CN108998396B - 一种铁氧化浸矿微生物的培养方法 - Google Patents

一种铁氧化浸矿微生物的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铁氧化浸矿微生物的培养方法，步骤如下：浸矿微生物在培养基中培养至微生物对数期末期，加入铁粉，调节pH，搅拌曝气培养；加入碳酸钙粉末调节pH为2.0‑2.5，搅拌，静置，得到上清液和下部淤泥，淤泥过滤得到滤渣和滤液，上清液与滤液合并后继续曝气培养；重复上述步骤，滤渣返回下一轮沉淀过程，直至上清液中微生物的浓度达到要求，将最后一次培养得到的上清液及下部淤泥过滤后得到的滤液合并，作为生物浸出剂。本发明采用的沉淀方式能够减少微生物在固体表面的吸附、团聚和阻留，降低微生物的损失，沉淀过滤性好，生物浸出剂中微生物的浓度达到109cells/mL以上。

Description

一种铁氧化浸矿微生物的培养方法
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种铁氧化浸矿微生物的培养方法。
背景技术
随着社会对金属资源的需求的不断增加，矿产资源日渐贫杂，实现无废害开采，保护环境，循环利用，成为了资源开发可持续发展客观要求。目前采用传统冶金工艺进行开发利用难度越来越大，而生物冶金技术具有工艺流程简、成本低、适用范围广、安全环保等特点，有望在绿色冶金及重金属废物无害化工艺中充当重要的角色。但在工业化应用中，生物浸出周期通常较长，浸出速率慢的问题是制约生物浸出技术的重点难题。而事实上，提高浸出速率的途径一般是通过增强浸矿微生物的性能和增加体系浸矿微生物的数量。
目前提高浸矿微生物的培养效率，缩短浸出周期的方法主要有：连续培养法、电化学法和超滤膜法等。针对连续培养过程，培养后氧化还原电位可以达到700mV以上，但正常条件下细胞浓度可维持在0.5-3×108cells/mL，如果形成黄钾铁矾，细胞浓度会降低到5×107cells/mL以下，与适宜培养基培养的理想细胞浓度相差甚远。针对电化学培养过程，专利申请号CN200410056929.2公开了一种硫化矿浸矿菌生长的高效电化学培养方法及装置，通过具有可调压外接电源的电化学反应器，连续将培养液中的铁离子被还原为亚铁离子，在标准9K培养基中，利用该方法浸矿菌细胞浓度可提高到109cells/mL，培养周期可缩短到24小时，且菌液的氧化活性提高20-30％，适合小规模的高效培养。但该方法需要配制专用电化学反应器，且消耗大量的电能。而且浸矿微生物通常对金属的腐蚀性较大，要特殊的电极材料，大规模生产设备的制造成本较高。
超滤膜法采用微纳米孔截留的方式，经过反复的过滤，随着培养液体积不断缩小，微生物可以以极高的细胞浓度进行浓缩。但浓缩的过程是靠高压循环泵来驱动，反复浓缩形成的大量热量和剪切力都会对微生物细胞造成伤害，影响微生物活性，且随着细胞浓度增加膜容易造成膜堵塞，当浸矿微生物浓度浓缩到1012cells/mL以上很难进一步浓缩。浓缩过程也产生了大量无菌的废液，大量的含铁、氨氮、磷酸根及硫酸根离子无法直接排放。
此外，还有一种缩短浸矿微生物延滞期的方法，专利申请号CN201210322233.4公开了一种快速启动铁氧化菌活性的细胞培养方法，仅仅是以提高种液活性为目的，接种前先将接种液中可能抑制微生物生长的底物还原成细菌可利用的能源物质，将接种后的延滞期由原来的15-30小时的缩短至6-10小时，适用于铁氧化菌培养的快速启动或者扩大培养，虽然可以提高细胞活性，但溶液中的细胞浓度没有明显提高，延滞期后到亚铁完全氧化的时间仍然在40-50小时左右。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种铁氧化浸矿微生物的培养方法。
本发明提供了一种铁氧化浸矿微生物的培养方法，步骤如下：
1)浸矿微生物采用曝气培养，培养基初始亚铁离子浓度6-9g/L，当培养混合液达到要求时，对培养混合液进行搅拌，并加入铁粉，铁粉完全溶解后，总铁离子浓度不超过20g/L，加入硫酸溶液调节pH，继续搅拌曝气培养；
