CN109021127A - 一种马齿苋多糖的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种马齿苋多糖的提取方法。所述方法包括以下步骤：(1)马齿苋原药材粉碎后，采用乙醇或石油醚进行回流提取两次，每次2h，抽滤，烘干得到马齿苋药材粉末备用。(2)马齿苋药材粉末置于高压灭菌锅中进行提取，设定温度范围105‑121℃，提取时间1h。(3)提取出的粗多糖溶液，采用等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)进行萃取去除蛋白质，留取上清水相溶液，将溶液进行旋蒸，采用无水乙醇沉淀过夜，离心分离获得多糖。采用本发明方法提取的多糖产量比传统水浴法提取的多糖量高出89％‑96％，同时本发明方法所采用的设备简单易获取，纯化多糖的方法简单重复性好，整个过程提取成本低廉，适合大规模工业生产使用。

Description

一种马齿苋多糖的提取方法
技术领域
本发明涉及一种马齿苋多糖的提取方法，本发明属于植物有效成分提取技术领域。
背景技术
马齿苋(Portulaca oleracea L.)是一种一年生的药食两用植物。马齿苋起源于印度，现传播到世界各地，野生品种主要分布于墨西哥、欧洲、中国和中东等地，在英国、法国和荷兰等西欧国家发展成了栽培蔬菜。在我国主要有6个品种：马齿苋、毛马齿苋、大花马齿苋、四瓣马齿苋、沙生马齿苋和小琉球马齿苋。马齿苋具有调血脂、抗动脉粥样硬化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖等功效。马齿苋富含丰富的ω-3脂肪酸，能降低人体血清中的胆固醇和甘油三酯含量，可预防血小板凝聚。此外，马齿苋富含多种微量元素K、Ca、Mg、Zn和Fe等。马齿苋还富含丰富的蛋白质和多糖，其中多糖与其他物质能形成聚合物，低聚糖能促进肠道内益生菌(双歧杆菌)的增殖，改善肠道菌群结构，活性低聚糖可替代或部分替代蔗糖作为甜味剂。多聚糖可进行免疫调节，阻止个体对毒素和放射性元素的吸收，具有降低血压、血脂，延缓衰老的功效。
目前针对马齿苋多糖的提取方法主要有：1)用95％乙醇作挟带剂，采用CO2超临界萃取，萃取物用1,3-丁二醇回收有机相，干燥后进行酶水解，进行水提取过滤并加入活性炭和白土，离心干燥后获得多糖(CN105193876A)；2)采用高压脉冲电场低温提取马齿苋多糖(CN103665177A)；3)微波辅助提取马齿苋多糖(CN102241785A)；4)果胶酶酶解提取马齿苋多糖(CN106117381A)。但现有的马齿苋多糖提取方法涉及的设备昂贵复杂(高电压脉冲、微波和CO2超临界萃取)或处理工序繁琐(果胶酶酶解等)，不利于实际应用生产。
发明内容
鉴于目前现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供了一种简单高效的提取马齿苋多糖的方法。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种马齿苋多糖的提取方法，其包括以下步骤：
(1)将称取马齿苋药材进行粉碎，药材粉末采用40目的筛子进行筛选，每10g马齿苋粉末加入80～120ml乙醇或石油醚，在60℃回流提取2次，每次2h，回流提取后进行抽滤，烘干得到马齿苋药材粉末备用；
(2)将步骤(1)得到的马齿苋药材粉末，置于三角瓶中，按照每1g马齿苋粉末加入30～50ml的水的量加入水进行混合；将混合物放入高压灭菌锅中，设定温度为105～121℃，时间1h，进行多糖提取；提取结束后，将提取液离心分离，保留上清溶液即为粗多糖溶液；
(3)将粗多糖溶液旋蒸浓缩，使其体积为原体积的1/5～1/3，然后按照体积比1:1加入苯酚:氯仿:异戊醇的混合物，充分震荡混匀，将溶液转入离心瓶静置，离心，保留上层水相溶液，抽提两次；
(4)按照上层水相溶液:乙醇＝1:10的体积比加入乙醇，充分混匀，置于4℃冰箱放置12h，将醇沉的多糖溶液转入离心瓶，离心，保留沉淀；
(5)沉淀放入冻干机中冻干，即得马齿苋多糖。
其中，优选的，步骤(1)中每10g马齿苋粉末加入100ml乙醇或石油醚。
其中，优选的，步骤(2)中将混合物放入高压灭菌锅中，设定温度为105～121℃，时间1h，进行多糖提取。
