrich。BzMe2-tacn通过Spiccia等[Inorg. Chem., 45(9), 3746-3755 (2006)]的方法得到。所有其它化学药品得自市售来源。
实施例1、2、4和5提供本发明的铝络合物的合成。实施例6至7和9、11、12和14分别提供本发明的镓和铟络合物的合成。实施例3说明本发明的铝络合物的氟化物交换,显示利用水性KF在温和条件下进行交换,并且产生稳定的可分离产物。实施例8和10提供利用不同氟化物源的本发明的镓络合物的类似证据。实施例13和15提供本发明的铟络合物的类似证据。Ga(III)相对于Al(III)的较高氟化物亲合性意味着在MeCN溶液中从相应的三氯化物衍生物(使用NMe4F或NBu4F)形成[GaF3(Me3-tacn)]是快速并且干净的。相反,[AlF3(Me3-tacn)]不由类似交换反应在净MeCN中生成,并且在水性KF加到[AlCl3(Me3-tacn)]的MeCN溶液时在室温形成。
19F和71Ga NMR研究显示完全转化成[GaF3(Me3-tacn)]。另外,它们证明络合物的结构在溶液中保留。得到的[GaF3(Me3-tacn)]络合物显著地比氯化物和溴化物类似物更稳定,并且在水溶液中更抗水解。这种结构也已在结晶学上证明(图2)。这明显证明,氟化物直接结合到仔细选择的金属离子的配位球体完全可行,并且确立所得氟络合物的高稳定性,甚至在水溶液中。NMR数据总结于表1中。
实施例16提供本发明的金属络合物的8F放射性标记。
本发明的螯合剂
缩写
Boc:叔丁基氧基羰基
BzMe2tacn:1.4-二甲基-7-苄基-1,4,7-三氮杂环壬烷
DMF:二甲基甲酰胺
DMSO:二甲亚砜
GMP:良好作业规范
HPLC:高效液相层析
MeCN:乙腈
Me3tacn:1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷
SPE:固相萃取
Tacn:1,4,7-三氮杂环壬烷
THF:四氢呋喃
tBu:叔丁基。
附图说明
图1至3显示本发明的金属络合物的X-射线晶体结构。
具体实施方式
实施例1:合成[AlCl3(M e3-tacn)] .
在搅拌下,在室温将AlCl3(0.067g, 0.50mmol)加入到CH3CN(5mL)中Me3-tacn(0.086g,0.50mmol)的溶液,导致快速形成沉淀。30分钟后,过滤去除溶剂。用少量CH2Cl2溶剂洗涤白色沉淀,并在真空中干燥。收率:0.11g,72%。通过在冰箱中冷却CH3CN溶液数天,得到无色结晶。结晶用CH2Cl2洗涤。
分析计算C9H21AlCl3N3·0.2CH2Cl2:C,34.4;H,6.7;N,13.1。实验值:C,34.2;H,7.2;N,13.9。
1H NMR (CD2Cl2, 298 K):δ 3.23 (m, [6H], CH2), 2.86 (s, [9H], CH3), 2.67(m, [6H], CH2).
IR (Nujol, ν/cm-1): 389, 375 (Al-Cl).
得到X射线晶体结构,见图1。
实施例2:合成[AlBr3(Me3-tacn)].
在搅拌下,在室温将AlBr3(0.133g, 0.50mmol)加入到CH2Cl2(5mL)中Me3-tacn(0.086g, 0.50mmol)的溶液,导致快速形成沉淀。30分钟后,过滤去除溶剂。用少量CH2Cl2溶剂洗涤白色沉淀,并在真空中干燥。收率:0.16g,74%。
分析计算C9H21A1Br3N3:C,24.7;H,4.8;N, 9.6。实验值:C,24.6;H,5.3;N, 8.9。
1H NMR (CD2Cl2, 297 K): δ3.43 (m, [6H], CH2), 2.98 (m, [9H], CH3), 2.73(m, [6H], CH2).
