CN108990802A - 一种毛子草的组培快繁方法 - Google Patents

一种毛子草的组培快繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及组织培养技术领域，具体公开了一种毛子草的组培快繁方法。本发明以毛子草带芽茎段或者顶芽为外植体，进行诱导培养、增殖培养和生根培养，并在不同培养阶段使用最佳配方的培养基，从而实现毛子草的快速组培繁殖。通过本发明所述方法进行毛子草的组培繁殖，不仅可保持优良种的遗传稳定性，而且能有效提高其繁殖系数，繁殖周期短，炼苗过程易成活，降低驯化成本，操作简便，能够比较容易的获得毛子草无菌苗，是毛子草组培快繁的有效途径，为进一步开展品种改良奠定基础，为工厂化育苗提供了有力的技术支持。

Description

一种毛子草的组培快繁方法
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，具体地说，涉及一种毛子草的组培快繁方法。
背景技术
毛子草又名两头毛(学名：Incarvillea arguta)，是紫葳科角蒿属的植物，多年生具茎草本，具有药用价值，全草可入药。
然而，目前尚未有人工引种栽培的方法及相关报道。
现有技术中对其他物种的组培快繁方法并不适用于毛子草的组培快繁，因此，急需提供一种毛子草的组培快繁方法，快速提高毛子草种植量，为工厂化育苗或遗传育种打下基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种毛子草的组培快繁方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种毛子草的组培快繁方法，包括诱导培养、增殖培养和生根培养；
所述诱导培养，所使用的诱导培养基为：MS+1.0-2.0mg/L 6-BA+0.1-0.3mg/L NAA+2.8％-3.2％蔗糖+0.65％-0.75％琼脂，pH5.6-6.0；
所述增殖培养，所使用的增殖培养基为：NN69+0.04-0.08mg/L TDZ+0.5-1.5mg/L6-BA+0.1-0.3mg/L NAA+2.8％-3.2％蔗糖+0.65％-0.75％琼脂，pH5.6-6.0；
所述生根培养，所使用的生根培养基为1/2NN69+0-0.2mg/L NAA+2.8％-3.2％蔗糖+0.65％-0.75％琼脂，pH5.6-6.0。
作为优选，所使用的诱导培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
作为优选，所使用的增殖培养基为：NN69+0.06mg/L TDZ+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
作为优选，所使用的生根培养基为1/2NN69+0.1mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8。
进一步地，本发明所述方法以毛子草带芽茎段或者顶芽为外植体，进行诱导培养、增殖培养和生根培养。
更为具体地，包括如下步骤：
(1)外植体灭菌及诱导培养：
以毛子草带芽茎段或者顶芽为外植体，清洗干净后，先后利用体积浓度为75％的酒精和质量浓度为0.1％的氯化汞进行消毒灭菌；
将灭菌后的外植体，接种在所述诱导培养基上诱导出芽；
(2)增殖培养：
将诱导分化出的芽转接于所述增殖培养基上诱导丛生芽；
(3)生根培养：
将高度约3cm的丛生芽切割成单芽，转接于所述生根培养基上诱导生根。
作为优选，所述步骤(1)～(3)的培养条件为：环境温度23±1℃，湿度70％±5％，光照2500Lx，光/暗培养12h/12h。
其中，所述步骤(3)培养时间为18-22天，优选20天。
更进一步地，本发明所述方法还包括如下步骤：
(4)炼苗移栽：
将步骤(3)获得的生根组培苗放置于荫棚，闭瓶炼苗2d，开瓶炼苗3d，移栽进草炭：蛭石＝7:3的环境中。
作为优选，所述步骤(4)的培养条件为：环境温度25±1℃，湿度70％±10％。
更为具体地，本发明所述的毛子草的组培快繁方法包括以下步骤：
(1)外植体灭菌及诱导培养：
以毛子草带芽茎段或者顶芽为外植体，利用洗衣粉清洗干净后，经流水冲洗30min，然后置于超净工作台上，用体积浓度为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量浓度为0.1％的氯化汞消毒灭菌3-7min，无菌水冲洗5次，晾干；
将灭菌后的外植体，接种在诱导培养基上诱导出芽；
所述诱导培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
诱导培养约20d，即可分化出芽；
(2)增殖培养：
将诱导分化出的芽转接于增殖培养基上诱导丛生芽；
所述增殖培养基为：NN69+0.06mg/L TDZ+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
增殖培养约30d，可再次继代，增殖系数5；
所述增殖系数＝瓶苗在一个周期内形成的有效苗数/接种苗数；
(3)生根培养：
将高度约3cm的丛生芽切割成单芽，转接于生根培养基上诱导生根；
所述生根培养基为1/2NN69+0.1mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
生根培养约20d，可成苗；
(4)炼苗移栽：
将步骤(3)获得的生根组培苗放置于荫棚，闭瓶炼苗2d，开瓶炼苗3d，移栽进草炭：蛭石＝7:3的环境中，炼苗成活率80％以上。
