CN108938710A

CN108938710A - 烟豆或其提取物在制备治疗和/或预防关节炎的药物中的用途

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Publication number: CN108938710A
Application number: CN201710386672.4A
Authority: CN
Inventors: 何承伟; 王恺; 梁叶儿; 陈美婉; 李鹏; 万建波; 王涛; 王一涛
Original assignee: MACAO UNIV
Current assignee: MACAO UNIV
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2037-05-26
Also published as: CN108938710B

Abstract

本发明公开了一种烟豆Glycine tabacina(Labill.)Benth提取物，含有异黄酮、三萜、滨蒿内酯和香草酸。药效实验表明，本发明烟豆提取物对关节炎具有明显的治疗作用，能显著降低骨退行性病变及关节软骨破坏，降低促炎细胞因子的表达，抑制氧化应激，为临床治疗关节炎提供了一种新的用药选择。

Description

烟豆或其提取物在制备治疗和/或预防关节炎的药物中的用途

技术领域

本发明涉及烟豆或其提取物在制备治疗和/或预防关节炎的药物中的用途，属于医药领域。

背景技术

关节炎是一种以慢性炎症应答和关节破坏为主的多系统自身免疫性疾病。越来越多的证据表明炎症能够导致骨组织内稳态的紊乱。目前，关节炎以激素、非甾体消炎药和细胞毒类药物治疗为主，但这些药物副作用多，以至于不能长期服用，并且骨组织的破坏仍然是许多关节炎患者治疗中一个频繁而严重的问题。因此，研发新型高效低毒药物用于预防和治疗关节炎的炎症发展及关节损伤仍然迫在眉睫。天然产物具有来源广泛、成分丰富及不良反应少等特点，越来越受到国内外研究学者的关注。目前从天然产物中尝试寻找治疗关节炎的有效药物已经成为研究的热点。

烟豆(Glycine tabacina(Labill.)Benth)是豆科(Leguminosae)大豆属(Glycine)多年生草本植物，又称澎湖大豆、澎湖一条根、尖叶一条根、长叶银豆等，分布于澳大利亚、南洋诸岛、及中国东南沿海和台湾地区等。迄今，尚未见烟豆或其提取物防治关节炎的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供烟豆或其提取物；本发明的另一目的是提供了该提取在制备治疗和/或预防关节炎的药物中的用途。

本发明提供了一种烟豆Glycine tabacina(Labill.)Benth提取物，含有异黄酮、三萜、滨蒿内酯和香草酸。

进一步地，所述提取物中异黄酮包括染料木素、染料木苷、大豆苷元、大豆苷、红车轴草素和coumestan；三萜包括大豆皂醇。

其中，部分指标性成分在植物干重中的含量(g/g)为：(1)染料木苷0.110％；(2)大豆苷元0.022％；(3)染料木素1.218％；(4)红车轴草素0.008％；(5)coumestan 0.164％。

进一步地，它是烟豆的醇提物。

进一步地，它是烟豆的75％～95％v/v乙醇提取物。

进一步地，它是由下述方法提取得到：取烟豆，按1:10～1:6料液比，加75％～95％v/v乙醇水溶液，于30～50℃提取30～40min，重复提取2～4次，合并滤液，浓缩，得乙醇浸膏。

进一步地，它是由下述方法提取得到：取烟豆，按1:10料液比，加95％v/v乙醇水溶液，于30℃提取30min，重复提取3次，合并滤液，浓缩，得乙醇浸膏。

进一步地，提取方法为超声浴提取。

进一步地，提取原料为烟豆的根、茎、叶或全株。

本发明提供了烟豆Glycine tabacina(Labill.)Benth或所述的提取物在制备治疗和/或预防关节炎的药物中的用途。

进一步地，所述的药物是以烟豆的根、茎、叶、全株或其提取物为活性成分。

进一步地，所述的药物是抑制骨退行性病变、关节软骨破坏的药物。

进一步地，所述的药物是抑制促炎细胞因子表达的药物。

进一步地，所述的促炎细胞因子为IL-1β、IL-6、TNF-α中的一种或几种。

进一步地，所述的药物是抗氧化、抑制氧化应激的药物。

进一步地，所述的药物是口服药物或外用药物。

本发明提供了一种治疗和/或预防关节炎的药物组合物，它是以烟豆的根、茎、叶、全株或其提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