IR (Nujol, ν/cm-1): 324 (Al-Br)。
实施例3:合成[AlF3(Me3-tacn)]·xH2O
方法1:使AlF3·3H2O(0.100g, 0.73mmol)悬浮于新蒸馏水(7mL)。然后加入Me3-tacn(0.125g, 0.73mmol),将浅黄色悬浮液转移到Teflon容器,装入不锈钢高压容器(Parr仪器公司,零件号276AC-T304-04 1 101),并加热到180℃经历15小时。然后使容器冷却。已生成深黄棕色溶液。保留反应溶液的少量等分试样生长结晶。为了保留反应混合物,在真空中去除挥发物,得到浅棕色固体,用己烷洗涤,并过滤。将所得白色固体在真空中干燥。收率:0.12g,53%。
分析计算C9H21AlF3N3·3H2O:C,34.9;H,8.8;N,13.6。实验值:C,34.3;H,8.9;N,14.7%。
1H NMR (CD3CN, 298 K): δ 2.84-2.76 (m, [6H], CH2), 2.72-2.65 (m,[6H], CH2), 2.55 (s, [9H], CH3), 2.19 (s, H2O).
IR (Nujol, ν/cm-1): 3438 br (H2O), 1668 (H2O), 633, 614 (Al-F).
缓慢蒸发反应溶剂得到适用于X射线衍射的结晶。
方法2:将水(2mL)中KF(0.058g, 0.99mmol)的溶液在室温加入到MeCN(5mL)中[AlCl3(Me3-tacn)](实施例1, 0.100g, 0.33mmol)的悬浮液。初始形成白色沉淀,数分钟后重新溶于溶液。关于溶液的NMR谱数据如方法1。
实施例4:合成[AlCl3(BzMe2-tacn)].
在搅拌下,在室温将AlCl3(0.067g, 0.50mmol)加入到CH3CN(2mL)中BzMe2-tacn(0.13g, 0.50mmol)的溶液,导致形成沉淀。30分钟后,过滤去除溶剂。用少量CH2Cl2溶剂洗涤白色沉淀,并在真空中干燥。收率:0.13g,68%。
分析计算C15H25AlCl3N3:C,47.3;H,6.6;N,11.0。实验值:C,47.0;H,6.6;N,11.2。
1H NMR (CD2Cl2, 298 K): δ7.31 (m, [5H], ArH), 4.58 (s, [2H], Ar-CH2),3.54 (m, [2H], tacn-CH2), 3.29 (m, [4H], tacn-CH2), 2.92 (s, [6H], CH3), 2.65(m, [4H], tacn-CH2), 2.28 (m, [2H], tacn-CH2).
IR (Nujol, ν/cm-1): 398, 385 (Al-Cl)。
实施例5:合成[AlBr3(BzMe2-tacn)].
在搅拌下,在室温将AlBr3(0.133g, 0.50mmol)加入到CH2Cl2(2mL)中BzMe2-tacn(0.13g, 0.50mmol)的溶液,立即沉淀白色固体。30分钟后,过滤去除溶剂。用少量CH2Cl2溶剂洗涤白色沉淀,并在真空中干燥。收率:0.19g,74%。
1H NMR (CD2Cl2, 298 K): δ7.31 (m, [5H], ArH), 4.75 (m, [2H], Ar-CH2),3.72 (m, [2H], tacn-CH2), 3.46 (m, [4H], tacn-CH2), 3.04 (m, [6H], CH3), 2.70(m, [4H], tacn-CH2), 2.33 (m, [2H], tacn-CH2).
IR (Nujol,ν/cm-1): 343, 325 sh (Al-Br)。
实施例6:合成[GaCl3(Me3-tacn)] .
