CN108929912B - 一种用于筛查急性髓系白血病的引物、试剂盒和方法 - Google Patents
一种用于筛查急性髓系白血病的引物、试剂盒和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于筛查急性髓系白血病的引物、试剂盒以及方法，该引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的用于扩增位点rs2297141的基因片段的引物对；如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述的用于扩增位点rs6576776的基因片段的引物对。该试剂盒包含上述引物，该方法通过检测人CCN1基因的SNP位点rs2297141，rs6576776的变异，进行急性髓系白血病易感性风险评估。本发明通过用于扩增位点rs2297141，rs6576776的基因片段的试剂的引物对，实现对位点rs2297141，rs6576776单个核酸多态性检测与分析，实现汉族人群急性髓系白血病的早期筛查和易感性的风险评估。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，并且更具体地，涉及到一种用于筛查急性髓系白血病的引物、试剂盒和方法。
背景技术
急性髓系白血病（Acute Myeloblastic Leukemia，AML）是一种以骨髓中髓系细胞数目异常升高并停滞在非成熟阶段导致造血功能不足（粒细胞减少、血小板减少和贫血）和伴随白细胞增多的一种血液克隆性疾病。据美国国立卫生研究院(National Institutesof Health，NIH)统计，每年每10万人中有2.4人被诊断为急性髓系白血病，且发病率随年龄升高，在65岁达到顶点（每10万人中有12.6人被诊断为急性髓系白血病）。
在过去的10年中，分子生物学的快速发展使人们对急性髓系白血病的认识更加深入，急性髓系白血病风险评估和和预后判断也因此进入了新的阶段。基因的多次突变在急性髓系白血病的发生中发挥着非常关键的作用，基因的变化可影响细胞对DNA损伤的识别和修复，从而增加了急性髓系白血病发生的风险，并且也可影响白血病细胞对放疗和化疗的敏感性。急性髓系白血病细胞分子生物学特征（包括突变或单核苷酸多态性等）成为评价急性髓系白血病风险和预后评价的关键指标，2008年版WHO白血病分型指南中NPM1 和CEBPA基因突变被认为是AML复发的高危因素；在欧洲肿瘤内科学会（European Societyfor Medical Oncology，ESMO）成人急性髓系白血病诊断、治疗和随访指南中，对于细胞遗传学正常的AML病人，FLT3、NPM1 和CEBPA基因突变被认为是重要的预后标志物，IDH，DNMT3A，RUNX1等基因虽暂时未能应用于临床常规检测，但具备非常好的临床风险预测和预后评价价值。
基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）在急性髓系白血病的风险评估、治疗及预后中有广阔的应用前景。单核苷酸多态性不同基因型可通过影响基因启动子功能、RNA稳定性或折叠、mRNA剪切，从而影响白血病细胞生物学性状或对药物的敏感性。单核苷酸多态性与AML的发生、治疗及预后密切相关，并越来越引起关注。如BCL-2、Bax、TP53的负向调节基因MDM2的启动子区域的多态性与急性髓系白血病的发生和预后密切相关；Interleukin-10的两个位点的基因型（rs1800871位点，C等位基因； rs1800872，G等位基因），增加了 AML发生风险，且两个SNP位点还具有协同效应； OPE基因单核苷酸多态性和高危AML相关联，并影响了对化疗药物的敏感性，TLR2 和TLR4两个基因单核苷酸多态性与化疗中感染并发症的发生密切相关。因此，基因单核苷酸多态性的研究对发现新的急性髓系白血病的诊断、风险分层以及预后判断标志物有重要的意义。
发明内容
本发明针对上述问题，目的在于提供一种用于筛查急性髓系白血病的引物、试剂盒和方法，其能实现早期汉族人群急性髓系白血病的早期筛查，对急性髓系白血病易感性的风险进行评估，为临床诊断和治疗提供依据。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的实施例公开了一种用于筛查急性髓系白血病的引物，其包括：
如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的用于扩增位点rs2297141的基因片段的引物对；
如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述的用于扩增位点rs6576776的基因片段的引物对。
第二方面，本发明实施例还公开了一种用于筛查急性髓系白血病的试剂盒，其包括上述的引物。