2)当步骤1)中加入硫酸溶液曝气培养后的培养液的氧化还原电位为650-720mV时，加入碳酸钙粉末调节pH为2.0-2.5，搅拌，静置，得到上清液和下部淤泥，下部淤泥过滤得到滤渣和滤液；
3)将上清液与滤液合并后返回步骤1)中继续曝气培养，并补充培养液中亚铁离子，滤渣加入下一次重复步骤2)时加入碳酸钙粉末后得到的培养液中，直至上清液中浸矿微生物的浓度达到要求，将最后一次培养结束得到的上清液及下部淤泥过滤后得到的滤液合并，调节pH，作为生物浸出剂；
4)最后一次培养结束得到的滤渣与载体混合，干燥得到固体菌剂。
优选的，所述步骤1)中铁粉的加入量为6-11g/L。
优选的，所述步骤1)中加入硫酸溶液调节pH为1.0-2.0。
优选的，所述步骤1)中培养混合液达到要求是指培养混合液中浸矿微生物的浓度达到1×108cells/mL。
优选的，所述步骤1)中加入硫酸溶液后曝气培养的时间为7-8小时。
优选的，所述步骤2)中搅拌的时间为30-60min。
优选的，所述步骤2)中静置的时间为30-60min。
优选的，所述步骤3)中上清液中浸矿微生物的浓度要求达到1×109cells/mL以上。
优选的，所述步骤3)中调节pH为1.5-2.0。
优选的，所述步骤4)中载体包括黄铁矿、硅藻土、硫酸钙和铁钒等粉末，载体与滤渣质量比为1-10：1，控制最终有效活菌数在108～1010cells/g。
本发明所述步骤4)中最后一次培养结束得到的滤渣中浸矿微生物的浓度达到1×108cells/g以上。
本发明浸矿微生物重复培养的次数不超过3次，最优选为3次，即加入铁粉的次数为3次。
本发明所述铁粉的粒径为200目。
本发明所述曝气培养的曝气量为0.1-0.3vvm。
本发明步骤2)中所述补充亚铁离子使其浓度为6-9g/L，可通过加入硫酸亚铁实现。
本发明所述步骤2)中加入碳酸钙粉末调节pH后，静置之前的培养液中可加入铁钒晶体。
本发明的铁氧化浸矿微生物为嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)、钩端螺旋菌属(Leptospirillum)和硫化杆菌属(Sulfobacillus)中具有铁氧化能力的菌种中的一种，优选为氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum)、或嗜热硫氧化硫化杆菌(Sulfobacillusthermosulfidooxidans)中的一种。这类微生物以自养菌和兼性自养菌为主，9K培养基中的各类基础盐含量非常充足，可以满足其高密度生长，而溶液中溶解的空气和氧、二氧化碳浓度可以通过曝气连续补充。
目前，在微生物的培养过程中尚未见加铁粉直接还原以提供能源为目标的培养方法。专利申请号CN201210322233.4是基于减少三价铁离子对微生物的影响为出发点的方案，利用还原剂将铁氧化菌菌液中对微生物有抑制作用的三价铁离子还原，然后再接种到新鲜的培养基或反应堆，或者将菌液接种到新鲜的培养基、反应堆以后，提高微生物的活性，缩短延滞期，适用于铁氧化菌培养的快速启动或者扩大培养，虽然可以提高细胞活性，但溶液中的细胞浓度没有明显提高，延滞期后到亚铁完全氧化的时间仍然在40-50小时左右，并且加铁粉还原后需要接种到新的培养基上，培养基中的营养物质未完全消耗，造成原料和能源的浪费。
本发明将微生物培养后的培养混合液作为整体，以氧化还原电位为指标，将培养混合液中三价铁一步还原(为微生物提供电子)，继续培养微生物，达到指定高浓度细胞后再沉淀制备固体菌剂。本发明浸矿微生物培养过程中需要严格控制培养液中总铁离子的浓度和铁粉加入的时机，选择9K培养基(即9g/L Fe2+)，当培养混合液的氧化还原电位达到650mV以上或者微生物的浓度达到108cells/mL以上时，加入铁粉，铁粉不可无限制添加，本申请加入铁粉的量为6-11g/L，一步还原后培养液中的亚铁离子浓度不超过20g/L，优选为15～20g/L。在此基础上进行高密度培养能够大大缩短培养时间，可降至7-8小时，培养效率高，加入铁粉为高密度培养提供更多的能源，补充能源的过程中不引入新的杂质，并且经过一次或多次重复培养后微生物的浓度能够达到109cells/mL，一轮培养后溶液中的三价铁离子的浓度接近20g/L。