在搅拌下,在室温将Me3-tacn(0.09g, 0.52mmol)加入到无水CH2Cl2(8mL)中GaCl3(0.088g, 0.50mmol)的溶液。在约30分钟后,开始出现白色沉淀。2小时后,停止搅拌,浓缩混合物,得到更多沉淀,从溶液过滤白色粉末状产物,并在真空中干燥。收率:0.110g,60%。
分析计算C9H21Cl3GaN3:C,31.1;H,6.1;N,12.1。实验值:C,31.2;H,5.9;N,12.1%。
1H NMR (CD2Cl2, 298 K): δ 3.2 (br m, [6H], CH2), 2.85 (br s, [9H],Me), 2.6 (br m, [6H], CH2).
IR (Nujol, ν/cm-1): 290, 275 (Ga-Cl).
确定X射线晶体结构,见图2。
实施例7:合成[GaBr3(Me3-tacn)].
方法如[GaCl3(Me3-tacn)] (实施例6),但使用Me3-tacn(0.086g, 0.50mmol)和GaBr3(0.150g, 0.50mmol)。白色固体。收率:0.106g,45%。
分析计算C9H21Br3GaN3:C,22.5;H,4.4;N,8.7。实验值:C,22.4;H,4.6;N,8.6%。
1H NMR (CD2Cl2, 298 K): δ 3.3 (br m, [6H], CH2), 2.9 (br s, [9H], Me),2.7 (br m, [6H], CH2).
C9H21Br3GaN3所需要:C,22.49;H,4.40;N,8.74。实验值:C,22.41;H,4.62;N,8.56%。
实施例8:合成[GaF3(Me3-tacn)].4H2O.
方法1:将[GaCl3(Me3-tacn)] (实施例6, 0.1g, 0.28mmol)加入到CH2Cl2(8mL),并搅拌约15分钟,固体大部分溶解,得到澄清溶液。将THF中的[NBu4]F (1mol dm-3, 0.84mL,0.84mmol)通过注射器加入到混合物,并搅拌反应约10分钟,得到澄清无色溶液。将溶液过滤,将滤液移到真空中至干。使得到的无色固体重新溶于CH2Cl2,将溶液过滤,使CH2Cl2蒸发,得到无色固体产物。收率:50%。
分析计算C9H21F3GaN3·3H2O:C,30.7;H,7.7;N,11.9。实验值:C,30.6;H,6.9;N,11.0%。
1H NMR (CD2Cl2, 298 K): δ 2.85–2.94 (br m, [6H], CH2), 2.67 (s, [9H],Me), 2.55–2.61 (br m, [6H], CH2, 2.17 (s, H2O).
IR (Nujol, ν/cm-1): 3481, 3429 (H2O), 1648 (H2O), 530, 492 (Ga-F)。
方法2:使[GaCl3(Me3-tacn)] (实施例6, 0.05g, 0.15mmol)悬浮于5mL无水CH2Cl2。用[NMe4]F (0.042g, 0.45mmol)处理悬浮液,并在室温搅拌1小时。通过过滤去除[NMe4]Cl副产物。用5mL己烷处理所得无色滤液,得到白色沉淀,沉淀通过过滤分离,并在真空中干燥。收率:0.037g,74%。
光谱数据如方法1。
方法3:使[GaCl3(Me3-tacn] (实施例6, 0.05g, 0.15mmol)悬浮于无水MeCN(5mL)。滴加水(2mL)中KF(0.026g, 0.45mmol)的溶液,致使快速溶解,并形成无色溶液。在室温搅拌混合物另外1小时。
光谱数据如方法1。
在缓慢蒸发时,从产物的CH2Cl2溶液生长无色结晶。得到X射线晶体结构,见图2。
实施例9:合成[GaCl3(BzMe2-tacn)].