其中，优选的，步骤(2)中所述的离心是指20000×g，25℃，离心30min。
其中，优选的，步骤(3)中所述的离心是指12000×g，25℃，离心30min。
其中，优选的，步骤(4)中所述的离心是指20000×g，25℃，离心30min。
其中，优选的，步骤(4)中所述的苯酚:氯仿:异戊醇的混合物中，苯酚:氯仿:异戊醇体积比＝25:24:1。
其中，优选的，所述的乙醇均为无水乙醇。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
采用本发明能提高马齿苋多糖的提取率，同时所采用的设备简单易获取，纯化多糖的方法简单重复性好，整个过程提取成本低廉。
以传统的水浴法作为对照组，高压灭菌锅提取法作为方法组，提取时间均为1h。检测结果表明：高压灭菌锅法提取的多糖产量比传统水浴法提取的多糖量高出89％-96％，其中高压灭菌锅提取法条件为121℃，压力为0.12mpa时，从每克马齿苋药材用能提取出0.065g多糖，而水浴提取只能提出0.033g，比水浴提取法多提出0.032g。后续多提取的多糖进行纯化，结果表明采用石油醚或者乙醇脱脂，后续采用苯酚:氯仿:异戊醇进行去蛋白，醇沉后获得的纯化多糖得率优于采用TCA(三氯乙酸)去蛋白，前者处理获得纯化多糖的得率高出后者220％以上。
附图说明
图1为不同提取方法获得马齿苋多糖的质量比较；
图2为不同方法纯化获得的马齿苋多糖。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下，可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1马齿苋多糖的高效提取方法
具体步骤如下：
(1)称取一定质量的马齿苋药材进行粉碎，药材粉末采用40目的筛子进行筛选，按照每10g马齿苋粉末加入100ml无水乙醇的比例(料液比为1:10)加入无水乙醇，在60℃回流提取2次，每次2h，回流提取后进行抽滤，烘干得到马齿苋药材粉末备用；
(2)分别称取1g步骤(1)得到的马齿苋粉末，置于三角瓶中，按照每1g马齿苋粉末加入40ml的水(料液比＝1:40)的量加入水进行混合。将混合物放入高压灭菌锅中，设定温度为105～121℃，时间1h，进行多糖提取。提取结束后，将提取液离心分离，20000×g，25℃，离心30min，保留上清溶液即为粗多糖溶液；
(3)将粗多糖溶液旋蒸浓缩，浓缩使其体积在10ml左右，按照体积比1:1加入苯酚:氯仿:异戊醇的混合物(25:24:1)，充分震荡混匀，将溶液转入离心瓶静置10min，12000×g，25℃，离心30min，保留上层水相溶液，抽提两次。
(4)按照上层水相溶液:无水乙醇＝1:10的体积比加入无水乙醇，充分混匀，置于4℃冰箱放置12h，将醇沉的多糖溶液转入离心瓶，20000×g，25℃，离心30min，保留沉淀。
(5)沉淀放入冻干机中冻干，即得马齿苋多糖。
将冻干物称重，加入适量的纯水，在超声清洗仪的辅助下进行溶解，取1ml进行多糖含量的测定。
实施例2马齿苋多糖的高效提取方法
具体步骤同实施例1，区别仅在于将高压灭菌锅的温度设定为110℃。
实施例3马齿苋多糖的高效提取方法
具体步骤同实施例1，区别仅在于将高压灭菌锅的温度设定为115℃。
实施例4马齿苋多糖的高效提取方法
具体步骤同实施例1，区别仅在于将高压灭菌锅的温度设定为121℃。
实施例5马齿苋多糖的高效提取方法
具体步骤同实施例1，区别仅在于将步骤(1)回流提取中使用的无水乙醇替换为石油醚。
对比例1
具体步骤同实施例1，区别仅在于步骤(2)中将混合物放入水浴锅中，设定温度为100℃，时间1h，进行多糖提取。
对比例2
具体步骤同实施例1，区别仅在于将步骤(3)中的苯酚:氯仿:异戊醇的混合物(25:24:1)替换为TCA。
对比例3
具体步骤同实施例5，区别仅在于将步骤(3)中的苯酚:氯仿:异戊醇的混合物(25:24:1)替换为TCA。
实施例6多糖含量的测定
多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，具体步骤如下：
1)绘制葡萄糖标准曲线：将葡萄糖用冷冻干燥机进行1天的干燥处理，使用天平准确称取葡萄糖50mg，溶解后转入50ml容量瓶中，用水定容至50ml。