虽然本领域技术人员知晓三价铁离子的存在会影响浸矿微生物的浓度和活性，但是并不会选择在微生物培养的过程中将培养液中的三价铁离子除去，因为目前常规沉淀除去三价铁离子的方法主要分两大类：一类是需要加热到80℃以上，得针铁矿晶体或铁钒沉淀，易过滤，但高温对非嗜热的微生物来说是致命的；另一类是直接中和絮凝沉淀，不仅需要严格控制pH值，而且一旦形成胶体，难过滤，大量的微生物容易吸附在沉淀渣上，随沉淀渣排出，该部分微生物无法很好的回收利用，造成培养液中微生物的浓度较低，浸出效率较差。而且，常规除铁方法是在浸出矿物后再除去浸出液中的三价铁离子，尾液回用，以减少废水的排放，但除铁尾渣由于资源化价值非常低一般不会进一步利用，或利用成本较高，采用常规的反复中和沉淀法，会形成大量无用的废渣，且操作麻烦，处理时间和处理成本都会增加，且微生物很难达到较高的浓度。另外，常规添加的碱或者絮凝剂难以保证微生物在浸出前恢复到高活性状态，且增加试剂成本。综上所述，本领域技术人员不会想到采用类似于沉淀的方法进行微生物的高密度培养。
本发明中和沉淀工段是采用对微生物影响较小的碳酸钙作为沉淀剂调节pH为2.0～2.5，控制沉淀搅拌的时间为30-60min，静置30-60min，得到的产物是硫酸钙和氢氧化铁，本申请发明人通过研究发现，只有采用碳酸钙为沉淀剂，并且将pH、沉淀搅拌时间和静置时间都控制在本申请的范围内，才能够减少微生物在固体表面的吸附，降低微生物的损失；并且本发明人发现，加入碳酸钙中和之前培养液中微生物的浓度达到108cells/mL以上，在此高微生物浓度作用下，微生物自身成核结晶，沉淀结晶度高，并且用碳酸钙微调pH，一方面产生的二氧化碳能减少沉淀物的团聚，另一方面沉淀物中夹杂硫酸钙和微生物诱发形成的晶体，即使形成少量的胶体，对过滤性影响也不大(而常规的化学中和沉淀形成胶体后可能导致沉淀无法过滤)；在此浓度和碳酸钙的共同配合下，沉淀得到的沉淀物过滤性要好于以其他物质为沉淀剂或者微生物浓度小于108cells/mL时得到的沉淀物的过滤性，易于固液分离，工艺简单，生产效率高，并且最终沉淀物的主要成分为硫酸钙、氢氧化铁、铁矾等，安全环保，因为沉淀前微生物的浓度已经达到108cells/mL以上，该沉淀物微生物含量约为108cells/g，将该沉淀物与黄铁矿混合干燥后可以制备相应的固态菌剂，便于保藏运输。
本发明加入碳酸钙沉淀过滤后得到的滤液和上清液混合后，pH值至1.5～2.0，以减少菌液活性的下降。
本发明通过添加碳酸钙处理，碳酸钙对本发明微生物的影响较小，且添加碳酸钙会生成二氧化碳，为微生物生长提供营养，同时将三价铁离子去除，减少对微生物生长的抑制，且避免浸出过程中铁离子浓度过高的问题，减轻了下游分离难度，节省了分离成本；该操作可以循环培养，溶液中的微生物浓度接近饱和状态，且添加的铁粉和碳酸钙均不会在溶液中积累。
本发明采用循环培养法(以9K培养基为基础重复不超过3次)，一方面培养液中微生物浓度可以达到较高的水平，用于制备高浓度的液体菌剂；另一方面，微生物含量较高的沉淀渣也可以得到充分的利用作为固体菌剂。
现有的培养技术细胞浓度108cells/mL，细胞浓度很难提升，采用的培养基的营养物质尚未得到充分有效的利用。三价铁离子作为代谢产物会对微生物生长造成影响，本发明是在现有培养技术的基础上，在微生物细胞浓度达到接近108cells/mL之后，添加铁粉将三价铁离子还原，形成亚铁离子浓度两倍于初始浓度的培养液，且微生物浓度接近108cells/mL，并结合碳酸钙使铁离子产生沉淀，还原和沉淀交替进行(若只有铁粉还原，渗透压过高，抑制微生物的培养，细胞浓度难以提高)，使得微生物短期内快速对数方式增值，缩短培养周期，三价铁浓度的减少也保证了培养液的高活性，且微生物浓度大幅提高，达到109cells/mL以上。