在室温将BzMe2-tacn(0.125g, 0.50mmol)加入到无水CH2Cl2(5-8mL)中GaCl3(0.088g,0.50mmol) 1:1的溶液,并搅拌。在约30分钟后,开始形成少量白色沉淀。12小时后,停止搅拌,通过去除CH2Cl2浓缩混合物,导致产物进一步沉淀。在氮下,从微黄色溶液滤出白色产物。白色粉末状产物在真空下干燥2小时。收率:0.089g,42%。
分析计算C15H25Cl3GaN3:C,42.5;H,6.0;N,9.9。实验值:C,42.2;H,6.0;N,9.6%。
1H NMR (CD2Cl2, 298 K): δ 7.30 (br m, [5H], ArH), 4.71 (s, [2H], Ar-CH2), 3.67 (br, [2H], tacn-CH2), 3.20 (br, [2H], tacn-CH2), 2.92 (br s, [6H],CH3), 2.75 (br m, [2H], tacn-CH2), 2.62 (br m, [2H], tacn-CH2), 2.40 (br m,[2H], CH2).
IR (Nujol, ν/cm-1): 301, 280 (Ga-Cl)。
实施例10:合成[GaF3(BzMe2-tacn)]·xH2O.
使[GaCl3(BzMe2-tacn)] (实施例9, 0.05g, 0.10mmol)悬浮于5mL无水CH2Cl2。用[NMe4]F (0.03g, 0.30mmol)处理悬浮液,并在室温搅拌1小时。通过过滤去除[NMe4]Cl副产物。用5mL无水己烷处理所得无色滤液,形成白色沉淀,沉淀通过过滤分离,并在真空中干燥。
收率:0.035g,80%。
1H NMR (D2O, 298 K): δ 7.30 (m, [5H], ArH), 4.73 (s, [2H], Ar-CH2),3.17 (m, [4H], tacn-CH2), 2.88 (m, [4H], tacn-CH2), 2.73 (s, [6H], CH3), 2.36(m, [4H], tacn-CH2), 2.25 (s, H2O).
IR (Nujol, ν/cm-1): 3390, 1654 (H2O) 526, 515 (Ga-F)。
实施例11:合成[InCl3(Me3-tacn)].
在室温将Me3-tacn(0.086g, 0.50mmol)加入到InCl3(0.110g, 0.50mmol) 1:1和无水CH2Cl2(5-8mL)的溶液,并搅拌。在约30分钟后,开始形成白色沉淀。2小时后,停止搅拌,浓缩混合物,导致产物进一步沉淀。白色产物在氮下从溶液过滤,在真空下干燥2小时。收率:0.113g,57%。
分析计算C9H21Cl3InN3:C,27.5;H,5.4;N,10.7。实验值:C,27.8;H,5.4;N,10.9%。
1H NMR (CDCl3, 298 K): δ 3.1 (br m, [6H], CH2), 2.8 (br m, [15H], Me和 CH2).
IR (Nujol, ν/cm-1): 287, 269 (In-Cl)。
实施例12:合成[InBr3(Me3-tacn)].
在室温将Me3-tacn(0.087g, 0.50mmol)加入到无水CH2Cl2(5-8mL)中InBr3(0.177g,0.50mmol) 1:1的溶液,并搅拌。在约30分钟后,已开始形成白色沉淀。2小时后,停止搅拌,通过去除CH2Cl2浓缩混合物,导致产物进一步沉淀。固体产物在氮下从无色滤液过滤,在真空下干燥2小时。收率:0.162g,68%。
分析计算C9H21Br3InN3:C,20.5;H,4.0;N,8.0。实验值:C,19.8;H,4.0;N,7.4%。
1H NMR (CD2Cl2, 298 K): δ 3.18 (br m, [6H], CH2), 2.78 (br s, [9H],Me), 2.67 (br m, [6H], CH2)。
实施例13:合成[InF3(Me3-tacn)].H2O.
