CN108982457A - 使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法，其特征在于：包括有以下步骤：(1)采用异硫氰酸作为荧光素标记免抗人IgG和IgA抗体，作为二抗；(2)分离精子和精浆；(3)将步骤(2)分离的精子与步骤(1)的免抗人IgG和IgA于37℃下进行孵育；(4)随后加入碘化丙啶染色对精子进行染色，该碘化丙啶可以与死亡精子核特异性染色，活精子不染色；(5)采用流式细胞仪检测精子检测，与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明提供一种流式细胞术检测抗精子抗体方法，以便本发明是一种简单、快速、灵敏、准确的检测方法，适用于结合精子表面型抗精子抗体检测，并检测和区分死亡存活精子。

Description

使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法
技术领域
本发明属于一种精子鉴定方法，特别涉及一种使用荧光染料异硫氰酸荧光素和碘化丙啶检测单个精子的抗精子抗体的方法。
背景技术
抗精子抗体是一个复杂的病理产物，男女均可罹患，男性的精子、精浆，对女性来说皆属特异性抗原，接触到血液后，男女均可引起免疫反应，产生相应的抗体，阻碍精子与卵子结合，而致不孕，男性及女性患者血中和体液中的抗精子抗体是精子、精浆通过自身免疫或同种免疫而产生的，由于精子抗原的多样性，决定屯抗精子抗体的复杂性，其中与不育症病因有关，如果精子显示出凝集(抗精子凝集抗体)，如，活动精子以头-头、尾-尾或混合的形式相互黏附，精子抗体的存在可能是其原因，当然，没有出现精子凝集，也可能存在抗精子抗体。抗精子抗体作用主要表现为精子凝集、精子活力降低，影响精子的运送，抑制精子穿透宫颈黏液，限制精子与卵透明带粘附，抑制精子顶体的活性，使精子不易穿透包绕卵细胞的放射冠和透明带，阻碍精子卵子结合。精液中的抗精子抗体(ASAs)几乎都是属于两类免疫球蛋白：IgA和IgG。IgM抗体由于其分子量较大，在精液中极少发现。IgA抗体可能比IgG抗体更具有重要的临床意义。应用相关的筛查试验，可以在精子表面或体液中检测出这两类抗体。根据WHO人类不育的病因诊断分类，不育病因中免疫因素定义为：性及射精功能正常，在至少一份精液标本中，混合抗球蛋白反应实验(mixed antiglobulin reaction，MAR)或免疫珠实验(immunobead test，IBT)不少于50％的活动精子表面被覆抗体，2011年WHO《人类精液检验与处理实验室手册第五版》则明确规定抗精子抗体检测可作为不育诊断中免疫性不育的诊断标准。
精子表面抗体的试验(“直接试验”)常用两种直接试验：MAR试验和IBT试验。MAR试验采用新鲜精液标本，而IBT试验采用洗涤过的精子。这两种试验的结果并不总是一致，但IBT试验的结果与检测血清抗体的制动试验的结果相关性很好。IBT试验和MAR试验的实验方案有些不同，但这两种试验的精子/微珠制备均在显微镜下检查。微珠黏附于带有表面结合抗体的活动和不活动精子上；记录黏附有微珠活动精子的百分率。在MAR试验，“桥连”抗体(抗IgG或抗IgA)将包被了抗体的微珠带去与精液中未洗涤精子表面露出的IgG或IgA相接触。直接IgG和IgA的MAR试验，是用未经处理的新鲜精液，与包被人IgG或IgA的乳胶颗粒(微珠)或处理过的红细胞相混合。向悬浮液中加入特异性的抗人IgG或抗人IgA。颗粒与活动精子之间形成混合凝集，提示精子表面存在IgG或IgA抗体(微珠之间的凝集作为抗体-抗原识别的阳性对照)。但MAR实验不能用于低精子活力的标本(例如，＜10％或更少)。IBT试验比MAR试验耗费更多的时间，但它提供了去除精浆可能遮蔽成分的精子表面抗体的信息。IBT试验中，将包被共价键结合的抗IgG或IgA的兔抗人免疫球蛋白的微珠直接与洗涤过的精子相混合。带有抗人IgG或IgA的微珠结合到活动精子上提示，该精子表面有IgG或IgA抗体。MAR试验与IBT试验主要有以下缺点：一、检测依赖于人工显微镜下观察，主观性强，检测结果变异系数大；二、检测不能充分精确到单个精子的抗精子抗体结合情况；三、不能区分死亡和存活精子上结合抗精子抗体的情况。这种的检测结果可导致临床上对免疫性不育诊断、治疗的偏差。为此，需要寻求一种新的检测方法来检测单个精子的抗精子抗体结合情况。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种使用荧光染料的流式细胞术检测抗单个精子的精子抗体方法，具有简单、快速、灵敏、准确的特点。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法，其特征在于：包括有以下步骤：
(1)采用异硫氰酸作为荧光素标记免抗人IgG和IgA抗体，作为二抗；
(2)采集人类精液，并分离精子和精浆；
(3)将步骤(2)分离的精子与步骤(1)的免抗人IgG和IgA于37℃下进行孵育，以直接特异性地与精子表面结合的抗精子抗体结合；
(4)随后加入碘化丙啶染色对精子进行染色，该碘化丙啶可以与死亡精子核特异性染色，活精子不染色；
(5)采用流式细胞仪检测精子，统计分析抗精子抗体阳性精子比率，精子表面结合抗精子抗体的相对密度，以及死亡或存活精子上结合型抗精子抗体的具体情况。
进一步地，步骤(2)中还包括有：
a、杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐的配置：
将0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，0.1g氯化镁，8.0g氯化钠，2.16g磷酸氢二钠和1.00g D-葡萄糖加入到750mL纯净水中，将0.132g氯化钙溶于10mL纯净水中，边搅拌边缓慢加入上述溶液中，用1mol/LNaOH调节pH至7.4，用纯净水定容至1000mL；
b、杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐-牛血清白蛋白的配制：
其中，缓冲液I的制备方法为：加0.3g牛血清白蛋白至步骤a中的100mL杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐液中；
缓冲液II的制备方法为：加5g牛血清白蛋白至100mL杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐液中；并且所有溶液经0.45μm微孔滤器过滤，使用前温热至37℃；
进一步地，步骤(2)中的精子的分离，包括有如下步骤：
①充分混匀精液标本，并吸取所需的精液量至离心管，并添加步骤b中的缓冲液I至10mL，并离心5～10分钟；
②弃去上清液，并加入10mL的缓冲液I重新悬浮精子，再次离心5～10分钟；
③用0.2mL缓冲液II轻轻地重新悬浮步骤②的精子液团，最后在显微镜下核查精子的浓度和活力。
进一步地，在步骤(2)中的步骤c中的精子分成3组，包括空白对照检测管、抗精子抗体阳性精子管和抗精子抗体阴性精子管，并在每个精子管中加入步骤(1)中的体积抗IgG+IgA二抗溶液后加入5μL的碘化丙啶PI对精子进行染色，颠倒混匀。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明提供一种流式细胞术检测抗精子抗体方法，以便本发明是一种简单、快速、灵敏、准确的检测方法，适用于结合精子表面型抗精子抗体检测，并检测和区分死亡存活精子。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
配制溶液：
a、杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐的配置：
将0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，0.1g氯化镁，8.0g氯化钠，2.16g磷酸氢二钠和1.00g D-葡萄糖加入到750mL纯净水中，将0.132g氯化钙溶于10mL纯净水中，边搅拌边缓慢加入上述溶液中，用1mol/LNaOH调节pH至7.4，用纯净水定容至1000mL；
b、杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐-牛血清白蛋白的配制：
其中，缓冲液I的制备方法为：加0.3g牛血清白蛋白至步骤a中的100mL杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐液中；
缓冲液II的制备方法为：加5g牛血清白蛋白至100mL杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐液中；并且所有溶液经0.45μm微孔滤器过滤，使用前温热至37℃。
实施例2
精子的分离，包括有如下步骤：
①充分混匀精液标本，并吸取所需的精液量至离心管，并添加实施例1中的缓冲液I至10mL，并离心5～10分钟；
②弃去上清液，并加入10mL的缓冲液I重新悬浮精子，再次离心5～10分钟；
③用实施例1中0.2mL缓冲液II轻轻地重新悬浮步骤②的精子液团，最后在显微镜下核查精子的浓度和活力。
实施例3
对精子进行染色，具体的为将实施例2中的精子分成3组，包括空白对照检测管、抗精子抗体阳性精子管和抗精子抗体阴性精子管，并在每个精子管中加入用异硫氰酸作为荧光素标记免抗人IgG和IgA抗体作为二抗溶液，后加入5μL的碘化丙啶PI对精子进行染色，颠倒混匀。
实施例4
对染色后的精子进行流式细胞仪检测精子，
综合上述实施例，具体步骤为：
(1)采用异硫氰酸作为荧光素标记免抗人IgG和IgA抗体，作为二抗；
(2)采集人类精液，并分离精子和精浆；
(3)将步骤(2)分离的精子与步骤(1)的免抗人IgG和IgA于37℃下进行孵育，以直接特异性地与精子表面结合的抗精子抗体结合；
(4)随后加入碘化丙啶染色对精子进行染色，该碘化丙啶可以与死亡精子核特异性染色，活精子不染色；
(5)采用流式细胞仪检测精子，统计分析抗精子抗体阳性精子比率，精子表面结合抗精子抗体的相对密度，以及死亡或存活精子上结合型抗精子抗体的具体情况。

Claims (4)

1.一种使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法，其特征在于：包括有以下步骤：
(1)采用异硫氰酸作为荧光素标记免抗人IgG和IgA抗体，作为二抗；
(2)采集人类精液，并分离精子和精浆；
(3)将步骤(2)分离的精子与步骤(1)的免抗人IgG和IgA于37℃下进行孵育，以直接特异性地与精子表面结合的抗精子抗体结合；
(4)随后加入碘化丙啶染色对精子进行染色，该碘化丙啶可以与死亡精子核特异性染色，活精子不染色；
(5)采用流式细胞仪检测精子，统计分析抗精子抗体阳性精子比率，精子表面结合抗精子抗体的相对密度，以及死亡或存活精子上结合型抗精子抗体的具体情况。
2.根据权利要求1所述的使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法，其特征在于步骤(2)中还包括有：
a、杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐的配置：
将0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，0.1g氯化镁，8.0g氯化钠，2.16g磷酸氢二钠和1.00gD-葡萄糖加入到750mL纯净水中，将0.132g氯化钙溶于10mL纯净水中，边搅拌边缓慢加入上述溶液中，用1mol/L NaOH调节pH至7.4，用纯净水定容至1000mL；
b、杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐-牛血清白蛋白的配制：
其中，缓冲液I的制备方法为：加0.3g牛血清白蛋白至步骤a中的100mL杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐液中；
缓冲液II的制备方法为：加5g牛血清白蛋白至100mL杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐液中；并且所有溶液经0.45μm微孔滤器过滤，使用前温热至37℃。
3.根据权利要求2所述的使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法，其特征在于步骤(2)中的精子的分离，包括有如下步骤：
①充分混匀精液标本，并吸取所需的精液量至离心管，并添加步骤b中的缓冲液I至10mL，并离心5～10分钟；
②弃去上清液，并加入10mL的缓冲液I重新悬浮精子，再次离心5～10分钟；
③用0.2mL缓冲液II轻轻地重新悬浮步骤②的精子液团，最后在显微镜下核查精子的浓度和活力。
4.根据权利要求3所述的使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法，其特征在于在步骤(2)中的步骤c中的精子分成3组，包括空白对照检测管、抗精子抗体阳性精子管和抗精子抗体阴性精子管，并在每个精子管中加入步骤(1)中的免抗人IgG+IgA二抗溶液后加入5μL的碘化丙啶PI对精子进行染色，颠倒混匀。
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