CN108929209B

CN108929209B - 雪菊中奥卡宁的提取方法

Info

Publication number: CN108929209B
Application number: CN201810860067.0A
Authority: CN
Inventors: 毛新民; 李新霞; 李琳琳; 王敬伟; 张永威; 何红艳
Original assignee: Xinjiang Medical University
Current assignee: Xinjiang Medical University
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2038-08-01
Also published as: CN108929209A

Abstract

本发明为雪菊中奥卡宁的提取方法。雪菊中奥卡宁的提取方法，包括：(1)将雪菊醇提物完全溶解于水中，得雪菊醇提物水溶液；(2)将雪菊醇提物水溶液萃取2次，收集有机层，得萃取液；(3)将萃取液真空干燥至浸膏状后，与硅胶混匀，研磨成粉末，用于干法上样，进行硅胶柱层析；并收集洗脱液；(4)各管洗脱液通过TLC分析方法进行追踪分析，将相似组分合并后，进行真空干燥浓缩，冷却至室温并静置，待黄色晶体析出后，进行固液分离，收集晶体并洗涤、干燥，得所述的奥卡宁。本发明所述的雪菊中奥卡宁的提取方法，该方法通过萃取、硅胶柱层析、TLC分析，可以有效提取出奥卡宁，且纯度可达84％以上，经过重结晶后，纯度可达98％以上。

Description

雪菊中奥卡宁的提取方法

技术领域

本发明具体涉及雪菊中奥卡宁的提取方法。

背景技术

昆仑雪菊(Coreopsis tinctoria Nuff.)，学名两色金鸡菊，为菊科(compositae)金鸡菊属(Coreopsis)一年生草本植物。两色金鸡菊是原产于北美的观赏植物，我国引种成功后，在新疆有大规模种植，俗称雪菊，在当地被当作花茶饮用，维吾尔民间用来预防心血管疾病。在葡萄牙有每天喝两杯热两色金鸡菊茶饮用于控制糖尿病的传统。两色金鸡菊在新疆人们称之为雪菊、昆仑雪菊、昆仑血菊、高寒雪菊等，现已经逐渐作为一种茶饮普及开来。

国内外对两色金鸡菊的研究主要集中在黄酮类物质，发现两色金鸡菊中黄酮类物质是其药理活性成分。黄酮类化合物在植物界中广泛存在，并且许多都具有很好的生物活性，对人体健康有很多益处，能够保护人体不受疾病侵害。国内外对两色金鸡菊的研究主要集中在黄酮类物质，发现两色金鸡菊中黄酮类物质是其药理活性成分，其黄酮类物质主要包括查尔酮、二氢黄酮和橙酮等。两色金鸡菊头状花序中富含黄酮类成分，以查尔酮类和二氢黄酮类成分为其主要成分。植物化学研究已经证实，两色金鸡菊具有丰富的营养成分，目前已报道的从两色金鸡菊中分离鉴定出的29个黄酮类成分，这类化合物的母核包括黄酮类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、查尔酮类、黄酮醇类、橙酮类，和黄烷醇类。大量研究发现，雪菊中的主要成分有黄诺玛苷、马里苷、奥卡宁、黄酮奥卡宁等，并且可以通过HPLC指纹图谱对其进行指认。

其中，奥卡宁有较强的抗氧化作用，马里苷和奥卡宁具有较强的α-葡糖糖苷酶抑制成分。因此，可从雪菊中提取出奥卡宁。但是，由于雪菊中有效成分种类较多，难以单独分离出某一单一物质，分离出的物质纯度较低，导致奥卡宁的提取难度大，纯度低。