方法1:将[InCl3(Me3-tacn)] (实施例11, 0.214g, 0.54mmol)加到CH2Cl2(8mL),并搅拌约15分钟,这得到混浊的悬浮液。将THF中的[NnBu4]F (1mol dm–3, 1.63mL, 1.63mmol)通过注射器加入到混合物,并搅拌约2小时。将溶液过滤,收集白色沉淀,用己烷洗涤,并在真空中干燥。收率:0.150g,70%。
分析计算C9H21F3InN3·H2O:C,29.9;H,6.4;N,11.6。实验值:C,29.9;H,6.1;N,11.5%。
1H NMR (CD2Cl2, 298 K): δ 3.09–3.15 (br m, [6H], CH2), 2.93 (m, [9H],Me), 2.72–2.82 (br m, [6H], CH2), 2.19 (s, H2O).
IR (Nujol, ν/cm-1): 3392 br (H2O), 1669 (H2O), 479, 462, 443 (In-F).
在缓慢蒸发时,从产物的CH2Cl2溶液生长无色结晶。
方法2:使[InCl3(Me3-tacn)] (实施例11, 0.060g, 0.17mmol)悬浮于5mL无水CH2Cl2。用[NMe4]F (0.047g, 0.51mmol)处理悬浮液,并在室温搅拌1小时。通过过滤去除[NMe4]Cl副产物。用5mL无水己烷处理所得无色滤液,形成白色沉淀,沉淀通过过滤分离,并在真空中干燥。收率:0.044g,76%。
光谱数据如方法1。
在缓慢蒸发时,从产物的CH2Cl2溶液生长无色结晶。
实施例14:合成[InCl3(BzMe2-tacn)].
在室温将BzMe2-tacn(0.125g, 0.50mmol)加入到无水CH2Cl2(5-8mL)中InCl3(0.110g, 0.50mmol) 1:1的溶液,并搅拌。在约30分钟后,已开始形成一些白色沉淀,使混合物变混浊。2小时后,停止搅拌,通过去除CH2Cl2浓缩混合物,导致产物进一步沉淀。在氮下从黄色溶液过滤白色产物,在真空下干燥2小时。收率:0.093g,40%。
分析计算C15H25Cl3InN3:C,38.5;H,5.4;N,9.0。实验值:C,38.8;H,5.8;N,8.7%。
1H NMR (CD3CN, 298 K): 7.2 – 7.4 (m, [5H], ArH), 4.37 (s, [2H], Ar-CH2), 3.45 (br, [2H], tacn-CH2), 3.10 (br, [2H], tacn-CH2), 2.80 (s, [6H],CH3), 2.75 (br m, [2H], tacn-CH2), 2.60 (br m, [2H], tacn-CH2), 2.40 (br m,[2H], CH2).
IR (Nujol, ν/cm-1): 289, 271 (In-Cl).
从产物的CH2Cl2溶液生成的结晶在-18℃在冷冻器中储存。
实施例15:合成[InF3(BzMe2-tacn)].
使[InCl3(BzMe2-tacn)] (实施例14, 0.06g, 0.10mmol)悬浮于5mL无水CH2Cl2。用[NMe4]F (0.03g, 0.30mmol)处理悬浮液,并在室温搅拌1小时。通过过滤去除[NMe4]Cl副产物。用5mL无水己烷处理所得无色滤液,形成白色沉淀,沉淀通过过滤分离,用己烷洗涤,并在真空中干燥。收率:0.02g,48%。
1H NMR (CD3CN, 298 K): 7.37 (m, [5H], ArH), 4.37 (s, [2H], Ar-CH2),3.08 (m, [6H], CH3), 2.91 (m, [4H], tacn-CH2), 2.80 (m, [4H], tacn-CH2), 2.64(m, [4H], tacn-CH2).
IR (Nujol, ν/cm-1): 3450 v br (H2O), 1651 (H2O), 481, 463 (In-F).
通过使滤液在冷冻器中冷却,得到结晶。
实施例16:[GaCl3(BzMe2tacn)]的18F-放射性标记.
