CN109022425A

CN109022425A - 一种提取姬松茸总dna的试剂及应用

Info

Publication number: CN109022425A
Application number: CN201811101192.XA
Authority: CN
Inventors: 刘朋虎; 张煜隆; 赵光辉; 黄在兴; 胡应平; 罗海凌; 李晶; 刘艳玲; 林占熺
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明公开了一种提取姬松茸总DNA的试剂及应用。该方法与传统DNA提取方法相比如CTAB法、SDS法、碱裂解法和常规试剂盒相比，具有样品用量少、DNA样品纯度高、完整性好、操作简单等优点，整个提取过程只需15min，且提取过程中无有毒试剂，保证了研究人员免于有毒试剂的伤害。实验结果表明，本发明适用于姬松茸等多种真菌总DNA的提取，可直接用于PCR、Real‑Time PCR、分子标记等下游分子生物学试验。

Description

一种提取姬松茸总DNA的试剂及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术分子生物学领域，尤其涉及一种提取姬松茸总DNA的试剂及应用。

背景技术

DNA是生命体中遗传信息的载体，包含了生物体的遗传性状。高质量、高纯度的总DNA是保证开展PCR扩增、限制性内切酶酶切、遗传图谱分析、分子杂交、遗传多样性分析以及基因组学等分子生物学研究的首要条件。因此，高效、快速制备高纯度、完整性好的总DNA样品显得极为重要。

目前，传统制备真菌总DNA的方法包括CTAB法、SDS法、碱裂解法和常规试剂盒方法等，CTAB法和SDS法采用离子型表面活性剂用于裂解真菌细胞，使基因组释放出来，再通过苯酚/氯仿/异戊醇等的多次抽提使蛋白质等沉淀于有机试剂中，最后经过异丙醇或者乙醇沉淀得到纯度高、完整性好的DNA分子。在这种方法中存在反复离心、沉淀、等待的工序，操作繁琐且耗时长，其提取过程需要2-3 h；且药品中苯酚、氯仿和异戊醇等有机溶剂具有毒性，对操作人员可能造成一定伤害；其次可能导致有机溶剂残留在总DNA样品中从而造成下游试验无法顺利进行。

常规试剂盒方法是在CTAB法、SDS法等常规方法等基础上结合DNA吸附柱进行优化，解决了DNA样品沉淀时间长和样品纯度低的缺点，且整个实验过程缩短到1h左右。但是，常规试剂盒方法提取过程中依然需要涉及氯仿、苯酚、β-巯基乙醇等有毒试剂。

碱裂解法直接利用强碱NaOH溶液使细胞膜溶解，蛋白变性，释放总DNA，再经过TE缓冲液对碱溶液稀释中和，从而得到了DNA溶液直接用于PCR扩增，是目前最为常见的快速简便提取总DNA的方法。该方法得到的DNA由于不经过任何纯化处理，含有大量色素、多糖和蛋白等物质，其含量和纯度都低不利于后续实验，且反应过程中强碱NaOH会打断DNA片段，导致该方法获得的DNA样品仅扩增上限为1000 bp左右的基因，而对于较长的基因片段而言，这种提取方法显然不适用。

姬松茸又名巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇等，原产于巴西、秘鲁和美国等地，是一种珍贵的食药用菌。姬松茸营养丰富，还具有抗肿瘤、免疫调节、抗突变、抗炎和抗氧化等多种药用功能。在日本，姬松茸被称为“癌症患者最后的食物”。1992 年，福建省农业科学院从日本引进姬松茸并栽培成功，目前已经推广至全国近10个省。随着现代生物技术的发展，姬松茸分子生物学的研究也逐步深入，但由于姬松茸子实体和菌丝体中含有大量黏性的多糖类物质等干扰，因此目前姬松茸总DNA的提取方法有的操作复杂用时长，有的用到苯酚、氯仿、巯基乙醇等有毒物质，有的DNA完整度差。因此，针对以上不足并通过对现有提取技术的改进发明了本方法，具有安全、快速、简便、高效、产物完整度高、经济等优点。