有鉴于此，有必要提出一种雪菊中奥卡宁的提取方法，该方法可以提取出纯度较高的奥卡宁。

发明内容

本发明的目的在于提供一种雪菊中奥卡宁的提取方法，该方法可以提取出纯度较高的奥卡宁。

为了实现上述目的，所采用的技术方案为：

雪菊中奥卡宁的提取方法，包括以下步骤：

(1)将雪菊醇提物完全溶解于水中，得雪菊醇提物水溶液；

(2)将雪菊醇提物水溶液萃取2次，收集有机层并合并，得萃取液；所述萃取剂为正己烷和乙酸乙酯按照1:1的体积比混合而成；

(3)将萃取液真空干燥至浸膏状后，与硅胶混合均匀，研磨成粉末，用于干法上样，进行硅胶柱层析；

待洗脱液呈黄色时，以40mL/管收集洗脱液，收集管数不少于25管；

(4)各管洗脱液通过TLC分析方法进行追踪分析，将相似组分合并后，进行真空干燥，浓缩至8-12ml后，冷却至室温并静置，待黄色晶体析出后，进行固液分离，收集晶体并洗涤、干燥，得所述的奥卡宁。

进一步的，所述步骤(1)中，雪菊醇提物与水的质量体积比为1:30g/ml；

所述步骤(2)中，雪菊醇提物水溶液与萃取剂的体积比为1:1。

再进一步的，所述步骤(1)中，将雪菊醇提物超声溶解于水中，超声时间为4-6min。

进一步的，所述步骤(3)中，真空干燥的温度为50-60℃，真空度为0.08Mpa；

所述硅胶柱层析中上样的样品与硅胶的质量比为1:9，硅胶为200-300目。

再进一步的，所述步骤(3)中，真空干燥的温度为55℃。

进一步的，所述步骤(3)中，硅胶柱层析采用梯度洗脱，流速为4-6mL/min，流动相A为二氯甲烷，流动相B为甲醇，其体积分数变化依次为A相90％，B相10％；A相80％，B相20％；A相70％，B相30％；A相60％，B相40％；A相50％，B相50％。

再进一步的，所述步骤(3)中，收集管数为25-37管。

进一步的，所述步骤(4)中，所述TLC分析方法中，展开剂为甲苯、乙酸乙酯和甲酸按照9:7:3的体积比混合而成；

显色剂为2-APB和PEG-400。

进一步的，所述步骤(4)中，所述相似组分合并后，进行真空干燥浓缩的具体步骤为：将相似组分合并后，分别在50-60℃、-0.08Mpa下真空干燥，浓缩至4-10mL后，加10mL的水，继续真空干燥，缩至8-12ml。

进一步的，所述步骤(4)还包括：将收集的晶体洗涤、干燥后，进行重结晶处理，得到所述的奥卡宁。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明所述的雪菊中奥卡宁的提取方法，该方法通过萃取、硅胶柱层析、TLC分析，可以有效提取出奥卡宁，且纯度可达84％以上，经过重结晶后，纯度可达98％以上。

附图说明

图1为雪菊醇提物指纹图谱；

图2为实施例1的工艺流程图；

图3为实施例1中366nm下得到的色谱流分薄层色谱图；

图4为实施例1中可见光下得到的色谱流分薄层色谱图；

图5为实施例1中6-10管合并的管液的指纹图谱；

图6为实施例2中366nm下得到的色谱流分薄层色谱图；

图7为实施例2中可见光下得到的色谱流分薄层色谱图；

图8为实施例2中4-5、8-10管合并的管液的指纹图谱；

图9为实施例3中366nm下得到的色谱流分薄层色谱图；

图10为实施例3中可见光下得到的色谱流分薄层色谱图；

图11为实施例3中8-31管合并的管液的指纹图谱；

图12为实施例3中结晶液的指纹图谱；

图13为实验测试中366nm下和可见光下得到的色谱流分薄层色谱图；

图14为奥卡宁结构式；

图15为实验材料1的红外吸收光谱图；

图16为实验材料1在ESI(+)模式下的MS质谱图；

图17为实验材料1在ESI(+)模式下的MS²二级质谱图；

图18为奥卡宁裂解示意图；

图19为实验材料1的¹H-NMR(CD3OD)谱。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明雪菊中奥卡宁的提取方法，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的雪菊中奥卡宁的提取方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。

在详细阐述本发明雪菊中奥卡宁的提取方法之前，有必要对本发明中提及的原料和方法等做进一步说明，以达到更好的效果。

干法上样，一般用于固体或粘度大的液体样品。

本发明实施例中采用的原料及仪器均为市售。

2-APB的分子式为C14H16BNO，分子量为225.1，化学名为2-氨基乙酯二苯基硼酸，是Ins(1,4,5)P3诱导Ca2+释放的拮抗剂，抑制IP₃诱导的Ca²⁺释放，IC₅₀为42μM，但不影响IP₃与其受体的结合。随着2-APB浓度增加(大于90μM)，其抑制Ca²⁺释放的作用也会相应增强。2-APB抑制IP₃R，从而抑制钙库诱导的钙库调控性离子通道(SOC)活化，以及受体诱导的TRP3活化，EC₅₀值通常在微摩尔范围。2-APB还可以有效地调控TRP离子通道，阻断TRPC1，TRPC3，TRPC5，TRPC6，TRPV6，TRPM3，TRPM7，TRPM8和TRPP2。在缺乏其他刺激因素时，2-APB可以刺激TRPV1，TRPV2和TRPV3。2-APB选择性且特异性地阻断某些缝隙连接通道亚型。本发明实施例中采用的为Sigma公司生产的2-APB。

聚乙二醇400，简称PEG-400，为环氧乙烷和水开环聚合而成的混合物，分子式以HO(CH2CH2O)nH表示，其中n代表氧乙烯基的平均数。PEG-400为无色或几乎无色的黏稠液体；略有特臭，在水或乙醇中易溶，在乙醚中不溶。本发明实施例中采用的为天津市百世化工有限公司生产的聚乙二醇400。

本发明实施例中采用的仪器有：

中低压制备色谱(BUCHI，瑞士)；点样仪(CAMAG LINOMAT5)；薄层色谱数码成像系统(CAMAG REPROSTAR3)；双槽展开缸(20cm×10cm)；硅胶G高效板(青岛海洋化工厂)；高效液相色谱仪(日本岛津，LC-20AB泵，SPD-20A紫外双波长检测器)。

在了解了上述原料和方法等之后，下面将结合具体实施例对本发明雪菊中奥卡宁的提取方法做进一步的详细介绍：

一实施例

采用质量分数为55％的乙醇溶液得到的雪菊醇提物进行HPLC分析。

HPLC分析条件：Shim-pack VP-ODS色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)；流速1.0ml/min；检测波长280nm；柱温：35℃；进样量10μl；流动相A：0.5％甲酸水；流动相B：乙腈，梯度洗脱程序如表1。

表1梯度洗脱程序

得到的醇提物指纹图谱如图1所示，图中的编号对应的成分如表2所示。

表2醇提物含有的成分

由图1和表2可知，雪菊醇提物中含有奥卡宁。

实施例1.

其工艺路线如图2所示，具体操作步骤如下：

(1)将10g雪菊醇提物加入到300ml水中，超声时间为5min，完全溶解，得雪菊醇提物水溶液。

(2)将雪菊醇提物水溶液与萃取剂按照1:1的体积比萃取2次，收集有机层并合并，得萃取液；其中，所述萃取剂为正己烷和乙酸乙酯按照1:1的体积比混合而成。

(3)将萃取液在55℃，-0.08Mpa下，真空干燥至浸膏状后，与等体积硅胶混合均匀，研磨成粉末，用于干法上样，进行硅胶柱层析(硅胶90g，200-300目；上层的样品10g；玻璃柱柱长：46cm，直径：1.5cm)；

待洗脱液呈黄色时，以40mL/管收集洗脱液；

其中，硅胶柱层析采用梯度洗脱，流速为4mL/min，流动相A为二氯甲烷，流动相B为甲醇，其体积分数变化和收集的管数如表3所示；

表3

(4)a：TLC分析

将各管洗脱液分一次点于硅胶高效G薄层板，展开剂为甲苯、乙酸乙酯和甲酸按照9:7:3的体积比混合而成，显色剂为2-APB和PEG-400，在366nm和可见光下检测，其结果如图3和图4所示。

根据比移植，将6-7合并，8-9合并，11-15合并，16-18合并，19-21合并，22-26合并。

b：浓缩结晶

将相似组分合并后，分别在55℃、-0.08Mpa下真空干燥，浓缩至4-10mL后，加10mL的水，继续真空干燥，缩至8ml，冷却至室温并静置，待黄色晶体析出后，抽滤，收集晶体后，用水洗涤，阴干，得单体化合物，包含所述的奥卡宁和黄酮奥卡宁。

C:HPLC分析

将上述奥卡宁称取4g溶于100μL甲醇，经HPLC分析，初步得知该结晶为奥卡宁。通过面积归一化法，得知其纯度为86.213％。

将6-10管合并后的管液进行HPLC分析，得到的指纹图谱如图5所示，由图5可知，管液中主要含有奥卡宁。

本发明实施例所述的雪菊中奥卡宁的提取方法，该方法通过萃取、硅胶柱层析、TLC分析，可以有效提取出奥卡宁，且纯度可达86.213％以上。

实施例2.

具体操作步骤如下：

(1)将20g雪菊醇提物加入到600ml水中，超声时间为4min，完全溶解，得雪菊醇提物水溶液。

(3)将萃取液在50℃，-0.08Mpa下，真空干燥至浸膏状后，与等体积硅胶混合均匀，研磨成粉末，用于干法上样，进行硅胶柱层析(硅胶180g，200-300目；上层的样品20g；玻璃柱柱长：46cm，直径：3.6cm)；

待洗脱液呈黄色时，以40mL/管收集洗脱液；

其中，硅胶柱层析采用梯度洗脱，流速为6mL/min，流动相A为二氯甲烷，流动相B为甲醇，其体积分数变化和收集的管数如表4所示；

表4

(4)a：TLC分析

将各管洗脱液分一次点于硅胶高效G薄层板，展开剂为甲苯、乙酸乙酯和甲酸按照9:7:3的体积比混合而成，显色剂为2-APB和PEG-400，在366nm和可见光下检测，其结果如图6和图7所示，图中a为自制奥卡宁。

根据比移植，将1-2合并，4-5合并(奥卡宁)，6-7合并(黄酮奥卡宁)，8-10合并(奥卡宁)，11-17合并，18-25合并。

b：浓缩结晶

将相似组分合并后，分别在50℃、-0.08Mpa下真空干燥，浓缩至4-10mL后，加10mL的水，继续真空干燥，缩至10ml，冷却至室温并静置，待黄色晶体析出后，抽滤，收集晶体后，用水洗涤，阴干，得所述的奥卡宁。

C:HPLC分析

将上述奥卡宁溶于100μL甲醇，经HPLC分析，初步得知该结晶为奥卡宁；通过面积归一化法，得知其纯度为95.748％。

将4-5、8-10管合并后的管液进行HPLC分析，得到的指纹图谱如图8所示，由图8可知，管液中主要含有奥卡宁。

本发明实施例所述的雪菊中奥卡宁的提取方法，该方法通过萃取、硅胶柱层析、TLC分析，可以有效提取出奥卡宁，且纯度可达95.748％。

实施例3.

具体操作步骤如下：

(1)将37g雪菊醇提物加入到1110ml水中，超声时间为6min，完全溶解，得雪菊醇提物水溶液。

(3)将萃取液在60℃，-0.08Mpa下，真空干燥至浸膏状后，与等体积硅胶混合均匀，研磨成粉末，用于干法上样，进行硅胶柱层析(硅胶333g，200-300目；样品37g；玻璃柱柱长：46cm，直径：4.9cm)；

待洗脱液呈黄色时，以40mL/管收集洗脱液；

其中，硅胶柱层析采用梯度洗脱，流速为6mL/min，流动相A为二氯甲烷，流动相B为甲醇，其体积分数变化和收集的管数如表5所示；

表5

(4)a：TLC分析

将各管洗脱液分一次点于硅胶高效G薄层板，展开剂为甲苯、乙酸乙酯和甲酸按照9:7:3的体积比混合而成，显色剂为2-APB和PEG-400，在366nm和可见光下检测，其结果如图9和图10所示。