使[GaCl3(BzMe2-tacn)] (实施例9, 1mg, 2.36μmol)溶于0.5mL MeCN/0.1mL H2O。将溶液加到包含[18F]氟化物(100至400MBq)和[19F]KF (7.05μmol)的0.4ml水溶液,并将瓶在室温静置30至60分钟。随后的HPLC证明20至40%的18F结合到金属络合物。
HPLC:Luna 5µ C18(2) 150x4.6mm (流动相A=50mM乙酸铵;流动相B=100% MeCN)。流速1mL/min。
0 min (10%B), 15 min (90%B), 20 min (90%B), 21 min (10%B), 26 min(10%B)。
表1:NMR谱数据汇总
a n.o. = 未观察。
Claims (16)
1.一种成像剂,所述成像剂包含式I的18F标记化合物:
其中:
Y1=Y2=NR1,
X1、X2和X3独立为19F或18F,
条件为X1、X2和X3中两个为19F,并且第三个为18F,
x=y=z=1;
M为Al3+、Ga3+、In3+、Sc3+或Y3+;
R1为C1-3烷基或-CH2-Ar1,其中Ar1为C5-12芳基或C3-12杂芳基;
R2为R1或Q;
Q为-L-[BTM],并且可存在或不存在,当存在时,为R2或为连接到-(CH2)(CH2)x-、-(CH2)(CH2)y-或-(CH2)(CH2)z-基团的碳原子之一;
L为式-(A)m-的合成连接基,其中各个A独立为-CR2-、-CR=CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-CR=N-O-、-NR(C=O)NR-、-NR(C=S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基、C4-8环亚烷基、-Ar-、-NR-Ar-、-O-Ar-、-Ar-(CO)-、氨基酸、糖或单分散聚乙二醇(PEG)结构单元,
其中各个R独立选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟烷基;
m为值1至20的整数;
各个Ar独立为C5-12亚芳基或C3-12杂亚芳基;
BTM为生物靶向部分。
2.权利要求1的剂,其中存在Q。
3.权利要求1或2的剂,所述剂为式IA:
4.权利要求1至3中任一项的剂,所述剂为式IB:
5.权利要求1至4中任一项的剂,其中M为Ga3+或In3+。
6.权利要求1至5中任一项的剂,其中BTM选自单氨基酸、3-100聚肽、酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂、酶抑制剂或受体结合化合物。
7.一种制备权利要求1至6中任一项的剂的方法,所述方法包括任选在[19F]氟化物存在下,在适合的溶剂中使式II的前体与供应的[18F]氟化物或[18F]NaF反应:
其中M、Y1、Y2、x、y和z如权利要求1至6中任一项所限定;
Q可存在或不存在,并且如权利要求1至6中任一项所限定;且
X1a、X2a和X3a独立为Br或Cl。
8.权利要求7的方法,其中所述前体为式IIA:
9.权利要求7或8的方法,其中所述前体为式IIB:
10.权利要求7至9中任一项的方法,其中X1a=X2a=X3a=Cl。
11.权利要求8至10中任一项的方法,其中Q包括BTM,其选自3-100聚肽、酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂、酶抑制剂或受体结合化合物。
12.一种放射性药物组合物,所述放射性药物组合物包含权利要求1至6中任一项的剂,以及适用于哺乳动物给药形式的生物相容性载体。
13.一种制备权利要求12的放射性药物组合物的方法,所述方法包括用自动合成器装置进行权利要求7至10中任一项的方法。
14.权利要求13的方法,其中所述自动合成器装置包括盒,所述盒包含进行权利要求7至10中任一项的方法所必需的非放射性试剂。
15.一种制备权利要求12的放射性药物组合物的方法,所述方法包括进行权利要求7至10中任一项的方法,其中所述前体以无菌、冻干形式提供。
16.权利要求1至6中任一项的成像剂用于制备放射性药物组合物的用途,所述放射性药物组合物给予人或动物身体,以用PET产生已分布有成像剂的所述身体的至少一部分的图像。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB201201062A GB201201062D0 (en) | 2012-01-23 | 2012-01-23 | Radiofluorination method |
GB1201062.5 | 2012-01-23 | ||
US201261589972P | 2012-01-24 | 2012-01-24 | |
US61/589972 | 2012-01-24 | ||
CN201380015583.9A CN104302327A (zh) | 2012-01-23 | 2013-01-22 | 放射氟化方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201380015583.9A Division CN104302327A (zh) | 2012-01-23 | 2013-01-22 | 放射氟化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109045312A true CN109045312A (zh) | 2018-12-21 |
Family
ID=45840808
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201380015583.9A Pending CN104302327A (zh) | 2012-01-23 | 2013-01-22 | 放射氟化方法 |
CN201811135640.8A Pending CN109045312A (zh) | 2012-01-23 | 2013-01-22 | 放射氟化方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201380015583.9A Pending CN104302327A (zh) | 2012-01-23 | 2013-01-22 | 放射氟化方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11135322B2 (zh) |