本发明提供了一种烟豆Glycine tabacina(Labill.)Benth提取物。药效实验表明，本发明烟豆提取物对关节炎具有明显的治疗作用，能显著降低骨退行性病变及关节软骨破坏，降低促炎细胞因子的表达，抑制氧化应激，为临床治疗关节炎提供了一种新的用药选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例1中不同提取条件下的烟豆提取物的HPLC图谱；

图2为实施例1中烟豆提取物的HPLC图谱；

图3为实验例1中各组大鼠关节炎症状图；

图3A为关节炎引起大鼠体重的改变图；

图3B为采用足趾容积测定仪检测肿胀足趾的体积图；

图3C为采用游标卡尺检测肿胀足趾的厚度图；

图3D为Collagen II诱发的关节炎大鼠的关节炎指数图；

图3E为肉眼观察肿胀关节炎症的程度图(标线表示为100μm)；

图3F为关节炎大鼠后足的X射线图(上部标线表示为100μm，下部标线表示为200μm)；

图4为实验例2中各组大鼠骨退行性病变及关节软骨破坏图；

图4A为关节炎大鼠左后足肿胀关节的组织病理学分析图；

图4B为足趾关节骨侵蚀评分图；

图4C为炎症细胞浸润评分图；

图4D为关节软骨破坏评分图；

图5为实验例3中各组大鼠血清促炎细胞因子表达量图；

图5A为大鼠血清中IL-1β的含量图；

图5B为大鼠血清中IL-6的含量图；

图5C为大鼠血清中TNF-α的含量图；

图6为实验例4中各组大鼠SOD活力及MDA含量图；

图6A为关节炎大鼠血清SOD活力图；

图6B为关节炎大鼠血清MDA含量图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

本发明实验中所用烟豆根部购于福建省福清市，通过DNA条形码鉴定植物种属，由中国医学科学院药用植物研究所韩建萍博士实验室完成。

实施例1本发明烟豆提取物的制备及表征

烟豆根粉碎后置于提取瓶中，按1:10料液比，加75％或85％或95％乙醇，于30℃或40℃或50℃三个提取温度条件下超声浴提取30min，重复提取3次，合并滤液，浓缩得乙醇浸膏，即得本发明烟豆提取物。不同提取条件下的提取率及主要成分含量见表1。

表1

采用HPLC检测上述9个提取物，HPLC条件：0-30min，40-100％MeOH，60-0％H₂O；30-40min，100％MeOH，0％H₂O。检测波长280nm。如图1所示，在所提供的烟豆提取物制备的条件范围内，提取物的成分高度相似，表明在如前所述的提取条件范围内，均可制备得本发明烟豆提取物。

进一步地，烟豆根粉碎后置于提取瓶中，按1:10料液比，加95％乙醇，于30℃条件下超声浴提取30min，重复提取3次，合并滤液，浓缩得乙醇浸膏，即得本发明烟豆提取物。

将上述醇提物定容至每毫升含1g生药，分装，-80℃冰箱中保存。

采用相同的HPLC条件检测上述提取物，如图2所示，检测到其中含有染料木苷(1)、大豆苷元(2)、染料木素(3)、红车轴草素(4)和coumestan(5)等异黄酮类成分。化学成分研究表明其中还含有大豆苷等异黄酮，大豆皂醇等三萜及滨蒿内酯、香草酸等多种结构类型的化合物。

以下通过药效实验证明本发明的有益效果。

实验例1～4实验结果用Mean SEM表示。*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，##P<0.01，与模型组相比。P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS13.0统计软件进行资料分析，其中大鼠体重、平均足趾肿胀体积及厚度、及关节炎指数用Two-way ANOVA方差分析，骨侵蚀、炎症及关节软骨破坏评分、IL-1β、IL-6及TNF-α的表达、以及血清中SOD活力及MDA含量资料用One-way ANOVA方差分析。

实验例1本发明烟豆提取物显著缓解大鼠关节炎症状

1、实验方法

30只雄性SPF级Wistar大鼠(350-420g)购于澳门大学健康科学学院实验动物中心(动物饲养许可证号：UMARE-014-2016)。动物实验严格按照澳门大学实验动物伦理委员会的要求进行。烟豆提取物(Glycine tabacina extract，GTE)按实施例1制备。阳性药盐酸吲哚美辛购于美国Sigma公司，用0.9％的生理盐水配制成1mg/ml的吲哚美辛储备液，分装，-80℃冰箱中保存。Collagen II及不完全弗氏佐剂均购于美国Chondrex公司，用时两者等体积均匀混合，配制成1mg/ml的储备液。