进一步地，所述试剂盒还包括DNA扩增片段基因多态性位点的识别系统。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR扩增缓冲液，3.0 mM Mg2+， dNTP，热启动基因扩增聚合酶，无酶水，SAP酶和Exonuclease I酶，以及rs2297141，rs6576776位点的SNP标准DNA样本。
进一步地，所述试剂盒还包括特异性扩增目的片段的PCR引物对。
第三方面，本发明实施例还公开了一种筛查急性髓系白血病的方法，通过检测人基因组CCN1基因的SNP位点rs2297141，rs6576776的变异，进行急性髓系白血病风险评估和/或预后判断。
进一步地，位点rs2297141，等位基因A和AA基因型与急性髓系白血病低风险相关；位点rs6576776，CC基因型与急性髓系白血病高风险相关。
进一步地，所述方法包括：
步骤（1） 提取DNA样本
步骤（2）采用如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述的引物对所述DNA样本的特异位点的目的基因进行扩增纯化后，进行连接反应并测序。
进一步地，步骤（2）中，所述扩增包括：95℃ 2 min; 94℃ 20 s，65℃ 40 s（每秒降5℃），72℃ 1.5 min，共11个循环；94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共11个循环；72℃ 2 min；4℃ 保持；
以20μl计，所述扩增反应体系包括：1x GC-I buffer(Takara.), 3.0 mM Mg2+,0.3 mM dNTP, 1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.) ，1 µl DNA样本和1µl PCR引物。
进一步地，步骤（2）中，所述连接反应中，
反应体系为：10x 连接缓冲液 1µl、高温连接酶 0.25µl、5’连接引物混合液（1µM）0.4µl，3’连接引物混合液（2µM）0.4µl、纯化后多重PCR产物 2µl、ddH2O 6µl 混匀；
连接程序为：94℃ 1min，56℃ 4min，共38个循环；4℃ 保持。
本发明的有益效果是：
本发明通过用于扩增位点rs2297141，rs6576776的基因片段的试剂的引物对，实现对位点rs2297141，rs6576776基因的变异检测，实现汉族人群急性髓系白血病的早期筛查，对急性髓系白血病易感性的风险进行评估。
附图说明
图1为人提取基因组扩增后，ABI3730XL测序仪上收集的rs2297141等位基因测序图al G:等位基因G；al A: 等位基因A；
图2为人提取基因组扩增后，ABI3730XL测序仪上收集的rs6576776等位基因测序图，al G:等位基因G；al C: 等位基因C。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所用试剂均为市售产品，其中乙二胺四乙酸二钠（EDTA）作为抗凝剂，血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）为市售的快速高效抽提基因组DNA的试剂盒。
实施例1 样本收集和基因组DNA的提取
样本来自于重庆市人民医院及新桥医院，共收集急性髓系白血病患者137例，其中男性77人，女性60人；正常对照者138例，其中男性76人，女性62人。所有受试者均为汉族，且自愿签署知情同意书，并得到了伦理委员会批准。
根据天根血液DNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）说明书提供的操作步骤，提取人外周血基因组DNA。
实施例2 包括rs2297141，rs6576776单核苷酸多态性DNA片段的PCR扩增和基因型分析
本发明采用imLDRTMSNP检测技术对位点rs2297141，rs6576776变异进行检测(如下所示)。
1）用SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4所示的引物进行扩增和检测包含特异位点的目的基因片段；
a)PCR扩增：95℃ 2 min; 94℃ 20 s，65℃ 40 s（每秒降5℃），72℃ 1.5 min，共11个循环；94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共11个循环；72℃ 2 min；4℃ 保持。反应体系（20μl）包含1x GC-I buffer(Takara.), 3.0 mM Mg2+, 0.3 mM dNTP, 1 UHotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.) ，1 µl 样本DNA和1µl多重PCR引物。
b)多重PCR产物纯化
在20μl PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 ºC温浴1小时, 然后75ºC灭活15分钟。
c)连接反应
连接DNA片段如下：
SEQ ID NO.5：rs2297141FA:
SEQ ID NO.6：rs2297141FG:
SEQ ID NO.7：rs2297141FP:
SEQ ID NO.8：rs6576776FC:
SEQ ID NO.9：rs6576776FG:
SEQ ID NO.10：rs6576776FP:
连接反应体系为：10x 连接缓冲液 1µl、高温连接酶 0.25µl、5’连接引物混合液（1µM）0.4µl，3’连接引物混合液（2µM）0.4µl、纯化后多重PCR产物 2µl、ddH2O 6µl 混匀。
连接程序： 94℃ 1min，56℃ 4min，共38个循环；4℃ 保持。
d) 连接产物上ABI3730XL测序仪
取0.5μl 稀释后的连接产物，与0.5μl Liz500 SIZE STANDARD， 9μl Hi-Di 混匀， 95 ºC变性5分钟后上ABI3730XL测序仪,连接产物的荧光标记如下：
rs2297141FG（FAM荧光基团显蓝色）:
rs2297141FA（VIC荧光基团显绿色）:
rs6576776FG（FAM荧光基团显蓝色）:
rs6576776FC（VIC荧光基团显绿色）:
2）如图1，图2所示，图1为人提取基因组扩增后，ABI3730XL测序仪上收集的rs2297141等位基因测序图 al G:等位基因G；al A: 等位基因A；图2为人提取基因组扩增后，ABI3730XL测序仪上收集的rs6576776等位基因测序图，al G:等位基因G；al C: 等位基因C。ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用 GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems, USA)分析。
3）统计方法：利用SPSS20.0软件进行分析，通过Hardy-Weinberg平衡评价质量控制，Chi-square分析和Logistic 回归分析被用来分析风险相关性，P<0.05认为有统计学意义的差异。
4）结果分析
位点rs2297141 ， A较G等位基因急性髓系白血病风险明显降低（(odds ratios(OR)=0.704, 95% confidence intervals (CI)=0.503–0.985, p=0.04)），隐性遗传模型（OR=0.419, 95% CI=0.23-0.763, p=0.004, AA vs GA+GG）和显性遗传模型（OR=0.447,95% CI=0.22-0.909, p=0.025, AA vs GG）中均差异明显；位点rs6576776，CC基因型增加急性白血病的发病风险，包括显性遗传模型 (OR=6.064, 95% CI=1.303-28.216, p=0.01,CC vs GG) 和隐形遗传模型 (OR=5.937, 95% CI=1.291-27.306, p=0.01, CC vs GC+GG)。经性别、年龄校正Logistic 回归分析结果显示，位点 rs6576776 CC基因型与急性髓系白血病高风险相关，位点 rs2297141 AA基因型与急性髓系白血病低风险相关。
实施例3 检测试剂盒
本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：
PCR扩增试剂（50人份）
其中，引物对分别为SEQ ID NO.1～2，SEQ ID NO.3～4所示的引物。引物A-B为PCR扩增引物，a-b为连接DNA片段。如表1所示。
表1
| 组分 | 浓度 | 体积 | |
| HotStar Taq酶 | 200 ul | ||
| SAP（虾碱性磷酸酶） | 80ul | ||
| 连接缓冲液 | 10x | 60ul | |
| 高温连接酶 | 60ul | ||
| Buffer | 10× | 60ul | |
| dNTP | 500ul | ||
| Mg2+ | 3.0 mM | 200 ul | |
| PCR引物对A（rs2297141） | 10uM | 400ul | |
| PCR引物对B（rs6576776) | 10uM | 400ul | |
| 连接DNA片段a（rs2297141） | 10uM | 400ul | |
| 连接DNA片段b（rs6576776） | 10uM | 400ul | |
| 无酶水 | 4ml | ||
| Exonuclease I酶 | 80ul |
SNP DNA标准样品：样本是由重庆市人民医院提供，收集的病例和正常自愿者的静脉血样，经过天根DNA提取试剂盒（购自购自天根生化科技（北京）有限公司）试剂盒抽提的DNA溶液样品，如表2所示。
表2
| 组分 | 浓度 | 体积 | |
| rs2297141位点AA基因型的标准DNA | 50ng/ul | 10ul | |
| rs2297141位点AG基因型的标准DNA | 50ng/ul | 10ul | |
| rs2297141位点GG基因型的标准DNA | 50ng/ul | 10ul | |
| rs6576776位点GC基因型的标准DNA | 50ng/ul | 10ul | |
| rs6576776位点CC基因型的标准DNA | 50ng/ul | 10ul | |
| rs6576776位点GG基因型的标准DNA | 50ng/ul | 10ul |
本发明的检测方法可用于分析检测人基因组CCN1基因（1号染色体短臂22区3带，全长3207个碱基）的SNP位点rs2297141，rs6576776的变异。位点rs2297141 ， A较G等位基因急性髓系白血病风险明显降低（(odds ratios (OR)=0.704, 95% confidenceintervals (CI)=0.503–0.985, p=0.04)），隐性遗传模型（OR=0.419, 95% CI=0.23-0.763, p=0.004, AA vs GA+GG）和显性遗传模型（OR=0.447, 95% CI=0.22-0.909, p=0.025, AA vs GG）中均差异明显；位点rs6576776，CC基因型增加急性白血病的发病风险，包括显性遗传模型 (OR=6.064, 95% CI=1.303-28.216, p=0.01, CC vs GG) 和隐形遗传模型 (OR=5.937, 95% CI=1.291-27.306, p=0.01, CC vs GC+GG)。经性别、年龄校正Logistic 回归分析结果显示，位点 rs6576776 CC基因型与急性髓系白血病高风险相关，位点 rs2297141 AA基因型与急性髓系白血病低风险相关。
本发明公开了中国汉族人急性髓系白血病相关的易感区域/位点，并利用这些位点的特殊性开发了急性髓系白血病筛查的试剂盒。且在鉴定受试者特定位点的基因型时，临床采血量少至1ml，单个反应体系为5ul，所需试剂少，本试剂盒灵敏度高，只需要少量DNA样本（单次实验只需1 ul 浓度为 50ng/ul 的DNA稀释液）就足以测定所述位点的变异，达到早期筛查的目的。
SEQ ID NO.1：
5’- TTTGCGGGTAGCCGTTTCTTTA-3’
SEQ ID NO.2：
5’- GGGGAGAAGATACGCGTGAGAC-3’
SEQ ID NO.3：
5’- GCCGGTGATTAGGTAAACATGCTG -3’
SEQ ID NO.4：
5’- GGAATGCTCTGGACCTTTGACC-3’
SEQ ID NO.5：
5’-TACGGTTATTCGGGCTCCTGTGCAGCCTTCCGAGGTGGACA-3’
SEQ ID NO.6：
5’-TTCCGCGTTCGGACTGATATGCAGCCTTCCGAGGTGGACG-3’
SEQ ID NO.7：
5’-GGCTGGACGAGATCAGAGGCTTTTTTT-3’
SEQ ID NO.8：
5’-TACGGTTATTCGGGCTCCTGTGCAAAGGAATGCAAGGAATTTCTAC-3’
SEQ ID NO.9：
5’-TTCCGCGTTCGGACTGATATGCAAAGGAATGCAAGGAATTTCTAG-3’
SEQ ID NO.10：
5’-TACTTTTCCAATAGCGTGAGGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
综上所述，本发明实施例公开的用于筛查急性髓系白血病的引物、试剂盒，以及方法，可通过在试剂盒中设置含有特异性扩增目的片段的PCR引物对，以及用于PCR扩增和进行基因SNP分型检测试剂盒的常规组件、试剂、操作步骤等，通过实验研究发现，在汉族人中：位点rs2297141 ， A较G等位基因急性髓系白血病风险明显降低，隐性遗传模型中AA基因型较GA+GG基因型降低，显性遗传模型中AA基因型较GG基因型降低；位点rs6576776，CC基因型增加急性白血病的发病风险，包括显性遗传模型和隐形遗传模型。
本发明的测定方法用于测定来源于人的基因组DNA，临床取材样本来源广泛，如体液（如血液、腹水和房水）、组织细胞（如皮肤组织、虹膜组织）等，通过提取和纯化这些样本均可制备基因组DNA。
本发明首次公开了上述多态性位点与急性髓系白血病的相关性，提供了一种预测急性髓系白血病易感性的试剂盒，该试剂盒可用于：
1）此疾病的辅助诊断：通过所述试剂盒明确受试者的这两个位点的基因型，预测受试者对急性髓系白血病的易感性。
2）为判断预后提供分子生物学依据。携带有上述位点危险等位基因的病人可能在一定程度上预后差于其他未携带有危险等位基因的病人。
本发明所述试剂盒可对急性髓系白血病高危的人群进行早期的筛查、正确诊断、及时有效治疗，对可能发生的严重并发症尽早发现以及预防病变发展。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
序列表
<110> 重庆市人民医院
<120> 一种用于筛查急性髓系白血病的引物、试剂盒和方法
<141> 2018-08-17
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
tttgcgggta gccgtttctt ta 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
ggggagaaga tacgcgtgag ac 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 3
gccggtgatt aggtaaacat gctg 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 4
ggaatgctct ggacctttga cc 22
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 5
tacggttatt cgggctcctg tgcagccttc cgaggtggac a 41
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 6
ttccgcgttc ggactgatat gcagccttcc gaggtggacg 40
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 7
ggctggacga gatcagaggc ttttttt 27
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 8
tacggttatt cgggctcctg tgcaaaggaa tgcaaggaat ttctac 46
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 9
ttccgcgttc ggactgatat gcaaaggaat gcaaggaatt tctag 45
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 10
tacttttcca atagcgtgag ggcttttttt tttttttttt tttttttttt t 51
Claims (3)
1.一种引物对在制备用于筛查急性髓系白血病的试剂盒的应用，其特征在于，所述引物对包括：
如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的用于扩增位点rs2297141的基因片段的引物对；
如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述的用于扩增位点rs6576776的基因片段的引物对。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA扩增片段基因多态性位点的识别系统。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增缓冲液，3.0 mMMg2+， dNTP，热启动基因扩增聚合酶，无酶水，SAP酶和核酸外切酶I，以及含rs2297141，rs6576776位点的SNP标准DNA样本。
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| CN (1) | CN108929912B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103374618A (zh) * | 2012-04-27 | 2013-10-30 | 解码（上海）生物医药科技有限公司 | 急性髓性白血病易感基因无创检测试剂盒 |
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2018
- 2018-08-17 CN CN201810941885.3A patent/CN108929912B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103374618A (zh) * | 2012-04-27 | 2013-10-30 | 解码（上海）生物医药科技有限公司 | 急性髓性白血病易感基因无创检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Polymorphisms of the CYR61 gene in patients with acute myeloid leukemia in a Han Chinese population;牛长春等;《Medicine》;20180824;第97卷(第34期);全文 * |
| ss218500548;SNP;《NCBI》;20110720;全文 * |
| ss218500553;SNP;《NCBI》;20110720;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN108929912A (zh) | 2018-12-04 |
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