上述步骤(1)～(3)在组培室进行，培养条件为：环境温度23±1℃，湿度70％±5％，光照2500Lx，光/暗培养12h/12h；上述步骤(4)在荫棚进行，培养条件为：环境温度25±1℃，湿度70％±10％。
若环境温度不符合上述要求，会导致炼苗的毛子草因温度过低生长缓慢，温度过高失水死亡；若环境湿度不符合上述要求，会导致炼苗的毛子草湿度过低失水死亡，湿度过高腐烂。
本发明所述增殖培养基中涉及的TDZ，又名噻苯隆、脱叶脲、脱叶灵、N-苯基-N’-1，2，3-噻二唑-5-基脲；CAS:51707-55-2；分子式:C9H8N4OS；分子量:220.25。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种毛子草的组培快繁方法，以毛子草带芽茎段或者顶芽为外植体，并在不同阶段使用最佳配方的培养基，从而实现毛子草的快速组培繁殖。
通过本发明所述方法进行毛子草的组培繁殖，不仅可保持优良种的遗传稳定性，而且能有效提高其繁殖系数，繁殖周期短，炼苗过程易成活，降低驯化成本，操作简便，能够比较容易的获得毛子草无菌苗，是毛子草组培快繁的有效途径，为进一步开展品种改良奠定基础，为工厂化育苗提供了有力的技术支持。
附图说明
图1为本发明实验例1中毛子草的增殖培养。
图2为本发明实验例1中毛子草的生根培养。
图3为本发明实验例1中毛子草的炼苗。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例用于说明本发明所述的毛子草的组培快繁方法，具体如下：
(1)外植体灭菌及诱导培养：
以毛子草带芽茎段为外植体，利用洗衣粉清洗干净后，经流水冲洗30min，然后置于超净工作台上，用体积浓度为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量浓度为0.1％的氯化汞消毒灭菌3-7min，无菌水冲洗5次；
将灭菌后的外植体，接种在诱导培养基上诱导出芽；
所述诱导培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
诱导培养约20d，即可分化出芽；
(2)增殖培养：
将诱导分化出的芽转接于增殖培养基上诱导丛生芽；
所述增殖培养基为：NN69+0.06mg/L TDZ+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
增殖培养约30d(如图1所示)，可再次继代，增殖系数5；
所述增殖系数＝瓶苗在一个周期内形成的有效苗数/接种苗数；
(3)生根培养：
将高度约3cm的丛生芽切割成单芽，接于生根培养基上诱导生根；
所述生根培养基为1/2NN69+0.1mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
生根培养约20d，可成苗(如图2所示)；
(4)炼苗移栽：
将步骤(3)获得的生根组培苗放置于荫棚，闭瓶炼苗2d，开瓶炼苗3d，移栽进草炭：蛭石＝7:3的环境中(如图3所示)，炼苗成活率80％以上。
上述步骤(1)～(3)在组培室进行，培养条件为：环境温度23±1℃，湿度70％±5％，光照2500Lx，光/暗培养12h/12h；
上述步骤(4)在荫棚进行，培养条件为：环境温度25±1℃，湿度70％±10％。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：所述的诱导培养基中的6-BA、NAA的浓度不同，如表1所示。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：所述的诱导培养基不含6-BA。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于：所述的诱导培养基不含NAA。对比实验例1
经统计，分别按照实施例1、实施例2、对比例1和对比例2的方法进行平行培养，每种方法培养50株，诱导培养3周后，培养结果如表1所示。其中，实施例1提供的方法能够获得近98％的萌发率。
表1
从上表可以看出，本发明诱导培养基MS基本培养基，补充1.5～2.0mg/L6-BA,0.1～0.3mg/LNAA诱导成活率在90％以上，培养时间在20-25天，补充的两种组分共同作用，保证了本发明启动培养过程的进行。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：增殖培养基中的TDZ、6-BA、NAA的浓度不同，如表2所示。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于：所述的增殖培养基不含TDZ。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于：将增殖培养基中的TDZ替换成IAA。
对比例5
本对比例与实施例1的区别在于：将增殖培养基的基本培养基替换成MS。
对比实验例2
经统计，分别按照实施例1、实施例3、对比例3、对比例4和对比例5的方法进行平行培养，每种方法培养30株，培养一个月后，培养结果如表2所示。其中，实施例1提供的方法增殖系数能够获得5。
表2
从上表可以看出，本发明的增殖培养基NN69，补充0.04～0.08mg/L TDZ,0.5～1.5mg/L6-BA，0.1～0.3mg/L NAA，增殖系数可达3-5，培养时间30-38天，补充的三种组分共同作用，保证了本发明启增殖培养过程的进行。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：所述的生根培养中NAA浓度不同，如表3所示。
对比例6
本对比例与实施例1的区别在于：所述的生根培养基的基本培养基为NN69。
对比实验例3
经统计，分别按照实施例1、实施例4、和对比例6的方法进行平行培养，每种方法培养30株，培养3周后，培养结果如表3所示。其中，实施例1提供的方法生根率达90％。
表3
从上表可以看出，本发明的生根培养基1/2NN69，补充0～0.2mg/LNAA，生根率80-90％，培养时间18-22天。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种毛子草的组培快繁方法，其特征在于，包括诱导培养、增殖培养和生根培养；
所述诱导培养，所使用的诱导培养基为：MS+1.0-2.0mg/L 6-BA+0.1-0.3mg/L NAA+2.8％-3.2％蔗糖+0.65％-0.75％琼脂，pH5.6-6.0；
和/或，所述增殖培养，所使用的增殖培养基为：NN69+0.04-0.08mg/L TDZ+0.5-1.5mg/L 6-BA+0.1-0.3mg/L NAA+2.8％-3.2％蔗糖+0.65％-0.75％琼脂，pH5.6-6.0；
和/或，所述生根培养，所使用的生根培养基为1/2NN69+0-0.2mg/L NAA+2.8％-3.2％蔗糖+0.65％-0.75％琼脂，pH5.6-6.0。
2.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于，所述诱导培养，所使用的诱导培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
和/或，所述增殖培养，所使用的增殖培养基为：NN69+0.06mg/L TDZ+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
和/或，所述生根培养，所使用的生根培养基为1/2NN69+0.1mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8。
3.根据权利要求1或2所述的组培快繁方法，其特征在于，以毛子草带芽茎段或者顶芽为外植体，进行诱导培养、增殖培养和生根培养。
4.根据权利要求3所述的组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外植体灭菌及诱导培养：
以毛子草带芽茎段或者顶芽为外植体，清洗干净后，先后利用体积浓度为75％的酒精和质量浓度为0.1％的氯化汞进行消毒灭菌；
将灭菌后的外植体，接种在所述诱导培养基上诱导出芽；
(2)增殖培养：
将诱导分化出的芽转接于所述增殖培养基上诱导丛生芽；
(3)生根培养：
将高度约3cm的丛生芽切割成单芽，转接于所述生根培养基上诱导生根。
5.根据权利要求4所述的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(1)～(3)的培养条件为：环境温度23±1℃，湿度70％±5％，光照2500Lx，光/暗培养12h/12h。
6.根据权利要求5所述的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(3)培养时间为18-22天，优选20天。
7.根据权利要求1～6任一项所述的组培快繁方法，其特征在于，还包括如下步骤：
(4)炼苗移栽：
将步骤(3)获得的生根组培苗放置于荫棚，闭瓶炼苗2d，开瓶炼苗3d，移栽进草炭：蛭石＝7:3的环境中。
8.根据权利要求7所述的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(4)的培养条件为：环境温度25±1℃，湿度70％±10％。
9.根据权利要求1～8任一项所述的组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外植体灭菌及诱导培养：
以毛子草带芽茎段或者顶芽为外植体，利用洗衣粉清洗干净后，经流水冲洗30min，然后置于超净工作台上，用体积浓度为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗，再用质量浓度为0.1％的氯化汞消毒灭菌3-7min，无菌水冲洗；
将灭菌后的外植体，接种在诱导培养基上诱导出芽；
所述诱导培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
(2)增殖培养：
将诱导分化出的芽转接于增殖培养基上诱导丛生芽；
所述增殖培养基为：NN69+0.06mg/L TDZ+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
(3)生根培养：
将高度约3cm的丛生芽切割成单芽，转接于生根培养基上诱导生根；
所述生根培养基为1/2NN69+0.1mg/L NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8；
(4)炼苗移栽：
将步骤(3)获得的生根组培苗放置于荫棚，闭瓶炼苗2d，开瓶炼苗3d，移栽进草炭：蛭石＝7:3的环境中；
所述步骤(1)～(3)的培养条件为：环境温度23±1℃，湿度70％±5％，光照2500Lx，光/暗培养12h/12h；
所述步骤(4)的培养条件为：环境温度25±1℃，湿度70％±10％。
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