EP (1) | EP2806901B1 (zh) |
JP (1) | JP6609409B2 (zh) |
KR (1) | KR102046437B1 (zh) |
CN (2) | CN104302327A (zh) |
AU (1) | AU2013211639B2 (zh) |
GB (1) | GB201201062D0 (zh) |
WO (1) | WO2013110615A1 (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201201062D0 (en) | 2012-01-23 | 2012-03-07 | Ge Healthcare Ltd | Radiofluorination method |
GB201308053D0 (en) * | 2013-05-03 | 2013-06-12 | Ge Healthcare Ltd | Metal complexes and fluorination thereof |
EP3212610B1 (en) * | 2014-10-30 | 2020-10-28 | Katholieke Universiteit Leuven | Methods for low temperature fluorine-18 radiolabeling of biomolecules |
JP7062977B2 (ja) * | 2018-01-30 | 2022-05-09 | 株式会社デンソーウェーブ | 複数の無線機器をグルーピングする方法 |
CN113663621A (zh) * | 2020-05-14 | 2021-11-19 | 益诺思生物技术海门有限公司 | 一种89Zr药物标记及纯化装置及其方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110110854A1 (en) * | 2007-01-11 | 2011-05-12 | Immunomedics, Inc. | Methods and Compositions for Improved F-18 Labeling of Proteins, Peptides and Other Molecules |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8719041D0 (en) | 1987-08-12 | 1987-09-16 | Parker D | Conjugate compounds |
US6183744B1 (en) | 1997-03-24 | 2001-02-06 | Immunomedics, Inc. | Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies |
US7993626B2 (en) * | 2007-01-11 | 2011-08-09 | Immunomedics, Inc. | Methods and compositions for F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules |
US7597876B2 (en) | 2007-01-11 | 2009-10-06 | Immunomedics, Inc. | Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules |
WO2006138357A1 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The University Of Akron | Macrocyclic metal complexes for their use as anticancer agents |
GB0524851D0 (en) * | 2005-12-06 | 2006-01-11 | Ge Healthcare Ltd | Radiolabelling method using polymers |
JP5388355B2 (ja) | 2007-01-11 | 2014-01-15 | イミューノメディクス、インコーポレイテッド | タンパク質、ペプチドおよび他の分子の改善されたf−18標識化のための方法および組成物 |
EP2195037A2 (en) | 2007-09-10 | 2010-06-16 | GE Healthcare UK Limited | Radiofluorination methods |
US8761016B2 (en) | 2008-03-28 | 2014-06-24 | Georgia Tech Research Corporation | Systems and methods for intelligent policy enforcement in access networks |
WO2012082618A2 (en) | 2010-12-13 | 2012-06-21 | Immunomedics, Inc. | Methods and compositions for improved f-18 labeling of proteins, peptides and other molecules |
KR101106433B1 (ko) | 2009-04-03 | 2012-01-18 | 서울대학교산학협력단 | 암 조직의 타겟팅을 위한 마크로사이클릭 아미노산 계열의 유도체 및 그의 방사성 또는 비방사성 금속 표지화합물 |
JP2013528180A (ja) | 2010-05-28 | 2013-07-08 | ジーイー・ヘルスケア・リミテッド | 放射性標識化合物及びその製造方法 |
CN102391168B (zh) | 2011-09-16 | 2013-11-27 | 中山大学附属第一医院 | 对称性双功能偶联剂及其偶合分子显像剂 |