本发明的有益效果是：
1、本发明浸矿微生物培养过程中需要严格控制培养液中总铁离子的浓度和铁粉加入的时机，当培养混合液的氧化还原电位达到650mV以上或者微生物的浓度达到108cells/mL以上时，加入铁粉，一步还原后培养液中的亚铁离子浓度不超过20g/L，在此基础上进行高密度培养能够大大缩短培养时间，可降至7-8小时，培养效率高，加入铁粉为高密度培养提供更多的能源，补充能源的过程中不引入新的杂质，并且经过一次或多次重复培养后微生物的浓度能够达到109cells/mL，培养后溶液中的三价铁接近20g/L。
2、本发明采用对微生物影响较小的碳酸钙作为沉淀剂调节pH为2.0～2.5，控制沉淀搅拌的时间为30-60min，静置30-60min，得到的产物是硫酸钙和氢氧化铁，本申请发明人通过研究发现，只有采用碳酸钙为沉淀剂，并且将pH、沉淀搅拌时间和静置时间都控制在本申请的范围内，才能够减少微生物在固体表面的吸附，降低微生物的损失。
3、本发明加入碳酸钙中和之前培养液中微生物的浓度达到108cells/mL以上，在此浓度和碳酸钙的共同配合下，沉淀得到的沉淀物过滤性要好于以其他物质为沉淀剂或者微生物浓度小于108cells/mL时得到的沉淀物的过滤性，易于固液分离，工艺简单，生产效率高。
4、本发明操作简单，对于不符合微生物浓度要求的液体可以进一步曝气培养，有效控制了溶液体积，提高了单位浸出液的处理效率，缩短浸出周期。
5、本发明通过添加碳酸钙中和处理，碳碳酸钙对本发明微生物的影响较小，且添加碳酸钙会生成二氧化碳，为微生物生长提供营养，同时将三价铁离子去除，减少对微生物生长的抑制，且避免浸出过程中铁离子浓度过高的问题，减轻了下游分离难度，节省了分离成本；该操作可以循环培养，溶液中的微生物浓度接近饱和状态，且添加的铁粉和碳酸钙均不会在溶液中积累。
附图说明
图1为本发明培养方法的工艺流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
1)在5L的曝气填料槽中培养氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)，培养基为标准9K培养基，pH值1.8，控制温度30℃，采用微孔曝气，曝气量0.3vvm，初始微生物浓度为1.2×107cells/mL，培养48小时，微生物浓度达到1×108cells/mL，氧化还原电位671mV，将培养液转移到一个5L锥底搅拌培养槽内，搅拌，并加入粒径为200目的铁粉30g，铁粉完全溶解后，总铁离子浓度不超过20g/L，再加入硫酸溶液调节pH为1.8，继续搅拌曝气培养8小时，搅拌转速60rpm，曝气量0.3vvm；
2)步骤1)中加入硫酸溶液曝气培养后的培养液的氧化还原电位为650-716mV时，将培养液转移至另一个5L的沉淀槽内，加入碳酸钙粉末调节pH为2.5，搅拌30min，静置沉降60min，得到上清液和下部淤泥，下部淤泥过滤得到滤渣和滤液；
3)将上清液与滤液合并后返回步骤1)中继续曝气培养，并加入硫酸亚铁补充培养液中亚铁离子浓度至6g/L，滤渣加入下一次重复步骤2)时加入碳酸钙粉末后得到的培养液中，重复培养3次，上清液中浸矿微生物的浓度达到2.2×109cells/mL，将最后一次培养结束得到的上清液及下部淤泥过滤后得到的滤液合并，加硫酸溶液调节pH为1.8，作为生物浸出剂；
4)最后一次培养结束得到的滤渣与黄铁矿混合，黄铁矿与滤渣质量比为1：1，低温干燥得到固体菌剂，固体菌剂中浸矿微生物的浓度为7.6×108cells/g，可以作为接种菌剂，加入保护剂可以延长保存时间。
实施例2
1)在300L的曝气填料槽中培养活性嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)，培养基为标准9K培养基，初始亚铁离子浓度为9g/L，初始微生物浓度1.5×107cells/mL，pH值1.5，控制温度45℃，采用微孔曝气，曝气量0.3vvm，培养48小时，微生物浓度达到2.4×108cells/mL，氧化还原电位705mV，将培养液转移到一个300L锥底搅拌培养槽内，搅拌，并加入粒径为200目的铁粉2.7Kg，铁粉完全溶解后，总铁离子浓度不超过20g/L，再加入硫酸溶液调节pH为1.0，继续搅拌曝气培养7小时，搅拌转速120rpm，曝气量0.1vvm；
2)步骤1)中加入硫酸溶液曝气培养后的培养液的氧化还原电位为665-718mV时，将培养液转移至另一个300L的沉淀槽内，加入碳酸钙粉末调节pH为2.5，搅拌60min，静置沉降60min，得到上清液和下部淤泥，下部淤泥过滤得到滤渣和滤液；
3)将上清液与滤液合并后返回步骤1)中继续曝气培养，并加入硫酸亚铁补充培养液中亚铁离子浓度至9g/L，滤渣加入下一次重复步骤2)时加入碳酸钙粉末后得到的培养液中，重复培养3次，上清液中浸矿微生物的浓度达到1.8×109cells/mL，将最后一次培养结束得到的上清液及下部淤泥过滤后得到的滤液合并，加硫酸溶液调节pH为1.5，作为生物浸出剂；
4)最后一次培养结束得到的滤渣与硅藻土混合，硅藻土与滤渣质量比为2：1，低温干燥得到固体菌剂，固体菌剂中浸矿微生物的浓度为3×108cells/g，可以作为接种菌剂，加入保护剂可以延长保存时间。
实施例3
1)在1000L的曝气填料槽中培养嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilumYSK)和嗜热硫氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosulfidooxidansYN22)混合菌，培养基为标准9K培养基，初始亚铁离子浓度为9g/L，添加酵母0.005％，初始微生物浓度2×107cells/mL，pH值1.5，控制温度45℃，采用微孔曝气，曝气量0.3vvm，培养60小时，微生物浓度达到2.4×108cells/mL，氧化还原电位675mV，将培养液转移到一个1000L锥底搅拌培养槽内，搅拌，并加入粒径为200目的铁粉11Kg，铁粉完全溶解后，总铁离子浓度不超过20g/L，再加入硫酸溶液调节pH为2.0，继续搅拌曝气培养8小时，搅拌转速120rpm，曝气量0.1vvm；
2)步骤1)中加入硫酸溶液曝气培养后的培养液的氧化还原电位为660-718mV时，将培养液转移至另一个1000L的沉淀槽内，加入碳酸钙粉末调节pH为2.0，搅拌30min，静置沉降30min，得到上清液和下部淤泥，下部淤泥过滤得到滤渣和滤液；
3)将上清液与滤液合并后返回步骤1)中继续曝气培养，并加入硫酸亚铁补充培养液中亚铁离子浓度至9g/L，滤渣加入下一次重复步骤2)时加入碳酸钙粉末后得到的培养液中，重复培养3次，上清液中浸矿微生物的浓度达到1.6×109cells/mL以上，将最后一次培养结束得到的上清液及下部淤泥过滤后得到的滤液合并，加硫酸溶液调节pH为1.5-2.0，作为生物浸出剂；
4)最后一次培养结束得到的滤渣与硫酸钙混合，硫酸钙与滤渣质量比为10：1，低温干燥得到固体菌剂，固体菌剂中浸矿微生物的浓度为1.6×108cells/g，可以作为接种菌剂，加入保护剂可以延长保存时间。
对比例1
1)在300L的曝气填料槽中培养活性嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)，培养基为标准9K培养基，初始亚铁离子浓度为9g/L，初始微生物浓度1.5×107cells/mL，pH值1.5，控制温度45℃，采用微孔曝气，曝气量0.3vvm，培养48小时，微生物浓度达到2.4×108cells/mL，氧化还原电位705mV，将培养液转移到一个300L锥底搅拌培养槽内，搅拌，并加入粒径为200目的铁粉2.7Kg，铁粉完全溶解后，总铁离子浓度不超过20g/L，再加入硫酸溶液调节pH为1.0，继续搅拌曝气培养7小时，搅拌转速120rpm，曝气量0.1vvm；
2)步骤1)中曝气培养完成后的培养液，再加入粒径为200目的铁粉2.7Kg，铁粉完全溶解后，加入硫酸溶液调节pH为1.0，继续搅拌曝气培养7小时，搅拌转速120rpm，曝气量0.1vvm；
3)步骤2)得到的培养液再加入铁粉2.7Kg，曝气培养7小时，得到的培养液作为生物浸出剂。
对比例2
1)在300L的曝气填料槽中培养活性嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)，培养基为标准9K培养基，初始亚铁离子浓度为9g/L，初始微生物浓度1.5×107cells/mL，pH值1.5，控制温度45℃，采用微孔曝气，曝气量0.3vvm，培养48小时，微生物浓度达到2.4×108cells/mL，氧化还原电位705mV，将培养液转移到一个300L锥底搅拌培养槽内，搅拌，并加入粒径为200目的铁粉2.7Kg，铁粉完全溶解后，总铁离子浓度不超过20g/L，再加入硫酸溶液调节pH为1.0，继续搅拌曝气培养7小时，搅拌转速120rpm，曝气量0.1vvm；
2)步骤1)中加入硫酸溶液曝气培养后的培养液的氧化还原电位为665-718mV时，将培养液转移至另一个300L的沉淀槽内，加入碳酸钠粉末调节pH为2.5，搅拌60min，静置沉降60min，得到上清液和下部淤泥，下部淤泥过滤得到滤渣和滤液；
3)将上清液与滤液合并后返回步骤1)中继续曝气培养，并加入硫酸亚铁补充培养液中亚铁离子浓度至9g/L，滤渣加入下一次重复步骤2)时加入碳酸钠粉末后得到的培养液中，重复培养3次，将最后一次培养结束得到的上清液及下部淤泥过滤后得到的滤液合并，加硫酸溶液调节pH为1.5，作为生物浸出剂；
4)最后一次培养结束得到的滤渣与黄铁矿混合，黄铁矿与滤渣质量比为2：1，低温干燥得到固体菌剂。
对比例3
1)在300L的曝气填料槽中培养活性嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)，培养基为标准9K培养基，初始亚铁离子浓度为9g/L，初始微生物浓度1.5×107cells/mL，pH值1.5，控制温度45℃，采用微孔曝气，曝气量0.3vvm，培养6小时，微生物浓度达到2.4×107cells/mL，将培养液转移到一个300L锥底搅拌培养槽内，搅拌，并加入粒径为200目的铁粉4Kg(总铁离子浓度超过20g/L)，铁粉完全溶解后，再加入硫酸溶液调节pH为1.0，继续搅拌曝气培养7小时，搅拌转速120rpm，曝气量0.1vvm；
2)步骤1)中加入硫酸溶液曝气培养后的培养液的氧化还原电位为665-718mV时，将培养液转移至另一个300L的沉淀槽内，加入碳酸钙粉末调节pH为2.5，搅拌60min，静置沉降60min，得到上清液和下部淤泥，下部淤泥过滤得到滤渣和滤液；
3)将上清液与滤液合并后返回步骤1)中继续曝气培养，并加入硫酸亚铁补充培养液中亚铁离子浓度至9g/L，滤渣加入下一次重复步骤2)时加入碳酸钙粉末后得到的培养液中，重复培养3次，将最后一次培养结束得到的上清液及下部淤泥过滤后得到的滤液合并，加硫酸溶液调节pH为1.5，作为生物浸出剂；
4)最后一次培养结束得到的滤渣与黄铁矿混合，黄铁矿与滤渣质量比为2：1，低温干燥得到固体菌剂，固体菌剂中浸矿微生物的浓度为3×108cells/g，可以作为接种菌剂，加入保护剂可以延长保存时间。
对比例4
1)在300L的曝气填料槽中培养活性嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)，培养基为标准9K培养基，初始亚铁离子浓度为9g/L，初始微生物浓度1.5×107cells/mL，pH值1.5，控制温度45℃，采用微孔曝气，曝气量0.3vvm，培养48小时，微生物浓度达到2.4×108cells/mL，氧化还原电位705mV，将培养液转移到一个300L锥底搅拌培养槽内，搅拌，并加入粒径为200目的铁粉2.7Kg，铁粉完全溶解后，总铁离子浓度不超过20g/L，再加入硫酸溶液调节pH为1.0，继续搅拌曝气培养7小时，搅拌转速120rpm，曝气量0.1vvm；
2)步骤1)中加入硫酸溶液曝气培养后的培养液的氧化还原电位为665-718mV时，将培养液转移至另一个300L的沉淀槽内，加入碳酸钙粉末调节pH为3，搅拌120min，静置沉降90min，得到上清液和下部淤泥，下部淤泥过滤得到滤渣和滤液；
3)将上清液与滤液合并后返回步骤1)中继续曝气培养，并加入硫酸亚铁补充培养液中亚铁离子浓度至9g/L，滤渣加入下一次重复步骤2)时加入碳酸钙粉末后得到的培养液中，重复培养3次，将最后一次培养结束得到的上清液及下部淤泥过滤后得到的滤液合并，加硫酸溶液调节pH为1.5，作为生物浸出剂；
4)最后一次培养结束得到的滤渣与黄铁矿混合，黄铁矿与滤渣质量比为2：1，低温干燥得到固体菌剂，固体菌剂中浸矿微生物的浓度为3×108cells/g，可以作为接种菌剂，加入保护剂可以延长保存时间。
将实施例1-3得到的固体菌剂放置半个月后，在2L的烧杯内，以15％(w/v)接种量加入到1L新鲜的9K培养基上，通过水浴控制温度45℃，经过在60小时曝气培养，亚铁离子几乎完全氧化，溶液中细胞浓度分别达到1.8×108cells/mL、1.2×108cells/mL和3.6×108cells/mL，该方法制备的菌剂可以满足固体菌剂的需求。
将实施例2得到的生物浸出剂，浸出剂细胞浓度稀释到3×108cells/mL后，用于处理废弃线路板残渣(含铜量1.57％，含铁量0.41％)，搅拌浸出周期可以缩短至2小时，且铜的浸出率达到99.9％，浸出渣含铜量45mg/Kg，重金属解毒彻底，固液分离后浸出渣可以进一步资源化利用。
将实施例2得到的生物浸出剂，浸出剂细胞浓度稀释到3×108cells/mL后，用于处理含铜污泥，浸出周期可以缩短至4小时以内，且铜的浸出率达到99％，铁的浸出率达到98％，浸出渣含铜量为98mg/Kg，重金属解毒彻底。
将实施例2得到的生物浸出剂，浸出剂细胞浓度稀释到3×108cells/mL后，用于处理复杂电镀污泥，其中污泥中含铜7.56％，锌5.72％，镍7.9％，铬7.11％，铁3.28％；搅拌浸出时间4小时，且铜、锌、镍、铬的浸出率分别达到99.9％，99.9％，99.8％，99.8％，浸出渣含铜量45mg/Kg，含锌量195mg/Kg，含镍量50mg/Kg，含铬量125mg/Kg，重金属解毒彻底，固液分离后，该渣可以进一步资源化利用。
以上实验说明采用本发明的培养方法得到的生物浸出剂，能够用于从多种生物冶金废渣及污泥中分离提取出各种金属离子，应用范围广泛，并且浸出周期大大缩短，各金属元素的浸出率都达到98％以上，金属回收利用率高，使金属资源得到了高效的利用。
测定实施例1-3和对比例1-4得到的生物浸出剂中浸矿微生物的浓度，结果如表1，将实施例1-3和对比例1-4得到的生物浸出剂用于处理复杂电镀污泥，其中污泥中含铜7.56％，锌5.72％，镍7.9％，铬7.11％，铁3.28％；搅拌浸出4小时后，测定铜、锌、镍、铬的浸出率，结果如表1。
表1生物浸出剂中微生物的浓度以及各金属的浸出率
注：实施例1-3、对比例1和对比例3中的微生物浓度均稀释到3×108cells/mL后开始浸出试验。
从表1中的数据可知，采用本发明的培养方法得到的生物浸出剂中微生物的浓度均达到了1×109cells/mL以上，远高于对比例1-4中所得生物浸出剂中微生物的浓度，并且处理复杂电镀污泥时，铜、锌、镍、铬的浸出率都较高。
实施例2与对比例1相比，说明只有还原和沉淀交替进行，才能使得微生物短期内快速对数方式增值，缩短培养周期，三价铁浓度的减少也保证了培养液的高活性，且微生物浓度大幅提高，达到109cells/mL以上，若只有铁粉还原，渗透压过高，抑制微生物的培养，细胞浓度难以提高。
实施例2与对比例2相比，说明用碳酸钙作为沉淀剂调节pH相比于碳酸钠，能够减少微生物在固体表面的吸附，降低微生物的损失，并且培养液中无钠离子的存在，不会对微生物产生抑制，对微生物影响较小。
实施例2与对比例3相比，说明本发明浸矿微生物培养过程中需要严格控制培养液中总铁离子的浓度和铁粉加入的时机，当培养混合液的氧化还原电位达到650mV以上或者微生物的浓度达到108cells/mL以上时，加入铁粉，一步还原后培养液中的亚铁离子浓度不超过20g/L，在此基础上进行高密度培养能够大大缩短培养时间，单批培养时间可降至7-8小时，培养效率高，加入铁粉为高密度培养提供更多的能源，补充能源的过程中不引入新的杂质，并且经过一次或多次重复培养后微生物的浓度能够达到109cells/mL。
实施例2与对比例4相比，说明本发明用碳酸钙调节pH为2.0～2.5，控制沉淀搅拌的时间为30-60min，静置30-60min，将pH、沉淀搅拌时间和静置时间都控制在本申请的范围内，才能够减少微生物在固体表面的吸附，降低微生物的损失。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种铁氧化浸矿微生物的培养方法，其特征在于，步骤如下：
浸矿微生物采用曝气培养，培养基初始亚铁离子浓度6-9g/L，当培养混合液中浸矿微生物的浓度达到1×108cells/mL时，对培养混合液进行搅拌，并加入铁粉，铁粉完全溶解后，总铁离子浓度不超过20g/L，加入硫酸溶液调节pH，继续搅拌曝气培养；
当步骤1）中加入硫酸溶液曝气培养后的培养液的氧化还原电位为650-720mV时，加入碳酸钙粉末调节pH为2.0-2.5，搅拌，静置，得到上清液和下部淤泥，下部淤泥过滤得到滤渣和滤液；
将上清液与滤液合并后返回步骤1）中继续曝气培养，并补充培养液中亚铁离子，滤渣加入下一次重复步骤2）时加入碳酸钙粉末后得到的培养液中，直至上清液中浸矿微生物的浓度达到要求，将最后一次培养结束得到的上清液及下部淤泥过滤后得到的滤液合并，调节pH，作为生物浸出剂；
最后一次培养结束得到的滤渣与载体充分混合，干燥得到固体菌剂。
2.如权利要求1所述的铁氧化浸矿微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤1）中铁粉的加入量为6-11g/L。
3.如权利要求1所述的铁氧化浸矿微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤1）中加入硫酸溶液调节pH为1.0-2.0。
4.如权利要求1所述的铁氧化浸矿微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤1）中加入硫酸溶液后曝气培养的时间为7-8小时。
5.如权利要求1或2所述的铁氧化浸矿微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤2）中搅拌的时间为30-60min。
6.如权利要求1或2所述的铁氧化浸矿微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤2）中静置的时间为30-60min。
7.如权利要求1或2所述的铁氧化浸矿微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤3）中上清液中浸矿微生物的浓度要求达到1×109cells/mL以上。
8.如权利要求1-3任一项所述的铁氧化浸矿微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤3）中调节pH为1.5-2.0。
9.如权利要求1-3任一项所述的铁氧化浸矿微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤4）中载体为黄铁矿、硅藻土、硫酸钙或铁钒，载体与滤渣质量比为1-10：1，控制最终有效活菌数在108~1010 cells/g。
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