2、实验设计

实验前将大鼠随机分为6组：对照组、模型组、1.11g/kg GTE组、2.22g/kg GTE组、4.44g/kg GTE组及阳性药物吲哚美辛组(2mg/kg)。实验当天配制1mg/ml的Collagen II佐剂，充分乳化，取乳化剂按每只大鼠0.1mg Collagen II的剂量于大鼠后足趾踝关节部、尾根部及背部行多点注射。在造模后第7天用同样剂量的佐剂再次免疫大鼠。从第一次免疫当天开始灌胃GTE及阳性药物，连续30天。同时，每两天称一次体重，观察并记录各组大鼠后足趾肿胀厚度及体积。

2.1、足趾肿胀检测

用大鼠足容积测量仪和游标卡尺每两天分别测量左后足容积及厚度。鼠爪浸入液面时保持每次浸入的深度相同，计算浸入前后容器中水容积差值即为肿胀鼠爪的体积。

2.2、关节炎指数

给药后，每两天记录一次大鼠全身病变程度。全身病变按5级评分法评估，根据未注射佐剂的其余3只肢体的病变程度累计积分。0分，无红肿；1分，小趾关节红肿；2分，趾关节和足趾肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀及整体变形。关节炎发病率：至少有一只肢体临床评分≥2分判定为关节炎发生。

2.3、后肢关节肉眼及X射线观察

在造模后第30天，麻醉大鼠并用数码相机对后肢关节进行拍照。同时，用美国Bruker In-vivo Xtreme动物成像系统对大鼠后肢关节做X射线检查并拍照。

3、实验结果

如图3A所示，造模10天后，Collagen II诱发的关节炎大鼠的体重快速降低，随后逐渐增加。然而，GTE治疗组及吲哚美辛组并没有表现出明显的降低。

由于足趾肿胀是评价抗炎药抗炎程度和治疗效果的一个关键指标，为了评价GTE的抗关节炎效果，本实验分别检测了各组关节炎大鼠的足趾肿胀程度。结果表明，GTE及阳性药吲哚美辛灌胃给药使得Collagen II诱导的关节炎大鼠的足趾肿胀体积(图3B)及厚度(图3C)显著减少。

此外，本实验用肉眼及X射线观察进一步评价关节炎的程度，如图3E和3F所示。正常对照组大鼠关节无红肿变形和骨质侵蚀。模型组大鼠的关节肿胀在造模后第30天显著加重，可见关节明显变形。X射线观察发现模型组踝关节的关节面有明显的虫蚀样破坏及边缘性骨质侵蚀。造模1周后的平均关节炎指数均在3以上(图3D)。然而，GTE治疗不仅缓解了Collagen II诱导的关节炎大鼠的足趾肿胀及骨侵蚀破坏，而且明显降低了其关节炎指数。

以上结果有力地证明了本发明烟豆提取物具有显著的抗关节炎作用。

实验例2本发明烟豆提取物显著降低关节炎大鼠骨退行性病变及关节软骨破坏

1、实验方法

实验用10％中性福尔马林固定液为南昌雨露实验器材有限公司生产。固体石蜡购于上海懿洋仪器有限公司。苏木精-伊红染色液及Safranin-O染色液购于上海金穗生物科技有限公司。造模30天后，处死大鼠，分离出左后足并剥皮去毛，置于10％福尔马林溶液中固定过夜，并用复方脱钙液充分脱钙(8ml HCl+5ml冰醋酸+10g水杨酸+H₂O至100ml)，用于常规病理检查。

2、实验设计

实验前将大鼠随机分为6组：对照组、模型组、1.11g/kg GTE组、2.22g/kg GTE组、4.44g/kg GTE组及阳性药物吲哚美辛组(2mg/kg)。实验当天配制1mg/ml的Collagen II佐剂，充分乳化，取乳化剂按每只大鼠0.1mg Collagen II的剂量于大鼠后足趾踝关节部、尾根部及背部行多点注射。在造模后第7天用同样剂量的佐剂再次免疫大鼠。从第一次免疫当天开始灌胃GTE及阳性药物，直到实验结束。实验最后一天，处死大鼠并分离出左后足并剥皮去毛，置于10％福尔马林溶液中固定过夜，并充分脱钙，石蜡包埋，常规切片5μm，苏木素-伊红(HE)和番红-O(Safranin-O)染色。同时，从风湿性关节炎病理形态学改变如炎症细胞浸润、关节软骨破坏、骨侵蚀等方面进行评分。

