CN108992710A - 一种聚己内酯-磷酸三钙骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及骨组织工程技术领域,具体是一种聚己内酯‑磷酸三钙骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法。本发明利用3D打印技术将聚己内酯和磷酸三钙两者的优势结合,构建的PCL‑TCP 3D打印支架通过有机溶剂蚀刻增加表面粗糙程度来进一步提升成骨细胞对其粘附和定殖能力。本发明为该种骨移植替代物的应用提供了一定的理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及骨组织工程技术领域,具体地说,是一种聚己内酯-磷酸三钙骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法。
背景技术
无论是亚洲地区还是欧美国家,骨折、骨肿瘤等疾病的发病率及在骨移植方面的支出不断上升。临床上治疗因创伤、畸形、退变、肿瘤等引起的骨缺损离不开骨组织重建。在进行骨组织结构重建时,需要合适的填充材料来代替原来缺失的骨质。自体骨作为骨缺损修复的金标准,具有理想的诱导成骨、传导成骨和骨生成特性,然而其来源有限,取材中的供区感染、慢性疼痛等并发症限制了它的发展。异体骨包括同种异体骨和异种骨,虽来源广泛且具有良好的诱导成骨和传导成骨能力,但来源控制受限,同时又有疾病传播、免疫排斥等风险,发展前景欠佳。目前更多的研究目光集中在人工骨移植替代物上。
骨组织工程技术的引入给骨骼修复提供了有力的新途径,但是传统支架制造工艺精度和重复性上存在严重弊端,不能达到理想的手术结果。近年来出现的3D打印技术,克服了传统工艺的诸多不足,从力学强度、孔隙结构、生物活性因子等方面提高支架成骨能力,已经广泛应用于骨组织工程。
聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)是一种人工合成高分子有机化合物,作为美国FDA批准的用于组织工程的生物材料,它有着良好的生物相容性、生物可降解性和可塑性。但其本身不具有生物活性,机械强度差,且降解速度过慢,表面光滑,疏水性强,不适宜成骨细胞粘附和骨组织再生,不适宜骨组织再生,常与其他一种或多种生物材料复合使用以增强诱导成骨特性或生物力学强度。其中,与羟基磷灰石或磷酸三钙(Tricalciumphosphate,TCP)复合后机械强度增强较为明显。TCP属于陶瓷钙类无机生物材料,其化学成分和晶体结构与天然骨矿物质相似,具有良好的诱导成骨、传导成骨特性以及足够的机械强度,可促进成骨细胞粘附以及骨组织沉积,但脆性大,生物可吸收性欠佳。通过3D打印技术将两者的优势结合,这样构建的PCL-TCP 3D打印支架仍可以通过增加表面粗糙程度来进一步提升成骨细胞对其粘附和定殖能力。
溶剂浇铸法/颗粒滤粒法、气体发泡法、相分离法、乳剂冻干法、冰冻干燥法等传统的支架制造技术虽然可以满足理想支架构建的部分条件,但有着无法弥补的内在缺陷:(1)缺乏对精细孔隙尺寸、结构和空间分布的控制能力,其制备的支架孔隙结构随机,不适宜骨组织形成;(2)可重复性差;制备过程中使用的有机溶剂,对细胞有毒性和致癌性的风险;(3)骨组织内向生长能力欠佳,细胞不能迁移至支架的深部,只是在支架的周围粘附定殖,在骨组织形成后期会对氧气和营养等物质交换形成阻碍,且在支架表面矿化组织形成后,阻碍作用会更加明显;(4)针对病人的个体化支架构建所需的也是传统方法所不能完成的。而3D打印技术的出现,正是解决这些问题的关键。3D打印技术最大的优势在于可以根据患者需要个体化定制,能够快速有效的应用到手术中。同时又能够精确控制支架内部孔隙结构,具有高度可重复性。
目前对于PCL材料的表面粗糙化处理尚无标准化方法。Kumar等(Girish Kumar,Michael S.Waters,Tanya M.Farooque et al.Freeform fabricated scaffolds withroughened struts that enhance both stem cell proliferation anddifferentiation by controlling cell shape.Biomaterials.2012.33(16):4022-4030.)采用丙酮和二氯甲烷体积比为9:1的有机溶液蚀刻PCL支架,获得良好的表面粗糙化效果。 Kim等(YongBok Kim,GeunHyung Kim.Highly roughened polycaprolactonesurfaces using oxygen plasma-etching and in vitro mineralization for bonetissue regeneration:Fabrication,characterization,and cellularactivities.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces.2015.1;125:181-189.)利用氧等离子体蚀刻方法处理 PCL薄膜,同样能够取得一定的表面粗糙度。