发明内容

本发明通过多次优化实验流程和试剂配方，总结出一种安全、快速、简单、高效提取姬松茸总DNA的方法。该方法利用硅酸铝陶瓷纤维膜与DNA在不同盐离子浓度和pH条件下的结合程度不同从而达到提取、分离、纯化DNA的目的。本方法操作安全、快速、简单，15 min就能完成整个总DNA的制备过程，提取过程中原料用量少、无需酚、氯仿抽提，避免了有机溶剂对操作人员的污染；实验结果显示，总DNA完整性好，纯度高，适用于PCR、SSR、ISSR、qPCR等实验。从而解决了现有提取技术样品用量大、耗时长、试剂有毒、提取的DNA片段较短等缺点，以满足姬松茸等珍贵材料分子生物学实验的需要。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提取姬松茸总DNA的试剂，包括以下四种试剂：

（1）平衡液，包含以下成分：1.5wt%的 Na₂SiO₃·9H₂O，1wt%的 KOH；

（2）裂解液，包含以下成分：5.0M的盐酸胍，30%v/v的异丙醇和2wt%的PVP- K30；

（3）DNA洗涤液，包含以下成分：20 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，终浓度为85%v/v的乙醇，pH 7.5；

（4）DNA洗脱液，包含以下成分：10 mM Tris-HCl，pH 8.5。

一种提取姬松茸总DNA的方法，具体包括以下步骤：

（1）向DNA吸附柱中加平衡液200 μL，10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附柱进行预处理；

（2）将50 mg的样品研磨后加入裂解液500 μL，混匀，室温 10,000 rpm，离心30 s；

（3）将上清转移到处理过的DNA吸附柱，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液；

（4）向DNA吸附柱中加入DNA洗涤液650 μL，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附柱套回废液收集管，室温10,000 rpm离心1 min；

（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL 离心管中，开盖放置1-2 min去除乙醇残留，加入65℃预热的DNA洗脱液，30-100μL，或再加入20 μg/ mL 的RNA酶37℃孵育30 min，去除RNA，静置1-2 min；

（6）12,000 rpm离心2 min，洗脱DNA，保存备用。

所述DNA吸附柱为硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱。

根据需要将该方法应用于食用菌总DNA的提取或ITS序列鉴定中。

本发明的优点在于：

（1）在DNA分离纯化过程中，本发明使用了硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱，并通过使用本发明研发的平衡液对硅酸铝陶瓷纤维膜进行预处理，可明显增加硅酸铝陶瓷纤维膜与DNA的结合率；

（2）通过优化裂解液和洗涤液的配方，一方面可以充分的去除蛋白、多糖等其他的杂质，另一方面由于不使用苯酚、氯仿等有机试剂，可避免有毒试剂对操作人员造成的毒害和残留试剂对下游试验的抑制作用；

（3）在DNA洗脱的步骤中，通过65℃预热的DNA洗脱液，来加快分子的热运动，使DNA分子更容易与硅胶柱分离，最大程度的保证DNA的洗脱效率;

（4）本发明操作简单、快速、纯度高、完整度高，可直接用于PCR、Real-Time PCR、分子标记等下游分子生物学试验的快速姬松茸等真菌的总DNA提取方法，可对姬松茸等真菌的子实体、菌丝体及其他发酵产物等总DNA进行快速提取，提取产物可以用于分子生物学和遗传学的研究和分子鉴定，能更好地满足分子生物学的需求。

附图说明

图1为姬松茸子实体、菌丝体总DNA以及北虫草、金针菇、灰树花子实体总DNA的跑胶结果；图中样品依次为：M，北京全式金公司Trans 15K DNA Marker；1，姬松茸子实体总DNA；2，姬松茸菌丝总DNA；3，北虫草子实体总DNA；4，金针菇子实体总DNA；5，灰树花子实体总DNA。