2.1、骨侵蚀评分标准

0分：正常；1分：可疑或有一个微小局部病灶；2分：两个局部病灶或病灶总面积≤50％；3分：三个以上的病灶或病灶总表面积＞50％；4分：关节面完全破坏，或出现骨缩小。

2.2、关节软骨破坏评分标准

0分：无破坏；1分：小灶状破坏﹤1/3；2分：小灶状破坏﹤1/2；3分：小灶状破坏﹤2/3；4分：小灶状全部破坏。

2.3、炎症细胞浸润评分标准

0分：无浸润；1分：少量浸润；2分：稀疏散在；3分：大量存在。

3、实验结果

HE染色(图4A)结果表明关节炎诱发的大鼠足趾关节表现出明显的炎症细胞浸润及大量的嗜中性粒细胞的增加。然而，GTE及吲哚美辛治疗的关节炎大鼠中，炎症细胞浸润及嗜中性粒细胞的增加均被明显的抑制(图4A和图4C)。另外，GTE及吲哚美辛治疗也明显抑制了关节炎大鼠严重的骨质侵蚀(图4A和图4B)。

另外，本实验用safranin-O检测了关节炎大鼠的关节软骨破坏程度，结果显示，模型组大鼠的关节软骨破坏明显，GTE治疗抑制了关节炎大鼠关节软骨的破坏(图4A和图4D)。

以上结果表明，本发明烟豆提取物能显著降低关节炎大鼠的骨退行性病变及关节软骨破坏。

实验例3本发明烟豆提取物降低关节炎大鼠血清促炎细胞因子的表达

1、实验方法

大鼠IL-1β、IL-6及TNF-αELISA测定试剂盒均购于美国BioLegend公司(SanDiego,CA,USA)。在免疫后第14、21及28天，麻醉大鼠并做眼眶采血，分离出血清，测定大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α的水平。

2、实验设计

将大鼠随机分为6组：对照组、模型组、1.11g/kg GTE组、2.22g/kg GTE组、4.44g/kg GTE组及阳性药物吲哚美辛组(2mg/kg)。实验当天配制1mg/ml的Collagen II佐剂，充分乳化，取乳化剂按每只大鼠0.1mg Collagen II的剂量于大鼠后足趾踝关节部、尾根部及背部行多点注射。在造模后第7天用同样剂量的佐剂再次免疫大鼠。从第一次免疫当天开始灌胃不同浓度的GTE及阳性药物，直到实验结束。在造模后第14、21及28天，麻醉大鼠并分离出血清，测定大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平。

2.1、IL-1β、IL-6及TNF-α的含量测定

大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量采用大鼠ELISA试剂盒说明书进行，预先用抗大鼠IL-1β、IL-6及TNF-α抗体包被96孔板，4℃孵育过夜，次日，弃去加入到96孔板中的抗体，每孔用洗涤液清洗4次，并加入Diluent A溶液，常温下孵育1h。再次清洗96孔板，加入标准品及各组血清样本，常温下继续孵育2h。弃去溶液，加入Detection Antibody，常温孵育1h。随后，每孔加入Avidin-HRP溶液，常温下继续孵育30min。加入TMB溶液在暗处孵育20min。加入硫酸二胺终止反应并及时在450nm处测定各孔的吸光度值。

3、实验结果

促炎细胞因子的表达是关节炎的一个显著的特征。为了进一步探讨GTE的抗关节炎作用及机制，本实验在造模后第14、21及28天采血检测促炎细胞因子的水平。大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α的水平采用ELISA法测定。

结果如图5A、5B及5C所示。与模型组相比，GTE给药组及吲哚美辛组显著降低关节炎大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平，证明GTE可能通过抑制促炎细胞因子的产生而达到治疗大鼠关节炎的作用。

实验例4本发明烟豆提取物显著增强关节炎大鼠的抗氧化活性

1、实验方法

总超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)测定试剂盒购于南京建成公司。实验最后一天处死大鼠，分离出血清并测定大鼠血清中的SOD活力及MDA含量。

2、实验设计

将大鼠随机分为6组：对照组、模型组、1.11g/kg GTE组、2.22g/kg GTE组、4.44g/kg GTE组及阳性药物吲哚美辛组(2mg/kg)。实验当天配制1mg/ml的Collagen II佐剂，充分乳化，取乳化剂按每只大鼠0.1mg Collagen II的剂量于大鼠后足趾踝关节部、尾根部及背部行多点注射。在造模后第7天用同样剂量的佐剂再次免疫大鼠。从第一次免疫当天开始灌胃GTE及阳性药物，直到实验结束。在免疫后第30天处死大鼠并分离出血清，使用南京建成公司的超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒及丙二醛(MDA)测定试剂盒测定各组大鼠血清中的SOD活力及MDA含量。

2.1、SOD活力测定

各组小鼠血浆及肾组织中SOD活力采用黄嘌呤氧化酶法检测。由于黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫红色，亚硝酸盐的生成量与样本中SOD活力成正比，在550nm波长处具有强吸收峰。小鼠血清中SOD活力计算公式：血清SOD活力(U/ml)＝(对照OD值-测定OD值)÷对照OD值÷50％×反应体系稀释倍数×样本测试前稀释倍数。

2.2、MDA含量测定

小鼠血浆及组织中MDA含量采用丙二醛法检测。由于过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，红色产物的生成量与样本中MDA的含量成正比，在532nm波长处有最大吸收峰。小鼠血清中MDA含量计算公式为：血清MDA含量(nmol/ml)＝(对照OD值-测定OD值)÷对照OD值×标准品浓度×样本测试前稀释倍数。

3、实验结果

内源性抗氧化酶如SOD能够缓解Collagen II诱导的大鼠骨关节氧化损伤，MDA则间接反应了机体骨组织受氧自由基攻击的严重程度。实验结果(图6A和6B)表明，关节炎诱发的大鼠血清SOD活力明显减少，而其MDA含量则相应增加。GTE及吲哚美辛治疗后显著升高了SOD活力，降低了MDA含量，可见，GTE通过抗氧化和抑制氧化应激而起抗关节炎的作用。

Claims

1.一种烟豆Glycine tabacina(Labill.)Benth提取物，其特征是：含有异黄酮、三萜、滨蒿内酯和香草酸。

2.如权利要求1所述的提取物，其特征是：所述提取物中异黄酮包括染料木素、染料木苷、大豆苷元、大豆苷、红车轴草素和coumestan；三萜包括大豆皂醇。

3.如权利要求1或2所述的提取物，其特征是：它是烟豆的醇提物。

4.如权利要求3所述的提取物，其特征是：它是烟豆的75％～95％v/v乙醇提取物。

5.如权利要求4所述的提取物，其特征是：它是由下述方法提取得到：取烟豆，按1:10～1:6料液比，加75％～95％v/v乙醇水溶液，于30～50℃提取30～40min，重复提取2～4次，合并滤液，浓缩，得乙醇浸膏。

6.如权利要求5所述的提取物，其特征是：它是由下述方法提取得到：取烟豆，按1:10料液比，加95％v/v乙醇水溶液，于30℃提取30min，重复提取3次，合并滤液，浓缩，得乙醇浸膏。

7.如权利要求5或6所述的提取物，其特征是：提取方法为超声浴提取。

8.如权利要求3－7任意一项所述的提取物，其特征是：提取原料为烟豆的根、茎、叶或全株。

9.如权利要求1～8任意一项所述的提取物，其特征是：采用HPLC检测，流动相梯度洗脱条件为：0-30min，40-100％MeOH，60-0％H₂O；30-40min，100％MeOH，0％H₂O，所述提取物的HPLC谱图如图1所示。

10.如权利要求9所述的提取物，其特征是：采用HPLC检测，色谱柱为Cosmosil 5C18-MS-II(4.6mm I.D.×250mm)色谱柱，柱温25℃，检测波长280nm。

11.烟豆Glycine tabacina(Labill.)Benth或权利要求1～10任意一项所述的提取物在制备治疗和/或预防关节炎的药物中的用途。

12.如权利要求11所述的用途，其特征是：所述的药物是以烟豆的根、茎、叶、全株或其提取物为活性成分。

13.如权利要求11所述的用途，其特征是：所述的药物是抑制骨退行性病变、关节软骨破坏的药物。

14.如权利要求11所述的用途，其特征是：所述的药物是抑制促炎细胞因子表达的药物。

15.如权利要求14所述的用途，其特征是：所述的促炎细胞因子为IL-1β、IL-6、TNF-α中的一种或几种。

16.如权利要求11所述的用途，其特征是：所述的药物是抗氧化、抑制氧化应激的药物。

17.如权利要求11所述的用途，其特征是：所述的药物是口服药物或外用药物。

18.一种治疗和/或预防关节炎的药物组合物，其特征是：它是权利要求1－10任意一项所述的烟豆的根、茎、叶、全株或其提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。