本发明人所在的课题组前期试验将PCL-TCP骨组织工程支架通过有机溶剂蚀刻(丙酮和二氯甲烷体积比为9:1)进行表面改性,发现不能取得良好的表面粗糙化结果。稀释有机蚀刻液的浓度,寻找良好的配比和蚀刻时间将是 PLC-TCP骨组织工程支架表面粗糙化处理的关键。
发明内容
通过前期研究发现,目前对于PCL支架的粗糙化处理方法,并不适用于 PCL-TCP支架。氧等离子体蚀刻的方法尚未应用到三维结构的支架上,这有待于进一步验证。采用丙酮和二氯甲烷体积比为9:1的有机溶液蚀刻,会导致PCL-TCP支架过快分解,孔隙结构消失,反而不利于细胞爬行生长。寻找良好的配比和蚀刻时间将是本发明的重点。
本发明的目的在于提供一种PCL-TCP骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法,具体方法是一种由3D打印技术完成网格状结构支架的构建,通过有机溶剂蚀刻完成表面粗糙化处理的方法,为骨缺损修复材料的设计提供理论基础。
本发明的第一方面,提供一种PCL-TCP骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法,包括以下步骤:
A)PCL与TCP材料均匀混合后造粒;PCL与TCP的质量比为8:2;
B)将步骤A中获得的PCL-TCP混合材料通过3D打印技术制备PCL-TCP 骨组织工程网格状结构支架;
C)将步骤C中获得的PCL-TCP骨组织工程支架通过有机溶剂蚀刻方法完成表面粗糙化处理;有机溶剂为无水乙醇、丙酮和二氯甲烷的混合溶剂;所述的无水乙醇、丙酮和二氯甲烷的体积比为(5~15):(5~10):1。
优选的,所述的步骤A中,材料混合通过转矩流变仪完成。
优选的,所述的步骤B中,3D打印技术为熔融沉积成型(Fused DepositionModeling,FDM)技术;所述的网格状结构中纤维直径(3mm~5mm)、孔隙直径(1mm~10mm)、层高(2mm~3mm)、层与层角度(0°~180°)均可控。
所述的步骤C中,当无水乙醇的比例过低时,支架原有的孔隙被封堵。图 4是PCL-TCP骨组织工程支架经过不同的有机溶剂蚀刻后的电镜图片,其中A 为经过丙酮和二氯甲烷体积比为9:1的有机溶液蚀刻,可见支架原有孔隙大部分被封堵,B为经过无水乙醇、丙酮和二氯甲烷的体积比为10:5:1的有机溶液蚀刻,可见支架表面存在不规则大小的孔洞表面积和表面粗糙程度明显增加。优选的,无水乙醇、丙酮和二氯甲烷的体积比为10:5:1。
优选的,所述的步骤C中,有机溶剂蚀刻的时间为60~120s。其中,蚀刻时间过短,效果不明显;蚀刻时间过长,原有的孔隙被封堵,更优选90s。
本发明的第二方面,提供一种骨组织工程支架,其采用上述方法制备得到。
本发明的第三方面,提供一种上述的骨组织工程支架在制备骨缺损修复材料或骨移植替代物中的应用。
本发明优点在于:
1、根据骨缺损的具体形状,利用CT三维重建个性化定制填充材料;
2、合适质量配比的PCL-TCP复合材料,可将机械强度调整至与宿主骨组织相匹配,有效减少术后应力遮挡效应;
3、TCP可促进材料表面碳酸磷灰石层的形成,利于骨组织融合,同时,散在的TCP颗粒通过水解和弱化作用,可加速PCL支架的降解;
4、PCL的酸性降解产物可由TCP的碱性降解产物所中和,减少无菌性炎症的发生;
5、细胞更容易粘附和定殖在表面粗糙化处理后的支架上。
附图说明
图1为本发明的一种PCL-TCP骨组织工程支架的构建过程示意图,其中 A、B为根据骨缺损部位定制相应形状的骨组织工程支架。
图2为构建的PCL-TCP骨组织工程支架扫描电镜图片,其中A为 0/45/90/135°的层与层排列方式的支架,B为图2A的放大,可见表面均匀散在 TCP颗粒(图2B黑色箭头)。
图3为经过表面粗糙化处理的PCL-TCP骨组织工程支架扫描电镜图片,其中A可见支架表面存在不规则大小的孔洞,表面积和表面粗糙程度明显增加。B、C为图3A的放大。
图4为PCL-TCP骨组织工程支架经过不同的有机溶剂蚀刻后的电镜图片,其中A为经过丙酮和二氯甲烷体积比为9:1的有机溶液蚀刻,可见支架原有孔隙大部分被封堵,B为经过无水乙醇、丙酮和二氯甲烷的体积比为10:5:1的有机溶液蚀刻,可见支架表面存在不规则大小的孔洞表面积和表面粗糙程度明显增加。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1:
一、PCL与TCP材料均匀混合后造粒
将PCL(Sigma,MW 65000)颗粒和纳米TCP颗粒(Sigma)按照质量配比8:2的比例混合,通过转矩流变仪(Rheomix 600,Haake,Germany)均匀混合后拉丝,再经造粒机切割成3D打印所使用的颗粒状原材料。
二、通过3D打印技术制备PCL-TCP骨组织工程支架
按照PCL-TCP纤维直径0.5mm,0/45/90/135°的层与层排列方式,孔径500 μm,层高0.3mm建立模型,3D打印软件自动生成喷头行走路径后,设定材料仓温度90℃,喷头温度80℃。按照程序运行,获得PCL-TCP骨组织工程支架。
三、有机溶剂蚀刻方法完成支架表面粗糙化处理
室温下,在烧杯中依次加入无水乙醇、丙酮和二氯甲烷,按照10:5:1 的体积比例混合成有机溶剂蚀刻液。再将PCL-TCP骨组织工程支架完全浸入蚀刻液中约90s。随后取出支架,风干后保存。
四、扫描电镜观察
将步骤二、步骤三中获得的PCL-TCP骨组织工程支架喷金制样后,在扫描电镜下观察支架表面的形貌变化。可见PCL-TCP骨组织工程支架表面均匀分布TCP颗粒(图2),经表面粗糙化处理的PCL-TCP骨组织工程支架表面形成不规则大小的孔洞结构(图3)。
结果说明:用本发明的方法构建的PCL-TCP骨组织工程支架,TCP颗粒均匀分布,经过有机溶剂蚀刻后的支架表面粗糙程度和表面积明显增加,这均有利于细胞的粘附和定殖。
实施例2:
一、PCL与TCP材料均匀混合后造粒
将PCL(Sigma,MW 65000)颗粒和纳米TCP颗粒(Sigma)按照质量配比8:2的比例混合,通过转矩流变仪(Rheomix 600,Haake,Germany)均匀混合后拉丝,再经造粒机切割成3D打印所使用的颗粒状原材料。
二、通过3D打印技术制备PCL-TCP骨组织工程支架
按照PCL-TCP纤维直径0.4mm,0/60/120°的层与层排列方式,孔径300 μm,层高0.2mm建立模型,3D打印软件自动生成喷头行走路径后,设定材料仓温度90℃,喷头温度80℃。按照程序运行,获得PCL-TCP骨组织工程支架。
三、有机溶剂蚀刻方法完成支架表面粗糙化处理
室温下,在烧杯中依次加入无水乙醇、丙酮和二氯甲烷,按照10:5:1 的体积比例混合成有机溶剂蚀刻液。再将PCL-TCP骨组织工程支架完全浸入蚀刻液中约90s。随后取出支架,风干后保存。
四、扫描电镜观察
将步骤二、步骤三中获得的PCL-TCP骨组织工程支架喷金制样后,在扫描电镜下观察支架表面的形貌变化。
结果说明:用本发明的方法构建的PCL-TCP骨组织工程支架,TCP颗粒均匀分布,经过有机溶剂蚀刻后的支架表面粗糙程度和表面积明显增加。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (8)
1.一种PCL-TCP骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法,其特征在于,包括以下步骤:
A)PCL与TCP材料均匀混合后造粒;PCL与TCP的质量比为8:2;
B)将步骤A中获得的PCL-TCP混合材料通过3D打印技术制备PCL-TCP骨组织工程网格状结构支架;
C)将步骤C中获得的PCL-TCP骨组织工程支架通过有机溶剂蚀刻方法完成表面粗糙化处理;有机溶剂为无水乙醇、丙酮和二氯甲烷的混合溶剂;所述的无水乙醇、丙酮和二氯甲烷的体积比为(5~15):(5~10):1。
2.根据权利要求1所述的PCL-TCP骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法,其特征在于,所述的步骤A中,PCL与TCP材料混合通过转矩流变仪完成。
3.根据权利要求1所述的PCL-TCP骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法,其特征在于,所述的步骤B中,3D打印技术为熔融沉积成型技术。
4.根据权利要求1所述的PCL-TCP骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法,其特征在于,所述的步骤B中,网格状结构中纤维直径3mm~5mm、孔隙直径1mm~10mm、层高2mm~3mm、层与层角度0°~180°。
5.根据权利要求1所述的PCL-TCP骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法,其特征在于,所述的步骤C中,无水乙醇、丙酮和二氯甲烷的体积比为10:5:1。
6.根据权利要求1所述的PCL-TCP骨组织工程支架的构建及其表面粗糙化处理方法,其特征在于,所述的步骤C中,有机溶剂蚀刻的时间为60~120s。
7.一种骨组织工程支架,其采用如权利要求1-6任一所述的方法制备得到。
8.一种如权利要求6所述的骨组织工程支架在制备骨缺损修复材料或骨移植替代物中的应用。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109602950A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-04-12 | 北京大学口腔医学院 | 一种仿骨小梁宏微结构的骨组织工程支架制作方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108992710B (zh) | 2020-11-27 |
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