图2为采用该方法提取的姬松茸子实体、菌丝体、干样品DNA以及北虫草、金针菇、灰树花总DNA为模板进行ITS序列扩增；图中样品依次为：M，北京全式金公司Trans 15K DNAMarker；1，姬松茸子实体ITS片段；2，姬松茸菌丝体ITS片段；3，姬松茸干样品ITS片段；4，北虫草子实体ITS片段；5，金针菇子实体ITS片段；6，灰树花子实体ITS片段。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进一步说明，只是为清楚地说明本发明所作的举例，不应理解为对本发明的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换仍处于本发明的保护范围之中。

实施例1采用本方法提取姬松茸菌丝体和子实体的总DNA

分别收集同一培养条件下姬松茸的菌丝体和子实体，具体步骤如下：

（2）分别将2-50 mg不同培养时间的姬松茸菌丝体样品和子实体样品研磨后加入裂解液500 μL，混匀，室温 10,000 rpm，离心30 s；

（4）向DNA吸附柱中加入DNA洗涤液 650 μL，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附柱套回废液收集管，室温10,000 rpm离心1 min;

（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL 离心管中，开盖放置1-2 min去除乙醇残留，加入65℃预热的DNA洗脱液30-100μL，静置1-2 min;

（6）12,000 rpm离心2 min，洗脱DNA，保存备用。

经测定，所提菌丝体DNA浓度为190 ng/μL，OD ₂₆₀/OD ₂₈₀为1.786；所提子实体DNA纯度为251 ng/μL，OD ₂₆₀/OD ₂₈₀为1.834。

实施例2不同种类菌菇DNA提取试验

（1）样品预处理：分别取2-50 mg的姬松茸子实体、姬松茸菌丝体、北虫草、金针菇、灰树花子实体样品进行研磨；

（2）向DNA吸附柱中加平衡液200 μL，10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附柱进行预处理；

（3）将研磨后的样品装入离心管内，加入裂解液450 μL，混匀，室温 10,000 rpm，离心30 s；

（4）向DNA吸附柱中加入DNA洗涤液600 μL，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附柱套回废液收集管，室温10,000 rpm离心1 min；

（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL 离心管中，开盖放置1-2 min去除乙醇残留，加入65℃预热的DNA洗脱液30-100μL，静置1-2 min；

（6）12,000 rpm离心2 min，洗脱DNA，取2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，结果表明，五种样品均能得到电泳可见的基因组。

实施例3姬松茸ITS序列PCR扩增

根据姬松茸ITS序列，采用食用菌ITS片段通用引物ITS-4/5，对姬松茸子实体、姬松茸菌丝体、姬松茸干样品、北虫草子实体、金针菇子实体、灰树花子实体ITS片段基因组进行PCR检测。

引物序列为：

ITS-4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’

ITS-5: 5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3’

PCR扩增所用试剂购自北京全式金生物科技有限公司，反应的体系为：

PCR反应的条件为：94℃ 7min → [94℃ 30s → 56℃ 30s → 72℃ 30s] ×34cicles → 72℃ 10min → 4℃。

PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，上样缓冲液为10×Loading Buffer，电泳缓冲液为1×TAE，分子量标准Marker为Trans 15K，溴化乙锭染色，紫外凝胶成像仪在312nm下观察并拍照。结果表明，用通用引物ITS扩增姬松茸子实体、姬松茸菌丝体、姬松茸干样品、北虫草子实体、金针菇子实体、灰树花子实体总DNA，所有样品都能获得大小在600bp左右的目的条带且亮度差异不大（图2），具有广泛的适用性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种提取姬松茸总DNA的试剂及应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

Claims

1.一种提取姬松茸总DNA的试剂，其特征在于，包括以下四种试剂：

（4）DNA洗脱液，包含以下成分：10 mM Tris-HCl，pH 8.5。

2.如权利要求1所述一种利用该试剂提取姬松茸总DNA的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（6）12,000 rpm离心2 min，洗脱DNA，保存备用。

3.根据权利要求2所述的一种提取姬松茸总DNA的方法，其特征在于，所述DNA吸附柱为硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱。

4.如权利要求1所述一种提取姬松茸总DNA的试剂在提取食用菌总DNA或食用菌ITS序列鉴定中的应用。