2)吸取0、50、100、200、300、400、500μl的葡萄糖标准品母液，向其中分别添加500、450、400、300、200、100、0μl去离子水，则得出浓度值为0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、1.0mg/ml的标准梯度溶液，向标准液中加入0.25ml的苯酚溶液(6％)，再加入1.25ml浓H2SO4，置于60℃水浴锅中孵育10min,室温下冷却20min，采用紫外-可见分光光度计测定在490nm的波长处溶液的吸光值，每个浓度重复3次。以吸光度为纵坐标，标准葡萄糖溶液浓度为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
3)样品的反应条件和步骤同标准曲线，测定吸光值，根据标准曲线公式计算实施例1-5以及对比例1-3中所得到的溶液中多糖的浓度。
结果：
图1为不同提取方法获得马齿苋多糖的质量比较，图1结果表明：采用高压灭菌锅法提取马齿苋粗多糖，均提取1小时，四种不同温度条件所获得的马齿苋粗多糖均极显著高于水浴提取法。高压灭菌锅法提取的多糖产量比传统水浴法提取的多糖量高出89％-96％，其中高压灭菌锅提取法条件为121℃，从每克马齿苋药材用能提取出0.065g多糖，而水浴提取只能提出0.033g，比水浴提取法多提出0.032g，高出水浴法96％以上。
图2为不同方法纯化获得的马齿苋多糖，图2结果表明：采用石油醚或者乙醇脱脂，后续采用苯酚:氯仿:异戊醇进行去蛋白，醇沉后获得的纯化多糖得率优于采用TCA(三氯乙酸)去蛋白，前者处理获得纯化多糖的得率高出后者220％以上。采用石油醚和乙醇进行脱脂，对纯化多糖产量的影响没有显著差异。

Claims (8)

1.一种马齿苋多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将称取马齿苋药材进行粉碎，药材粉末采用40目的筛子进行筛选，每10g马齿苋粉末加入80～120ml乙醇或石油醚，在60℃回流提取2次，每次2h，回流提取后进行抽滤，烘干得到马齿苋药材粉末备用；
(2)将步骤(1)得到的马齿苋药材粉末，置于三角瓶中，按照每1g马齿苋粉末加入30～50ml的水的量加入水进行混合；将混合物放入高压灭菌锅中，设定温度为105～121℃，时间1h，进行多糖提取；提取结束后，将提取液离心分离，保留上清溶液即为粗多糖溶液；
(3)将粗多糖溶液旋蒸浓缩，使其体积为原体积的1/5～1/3，然后按照体积比1:1加入苯酚:氯仿:异戊醇的混合物，充分震荡混匀，将溶液转入离心瓶静置，离心，保留上层水相溶液，抽提两次；
(4)按照上层水相溶液:乙醇＝1:10的体积比加入乙醇，充分混匀，置于4℃冰箱放置12h，将醇沉的多糖溶液转入离心瓶，离心，保留沉淀；
(5)沉淀放入冻干机中冻干，即得马齿苋多糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中每10g马齿苋粉末加入100ml乙醇或石油醚。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中将混合物放入高压灭菌锅中，设定温度为105-121℃，时间1h，进行多糖提取。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的离心是指20000×g，25℃，离心30min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的离心是指12000×g，25℃，离心30min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的离心是指20000×g，25℃，离心30min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的苯酚:氯仿:异戊醇的混合物中，苯酚:氯仿:异戊醇体积比＝25:24:1。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的乙醇均为无水乙醇。
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