GB201201062D0 (en) | 2012-01-23 | 2012-03-07 | Ge Healthcare Ltd | Radiofluorination method |
GB201308053D0 (en) | 2013-05-03 | 2013-06-12 | Ge Healthcare Ltd | Metal complexes and fluorination thereof |
-
2012
- 2012-01-23 GB GB201201062A patent/GB201201062D0/en not_active Ceased
-
2013
- 2013-01-22 CN CN201380015583.9A patent/CN104302327A/zh active Pending
- 2013-01-22 EP EP13701070.8A patent/EP2806901B1/en active Active
- 2013-01-22 AU AU2013211639A patent/AU2013211639B2/en active Active
- 2013-01-22 CN CN201811135640.8A patent/CN109045312A/zh active Pending
- 2013-01-22 US US14/373,413 patent/US11135322B2/en active Active
- 2013-01-22 KR KR1020147020360A patent/KR102046437B1/ko active IP Right Grant
- 2013-01-22 WO PCT/EP2013/051154 patent/WO2013110615A1/en active Application Filing
- 2013-01-22 JP JP2014552659A patent/JP6609409B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110110854A1 (en) * | 2007-01-11 | 2011-05-12 | Immunomedics, Inc. | Methods and Compositions for Improved F-18 Labeling of Proteins, Peptides and Other Molecules |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
CARAS.TREDGETETAL.: ""A Family of Scandium and Yttrium Tris((trimethylsilyl)methyl) Complexes with Neutral N3 Donor Ligands"", 《ORGANOMETALLICS》 * |
M.D.WARD: ""The Coordination Chemistry of Macrocyclic Ligands"", 《SCHOOL OF CHEMISTRY》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104302327A (zh) | 2015-01-21 |
JP2015505533A (ja) | 2015-02-23 |
WO2013110615A1 (en) | 2013-08-01 |
KR102046437B1 (ko) | 2019-11-19 |
US11135322B2 (en) | 2021-10-05 |
AU2013211639B2 (en) | 2017-06-01 |
US20140377178A1 (en) | 2014-12-25 |
JP6609409B2 (ja) | 2019-11-20 |
EP2806901A1 (en) | 2014-12-03 |
KR20140114389A (ko) | 2014-09-26 |
EP2806901B1 (en) | 2016-03-30 |
GB201201062D0 (en) | 2012-03-07 |
AU2013211639A1 (en) | 2014-08-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2594167C2 (ru) | Композиции пептидных радиоактивных индикаторов | |
US20220031870A1 (en) | Metal complexes and fluorination thereof | |
CN109045312A (zh) | 放射氟化方法 | |
JP5860808B2 (ja) | 放射性ヨウ素化方法 | |
KR20130024963A (ko) | 개선된 n4 킬레이트제 결합체 | |
JP6055417B2 (ja) | 放射性トレーサー組成物 | |
ES2929507T3 (es) | Método para marcar una molécula directora biológica mediante conjugación con un radioisótopo adecuado para formación de imágenes por PET o SPECT | |
JP2016532700A (ja) | 放射性標識方法 | |
US20220273830A1 (en) | Compounds and methods of use | |
WO2013113801A2 (en) | Chelating agents | |
CN104797273A (zh) | 用于放射氟化的18f-标记的醛组合物 | |
JP2016520577A (ja) | 金属錯体とそのフッ素化 | |
WO2014096191A1 (en) | Bis 2h-imidazole-2-thione chelating agents as ligands for radiopharmaceutical in vivo imaging |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |