CN108969584A - 一种组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种组合物及其制备方法和应用。该组合物包括辣蓼和三叉苦，其中，辣蓼为君药，三叉苦为佐使药。二药合理配伍，共奏清热除湿，活血止痛之效。药效学研究表明，该组合物对胃黏膜损伤具有显著地保护作用，能有效提高H2O2或乙醇致细胞损伤的细胞存活率，促进正常GES‑1细胞的增殖，并提高调节细胞抗氧化应激的重要转录因子Nrf2的表达，诱导其下游血红素加氧酶‑1(HO‑1)的表达，清除多余的氧自由基，从而增强胃黏膜的抗氧化能力，可用于制备预防和/或治疗胃粘膜损伤的药物。

Description

一种组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种对胃粘膜损伤具有保护作用的组合物及其制备方法和应用。
背景技术
胃黏膜损伤相关疾病是消化系统疾病中常见的一种由应激、理化、生物、药物等有害因素刺激，引起的以胃粘膜糜烂、出血或浅表溃疡为特征的胃粘膜损伤病变，主要包括急性胃粘膜病变，慢性胃炎，消化性溃疡、胃粘膜脱垂等疾病。急性胃粘膜病变是一种常见病，多发病，是临床上最常见的严重并发症之一，尤其易发生在严重烧创伤、大手术、重症颅脑损伤、严重感染等急危重症人群，本病是上消化道出血最常见的病因，约占20-30％。
随着现代社会生活节奏的加快，人们所承受的社会、心理、工作压力越来越大，而胃是对应激反应最为敏感的器官之一，所以在身体和心理应激状态下很容易导致胃黏膜的急性损伤。在急性胃粘膜损伤的发病机制中，氧化应激和炎症反应起着重要作用。
氧化应激是机体在遭受各种有害刺激时体内高活性分子如活性氧(reactiveoxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)自由基产生过多，超出了机体对ROS和RNS的清除能力，导致氧化系统和抗氧化系统失衡，从而引起细胞膜脂质、蛋白质和核酸的氧化性损伤，最终引发细胞凋亡和组织器官损伤。创伤、感染、缺血缺氧等因素都可能导致氧化应激的发生，进而诱发或加重组织损伤。据相关研究表明,氧化应激在多种疾病(如肝病、心血管、糖尿病等)的发生、发展中起着重要作用。研究表明，氧化应激是许多胃肠道疾病的重要发病机制，在伤害性应激状态下，胃粘膜中产生大量的活性氧自由基(ROS)，过量的ROS会导致氧化应激，包括黏膜血管内皮细胞和胃黏膜上皮细胞脂质过氧化，蛋白质和DNA损伤，还会作为第二信使激活不同的氧化还原反应敏感的信号传导通路，破坏维持胃粘膜完整性的平衡因子，引起胃粘膜细胞、血管等损伤，从而导致急性胃粘膜损伤。
因此，急性胃粘膜损伤的防治已成为当前社会迫切关注的公共卫生问题，中医药在防治消胃粘膜损伤性疾病方面有着安全有效、副作用相对较小优点。辣蓼为蓼科(Polygonaceae)蓼属植物辣蓼(Polygonum hydropiper.)的干燥全草，辣蓼作为海南黎族民间常用中草药，具有解毒除湿、散瘀止血的功效，以辣蓼-牛耳枫组成的枫蓼肠胃康，在临床上用于治疗急性胃肠炎，疗效确切，但该复方中的牛耳枫，属于有毒中药，具有一定的毒副作用，安全性小。因此，寻找一种对胃粘膜损伤治疗效果好，且安全无副作用的中药组合物具有重要的现实意义。目前，尚未有辣蓼-三叉苦提取物用于治疗抗氧化应激损伤、胃粘膜损伤的有关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种组合物及其制备方法和应用。本发明提供的组合物以天然无毒的中草药辣蓼和三叉苦为原料，对胃黏膜损伤具有显著地保护作用，且安全无毒副作用。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种对于胃粘膜损伤具有保护作用的组合物，包括辣蓼和三叉苦。
辣蓼为蓼科(Polygonaceae)蓼属植物辣蓼(Polygonum hydropiper)的干燥全草，辣蓼作为海南黎族民间常用中草药，具有解毒除湿、散瘀止血的功效。
三叉苦为芸香科植物三叉苦(Eudia lepta Merr)的干燥茎叶，具有清热解毒，祛风除湿，消肿止痛的功效，主治感冒发热，胃痛，咽喉肿痛、肺热咳嗽等，临床上以三叉苦为主的复方，用于治疗上呼吸道感染，疗效较好。
申请人经过反复实验，结合中医学理论和现代医学研究，发现将辣蓼和三叉苦配伍使用对胃粘膜具有显著的保护作用。
本发明所述组合物中辣蓼和三叉苦均为天然无毒的天然中草药，制得的中药制剂对胃粘膜治疗效果好，且安全性高，因此具有广阔的市场前景。
以重量份计，本发明组合物包括辣蓼10-15份和三叉苦15-20份。
在一些具体实施例中，所述组合物包括辣蓼15g和三叉苦20g。
在一些具体实施例中，所述组合物包括辣蓼12g和三叉苦18g。
在一些具体实施例中，所述组合物包括辣蓼10g和三叉苦15g。
本发明提供了所述组合物的制备方法，包括：取辣蓼、三叉苦，经溶剂提取、过滤、浓缩干燥，获得提取物干粉；将提取物干粉溶解，经大孔树脂吸附、洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥。
本发明提供的制备方法中，所述溶剂提取为30％～90％乙醇回流提取，在一些实施方案中，溶剂提取为50％～80％乙醇回流提取。在一些具体实施例中，所述溶剂提取为50％乙醇、60％乙醇或80％乙醇回流提取。
在一些实施方案中，所述大孔树脂吸附采用的树脂为AB-8、D101或WLD-3，所述洗脱为先采用水洗脱，再用50-80％乙醇洗脱。在一些具体实施例中，大孔树脂吸附采用的树脂为AB-8，所述洗脱为先采用水洗脱，再用60％乙醇洗脱。
在一个具体实施例中，本发明组合物的制备方法包括：取辣蓼、三叉苦混匀，粉碎，加入10倍量60％乙醇，浸泡0.5小时，加热回流1小时，过滤，滤渣加入8倍量60％乙醇，加热回流1小时，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥，获得提取物干粉。取提取物干粉1份，用60％乙醇溶解，上AB-8大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱，然后用60％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩干燥，获得本发明组合物。
药效学研究结果表明，本发明组合物对能有效提高H2O2或乙醇致细胞损伤的细胞存活率，促进正常GES-1细胞的增殖，并提高调节细胞抗氧化应激的重要转录因子Nrf2的表达，诱导其下游血红素加氧酶-1(HO-1)的表达，清除多余的氧自由基，从而增强胃黏膜的抗氧化能力，因此，该组合物可用于制备预防和/或治疗胃粘膜损伤的药物。
因此，本发明还提供了所述组合物在制备预防和/或治疗胃粘膜损伤的药物中的应用。
其中，胃粘膜损伤为应激性胃粘膜损伤。在一些实施方案中，应激性胃粘膜损伤包括H2O2或乙醇诱导的细胞损伤。
HO-1，即血红素加氧酶-1，也称热休克蛋白32(HSP32)，相对分子质量为32000，染色体定位22q12，在细胞中定位于微粒体，诱导性表达于肝、脾、心、肺、血管平滑肌、脑等组织，诱导因素为应激、缺氧、内毒素、过氧化氢、重金属、紫外线、细胞因子、生长因子等，多种心血管疾病的危险因素，如糖尿病、高血脂、吸烟等可诱导血管病变处HO-1表达增高。
核因子相关因子2(Nrf2)是调控细胞氧化损伤的关键转录因子，可与抗氧化物元件(antioxidant response element，ARE)结合调控抗氧化物的表达。在氧化应激作用下Nrf2被激活，诱导其下游血红素加氧酶-1(HO-1)等抗氧化酶的表达，清除多余的氧自由基，从而发挥抗应激作用。
本发明通过qPCR检测试验观察GES-1细胞中Nrf2mRNA、HO-1mRNA的表达情况，结果显示，经过本发明组合物处理后，GES-1细胞的Nrf2mRNA和HO-1mRNA含量较模型组明显提高(p<0.05)，因此，本发明还提供了所述组合物在制备提高Nrf2mRNA和/或HO-1mRNA表达的药物中的应用。
本发明通过CCK-8法考察本发明组合物不同浓度(0.01～0.04mg/ml)对正常人胃粘膜上皮细胞株(GES-1)的影响，结果显示，该组合物能明显促进正常GES-1细胞的增殖，并呈明显的剂量依赖性关系。因此，本发明还提供了所述组合物在制备促进GES-1细胞增殖的药物中的应用。
本发明组合物包括辣蓼和三叉苦，二药合理配伍，共奏清热除湿，活血止痛之效。经药效学研究表明，该组合物对胃黏膜损伤具有显著地保护作用，能有效提高H2O2或乙醇致细胞损伤的细胞存活率，促进正常GES-1细胞的增殖，并提高调节细胞抗氧化应激的重要转录因子Nrf2的表达，诱导其下游血红素加氧酶-1(HO-1)的表达，清除多余的氧自由基，从而增强胃黏膜的抗氧化能力，因此，该组合物可用于制备预防和/或治疗胃粘膜损伤的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1：组合物对H2O2致GES-1细胞损伤的细胞存活率的影响图，其中，模型对照组为不加样品的H2O2诱导细胞损伤模型，Pro1为添加对比例1组合物的处理组，样品浓度为0.04mg/ml，Pro2为添加对比例2组合物的处理组，样品浓度为0.04mg/ml；L、M、L为添加实施例1组合物的三个处理组，样品浓度依次为0.01mg/ml(L)、0.02mg/ml(M)、0.04mg/ml(H)；
图2：实施例1组合物不同浓度对正常GES-1细胞增殖的影响图，其中，样品浓度依次为0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml；
图3：组合物对乙醇致GES-1细胞损伤的细胞存活率的影响图，其中，模型对照组为不加样品的乙醇诱导细胞损伤模型，Pro1为添加对比例1组合物的处理组，样品浓度为0.04mg/ml，Pro2为添加对比例2组合物的处理组，样品浓度为0.04mg/ml；L、M、L为添加实施例1组合物的三个处理组，样品浓度依次为0.01mg/ml(L)、0.02mg/ml(M)、0.04mg/ml(H)；
图4：组合物对H2O2致细胞损伤的GES-1细胞Nrf2mRNA含量的影响图，其中，模型对照组(Mod)为不加样品的H2O2诱导细胞损伤模型，Pro1为添加对比例1组合物的处理组，样品浓度为0.04mg/ml，Pro2为添加对比例2组合物的处理组，样品浓度为0.04mg/ml；L、M、L为添加实施例1组合物的三个处理组，样品浓度依次为0.01mg/ml(L)、0.02mg/ml(M)、0.04mg/ml(H)；
图5：组合物对H2O2致细胞损伤的GES-1细胞HO-1mRNA含量的影响图，其中，模型对照组(Mod)为不加样品的H2O2诱导细胞损伤模型，Pro1为添加对比例1组合物的处理组，样品浓度为0.04mg/ml，Pro2为添加对比例2组合物的处理组，样品浓度为0.04mg/ml；L、M、L为添加实施例1组合物的三个处理组，样品浓度依次为0.01mg/ml(L)、0.02mg/ml(M)、0.04mg/ml(H)。
具体实施方式
本发明公开了一种组合物及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明组合物
由下述重量份的组分制备而成：
辣蓼10g、三叉苦15g。
制备方法：取辣蓼、三叉苦混匀，粉碎，加入10倍量60％乙醇，浸泡0.5小时，加热回流1小时，过滤，滤渣加入8倍量60％乙醇，加热回流1小时，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥，获得提取物干粉。取提取物干粉1份，用60％乙醇溶解，上AB-8大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱，然后用60％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩干燥，获得本发明组合物。
实施例2本发明组合物
由下述重量份的组分制备而成：
辣蓼12g、三叉苦18g。
制备方法：取辣蓼、三叉苦混匀，粉碎，加入10倍量50％乙醇，浸泡0.5小时，加热回流1小时，过滤，滤渣加入8倍量50％乙醇，加热回流1小时，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥，获得提取物干粉。取提取物干粉1份，用50％乙醇溶解，上D101大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱，然后用50％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩干燥，获得本发明组合物。
实施例3本发明组合物
由下述重量份的组分制备而成：
辣蓼15g、三叉苦20g。
制备方法：取辣蓼、三叉苦混匀，粉碎，加入10倍量80％乙醇，浸泡0.5小时，加热回流1小时，过滤，滤渣加入8倍量80％乙醇，加热回流1小时，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥，获得提取物干粉。取提取物干粉1份，用80％乙醇溶解，上WLD-3大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱，然后用80％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩干燥，获得本发明组合物。
对比例1
配方：辣蓼15g、牛耳枫20g。
制备方法同实施例1。
对比例2
配方：辣蓼35g。制备方法同实施例1。
实施例4本发明组合物对乙醇诱导GES-1细胞损伤的影响
一、试验材料
细胞株：人胃粘膜上皮细胞株(GES-1)，购自北京肿瘤研究所细胞库。
试剂：1640细胞培养基(Gibco公司)、胎牛血清(Biological Industries公司)、青霉素-链霉素溶液(Beyotim公司)、0.25％胰酶(Gibco公司)、二甲基亚砜(Sigma公司)、无菌PBS(HyClone公司)、乙醇(北京北化精密化学品有限公司)；CCK-8试剂盒(DojindoLaboratories)；其余试剂均为国产分析纯。
主要实验仪器：洁净操作工作台(Haier公司)；倒置相差显微镜(德国LEICA公司)；酶标仪(SYNERGY公司)；CO2细胞培养箱(SYNERGY公司)；高压灭菌器(上海博迅实业有限公司)；低速大型离心机(无锡瑞江有限公司)。
细胞培养基配制：含10％胎牛血清及1％青-链霉素双抗溶液的1640细胞培养基。
冻存液配制：在含5％胎牛血清的1640培养液中加入5％DMSO即可。
受试样品：实施例1和对比例1～2的组合物。
二、试验方法
GES-1细胞的培养和传代：将GES-1细胞培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，1次/2～3d换液，显微镜下观察细胞生长状态，待细胞长满培养瓶底面积80％(细胞对数生长期)以上即可进行传代，弃去培养液，加入0.25％胰蛋白酶1mL，室温消化1-2min，加入1640培养液终止消化，1000r/min离心5min收集细胞，加入1640培养液重悬细胞，细胞悬液接种至新的培养瓶传代培养，3-4天传代1次。
GES-1细胞的冻存：选取对数生长期细胞，1000r/min离心5min收集细胞，用PBS洗涤2次，然后，0.25％胰酶消化2min，加入1640培养液终止胰酶的消化作用，1000r/min离心5min，弃去上清，加入预冷的细胞冻存液，使其密度不低于5x106个/ml。分装入无菌冻存管中，每管1ml，做好标记并密封冻存管，置于4℃冰箱1h，-20℃低温冰箱中放置2h，然后置于-80℃低温冰箱中保存24h，再放入液氮中长期保存。
GES-1细胞的复苏：将液氮中的细胞株取出后，迅速放入37℃的水浴中，不断振摇，使其在1min内融化，用75％酒精檫洗消毒冻存管，将其移入超净工作台中，然后将冻存细胞加入到5倍体积的培养液，混匀，1000r/min离心5min，弃去上清，加入培养液重悬细胞，转移至25cm2无菌培养瓶内，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
细胞存活率的测定：取对数生长期的GES-1细胞，加入0.25％胰蛋白酶1mL，室温消化1min，加入1640培养液终止消化，并制备浓度为2×105个/mL的单细胞悬液，按细胞液100μL/孔接种在96孔板上，待细胞贴壁后分别加入实施例1组合物、Pro1和Pro2提取物，每组样本设6个平行复孔，另设阴性对照组和不含细胞的空白组，各加入1640培养液100μL，置于37℃、5％CO2培养24h后，弃去原液，加入800μmol乙醇继续孵育培养4h，吸弃培养液，每孔加入10ul的CCK-8试剂和90ul培养基(将cck8与培养基按1:9混合)，继续培养3h后，用酶标仪在450nm波长测其吸光度值。
细胞存活率％＝(实验组/对照组OD)×100％
实验数据采用SPSS 16.0软件进行统计，逐渐数据比较采用ANOVA进行分析，实验结果以表示，P<0.05为统计学有显著性差异。结果见图1。
结果显示，模型组细胞存活率较正常组显著降低。与模型组相比，本发明组合物中、低高剂量预处理后，可显著提高细胞存活率(P<0.05)，并呈明显的剂量依赖性关系。对比例1～2的组合物高剂量处理后，也可显著提高细胞存活率，在有效剂量相同的情况下，本发明组合物效果明显优于对比例1～2的组合物。
实施例5本发明组合物对H2O2诱导GES-1细胞损伤的保护作用研究
一、试验材料
受试样品：实施例1和对比例1～2的组合物。
细胞株：人胃粘膜上皮细胞株(GES-1)，购自北京肿瘤研究所细胞库。
试剂：1640细胞培养基(Gibco公司)、胎牛血清(BiologicalIndustries公司)、青霉素-链霉素溶液(Beyotim公司)、0.25％胰酶(Gibco公司)、二甲基亚砜(Sigma公司)、无菌PBS(HyClone公司)；CCK-8试剂盒(DojindoLaboratories)；TRIZOL(Sangon Biotech公司)；DEPC水(Sangon Biotech公司)；β-actin、cDNA试剂盒(碧云天生物技术公司)、荧光定量PCR试剂盒、Nrf2mRNA和HO-1mRNA(上海生工生物工程公司合成)；其余试剂均为国产分析纯。
主要实验仪器：洁净操作工作台(Haier公司)；倒置相差显微镜(德国LEICA公司)；酶标仪(SYNERGY公司)；CO2细胞培养箱(SYNERGY公司)；高压灭菌器(上海博迅实业有限公司)；低速大型离心机(无锡瑞江有限公司)；3000P/3005P荧光定量PCR仪((安捷伦公司)；普通PCR仪(美国Bio-rad公司)。
二、试验方法
GES-1细胞培养、传代，同实施例4。
H2O2诱导细胞损伤模型建立：取对数生长期的细胞，用胰酶消化后收集细胞，铺入96孔板中，每孔100ul，每组样本设3个平行孔，37℃、5％CO2培养24h后，加入200uMH2O2损伤4h，吸弃培养液，每孔加入10ul的CC-K8试剂和90ul培养基(将cck8与培养基按1:9混合)，继续培养3h后，用酶标仪在450nm波长测其吸光度值。
(一)组合物对正常GES-1细胞增殖的影响
取对数生长期的GES-1细胞，加入0.25％胰蛋白酶1mL，室温消化1min，加入1640培养液终止消化，并制备浓度为2×105个/mL的单细胞悬液，按细胞液100μL/孔接种在48孔板上，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的实施例1组合物每组样本设6个平行复孔，另设模型对照组和空白对照组，37℃、5％CO2培养24h后，弃去原液，每孔加入10ul的CC-K8试剂和90ul培养基，培养3h后，用酶标仪在450nm波长测其吸光度值。CCK-8法测定细胞存活率，同
实施例4，结果见图2。
(二)组合物对H2O2诱导GES-1细胞损伤的影响
取对数生长期的GES-1细胞，加入0.25％胰蛋白酶1mL，室温消化1min，加入1640培养液终止消化，并制备浓度为2×105个/mL的单细胞悬液，按细胞液100μL/孔接种在96孔板上，待细胞贴壁后分别加入实施例1组合物、对比例1组合物(Pro1)和对比例2的辣蓼提取物(Pro2)，每组样本设6个平行复孔，另设阴性对照组和不含细胞的空白组，37℃、5％CO2培养24h后，弃去原液，加入200uMH2O2损伤4h，然后，吸弃培养液，每孔加入10ul的CC-K8试剂和90ul培养基，培养3h后，用酶标仪在450nm波长测其吸光度值。
(三)组合物对GES-1细胞Nrf2mRNA和HO-1mRNA含量的影响
本研究采用qPCR法检测Nrf2mRNA和HO-1mRNA的表达。
细胞总RNA的提取：
(1)对数生长期的细胞,制备浓度为2×105个/mL的单细胞悬液,按细胞液1mL/孔接种在12孔板上，待细胞贴壁后分别加入实施例1组合物、Pro1和Pro2提取物预处理24h后，吸弃培养液，加入200uMH2O2处理4小时，弃去培养液，用预冷PBS洗2次.
(2)加入Trizol，吹打数次，室温放置5min。
(3)加入0.2ml的氯仿，用振荡机震摇5秒后，于冰盒内放置5min。
(4)在4℃，12000r/min离心15min。
(5)取溶液水相，加入0.5ml的异丙醇，于冰盒中放置10min，4℃
12000r/min离心10min弃上清液，保留沉淀。
(6)加入1ml预冷的75％乙醇，吹打清洗沉淀。
(7)以4℃，7500r/min离心5min，弃上清。
(8)在通风厨内开盖放置5min，吹干残余液体。
(9)加入30μl的DEPC处理水，吹打沉淀充分使RNA溶解。
(10)放于-80度冰箱内保存。
RNA琼脂糖凝胶电泳：
(1)称取琼脂糖0.2放入锥形瓶中，加入20ml的TAE(1x)，放入微波炉里加热至溶解。
(2)待液体降温至不烫手时，加入2μl核酸染色剂，稍微摇晃锥形瓶，充分混合均匀后，倒入凝胶板上使凝固。
(3)取各组样品5μl，加1μl的buffer染剂，吹吸混匀，混匀后的RNA小心的加入至琼脂糖凝胶孔中。120V电压下电泳15min。
(4)凝胶分析仪观察结果。
cDNA的合成：
采用BeyoRTTMⅡcDNA第一链合成试剂盒，严格按照试剂盒要求将mRNA反转为cDNA。反转录反应体系见表1。
表1反转录体系
模版 0.1ng-0.5μ g
引物 1μl(上下游引物各0.5μl)
DEPC-treated Water To 12μl
Reaction Buffer(5X) 4μl
RNase Inhibitor(20U/μl) 1μl
dNTP Mix(10Mm,each) 2μl
BeyoRTTMⅡM-MLV反转录酶 1μl
总体积 20μl
轻轻混匀，然后低速离心5s来沉淀液体。在PCR仪里进行反转录，42°孵育60min，80°孵育10min(以失活BeyoRTTMⅡM-MLV反转录酶并终止反转录反应)。
qPCR检测的引物为：Nrf2引物：ACGGTATGCAACAGGACATTGAGC；TTGGCTTCTGGACTTGGAACCATGHO-1引物：GCTCTTCTGGGAAGTAGACAG；CCTCCCTGTACCACATCTATGT。
定量PCR反应体系见表2，PCR程序见表3。
表2定量PCR反应体系(20μl)
20μlrxn Finalconc
2*SG Fast qPCR Master Mix 10μl 1*
10μM上游引物 0.4μl 200nm
10μM下游引物 0.4μl 200nm
DNA模板 <20ng/20μl rnx
PCR-grade water up to 20μl
表3 PCR程序
通过Ct值来计算目的基因Nrf2和HO-1的相对表达量，实验数据采用SPSS16.0软件进行统计，逐渐数据比较采用ANOVA进行分析，实验结果以表示，P<0.05为统计学有显著性差异，结果见图4～图5。
由图2结果可知，本发明组合物不同浓度能明显促进正常GES-1细胞增殖，并呈明显的剂量依赖性关系。
由图3结果可知，GES-1细胞经200uM的H2O2诱导损伤4小时后，模型组细胞存活率较正常组显著降低；与模型组相比，给予本发明组合物中、低、高剂量预处理12小时后，均可明显提高细胞存活率(p<0.05)。在有效剂量相同的情况下，本发明组合物效果明显优于对比例1～2的组合物。
由图4和图5可知，与正常组比较，模型组Nrf2mRNA、HO-1mRNA的含量降低(p<0.05)。经过本发明实施例1的组合物中、低、高剂量预处理后，其Nrf2mRNA和HO-1mRNA含量均明显高于模型组(p<0.05)。对比例1～2的组合物高剂量处理后，Nrf2mRNA和HO-1mRNA含量也明显提高，在有效剂量相同的情况下，本发明组合物效果明显优于对比例1～2的组合物。综合上述实验结果表明，本发明提供的组合物对胃粘膜损伤具有显著地保护作用(P＜0.05)。
取实施例2～3的组合物进行上述试验，结果与实施例1的效果相同或相近，无显著差异(p＞0.05)。表明本发明实施例1～3的组合物对胃粘膜损伤均具有显著的保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括辣蓼和三叉苦。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，以重量份计，包括辣蓼10-15份和三叉苦15-20份。
3.权利要求1或2所述组合物的制备方法，其特征在于，包括：取辣蓼、三叉苦，经溶剂提取、过滤、浓缩干燥，获得提取物干粉；将提取物干粉溶解，经大孔树脂吸附、洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥。
4.权利要求1所述组合物的制备方法，其特征在于，所述溶剂提取为30％～90％乙醇回流提取。
5.权利要求1所述组合物的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂吸附采用的树脂为AB-8、D101或WLD-3，所述洗脱为先采用水洗脱，再用60％乙醇洗脱。
6.权利要求1或2所述的组合物或权利要求3～5任一项所述制备方法制得的组合物在制备预防和/或治疗胃粘膜损伤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胃粘膜损伤为应激性胃粘膜损伤。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应激性胃粘膜损伤包括H2O2或乙醇诱导的细胞损伤。
9.权利要求1或2所述的组合物或权利要求3～5任一项所述制备方法制得的组合物在制备提高Nrf2 mRNA和/或HO-1 mRNA表达的药物中的应用。
10.权利要求1或2所述的组合物或权利要求3～5任一项所述制备方法制得的组合物在制备促进GES-1细胞增殖的药物中的应用。
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CN114107172A (zh) * 2021-11-12 2022-03-01 上海市农业科学院 一种构建非感染性胃黏膜损伤细胞模型的方法及应用
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