根据比移植，将2-4，5-7，8-13，14-16，17-22，23-31合并。

b：浓缩结晶

将相似组分合并后，分别在60℃、-0.08Mpa下真空干燥，浓缩至4-10mL后，加10mL的水，继续真空干燥，缩至12ml，冷却至室温并静置，待黄色晶体析出后，抽滤，收集晶体后，用水洗涤，阴干，得所述的奥卡宁。

c：重结晶

将阴干后的1.008g晶体溶于25mL的甲醇，然后加6mL的水，静置一天，析出的褐色絮状物经抽滤后，自然阴干，褐色絮状物呈油状物紧密吸附于滤纸上，很难分离。再往滤液中加10mL的水，静置一天，待晶体析出。抽滤后，放置于培养皿中阴干，称重，共得302.25mg奥卡宁晶体。

d:HPLC分析

将步骤b得到的奥卡宁称取4g溶于100μL甲醇，经HPLC分析，初步得知该结晶为奥卡宁。通过面积归一化法，得知其纯度为94.151％。

将8-31管合并后的管液进行HPLC分析，得到的色谱图如图11所示，由图11可知，管液中主要含有奥卡宁。

将步骤c得到的奥卡宁溶于甲醇中，制成浓度为1mg/mL的奥卡宁溶液，经HPLC分析，得到的指纹图谱如图12所示，由图12可知，管液中主要含有奥卡宁。通过面积归一化法，得知其纯度为98.27％。

本发明实施例所述的雪菊中奥卡宁的提取方法，该方法通过萃取、硅胶柱层析、TLC分析，可以有效提取出奥卡宁，且纯度可达94.151％以上，经过重结晶后，纯度可达98.27％以上。

二实验测试

(一)实验材料

1：实施例3中重结晶得到的奥卡宁晶体；

2：萃取物(雪菊醇提物与萃取剂按照1:1的体积比萃取，萃取剂为正己烷和乙酸乙酯按照1:1的体积比混合而成)；

3：雪菊醇提物溶液(将雪菊醇提物溶于甲醇中，制成浓度为3mg/mL的溶液)

(二)方法

1、TLC分析

方法：将实验材料1-3进行TLC分析，点样量为3μL。展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(其体积比为9:7:3)，显色剂：2-APB和PEG400，在366nm和可见光下检测。

结果：结果如图13所示，上图在366nm下检视；下图在可见光下检视。图中1为奥卡宁晶体，2为萃取物，3为雪菊醇提物，A为奥卡宁。

2、红外分析

(1)仪器：红外光谱仪(岛津IR-Prestige，日本岛津)。

(2)方法：一维图谱：KBr压片法制样，将将实验材料1干燥、粉碎过200目筛，取样品粉末约2mg，分别与200mg溴化钾混合研磨充分均匀，压片测定，获得一维红外光谱图。

(3)结果：图14为奥卡宁结构式，图15为红外吸收光谱图，表6为红外吸收光谱归属。

表6奥卡宁红外吸收光谱归属

根据红外图谱可知3388cm-¹与-OH的伸缩振动相符，表明结构中含有-OH；2922cm-¹与C＝C的伸缩振动相符，表明结构中含有C＝C；1637cm-¹与C＝O的伸缩振动相符，表明结构中含有C＝O；1560-1500cm-¹与苯环的伸缩振动相符，表明结构中含有苯环。

3、质谱分析

(1)仪器：质谱仪(

TQD，美国Waters)。

(2)方法：称取实验材料1适量，加甲醇溶解，制成浓度约为1μg/ml的溶液作为样品溶液供测试用，分别测定供试品的一级和二级质谱图。

电喷雾负离子化(ESI-)，毛细管电压2.5kV，锥孔气压40V，源温度120℃，脱溶温度350℃，氩气流速50L/Hr，氮气流速750L/Hr。

(3)结果与解析：质谱扫描范围m/z 100-300，准分子离子峰[M-H]-m/z＝287，提示分子量为288，与结构吻合；二级质谱的主要离子为287，151，135(图16-17)，按奥卡宁的结构对其碎片进行归属，能得到合理的解释(图18)。

4、核磁分析

(1)仪器：核磁共振光谱分析仪(Inova 600型，美国Varian公司)

(2)测定方法：取5mg实验材料1溶于0.5mL氘代甲醇(D₂O，99.9％)中供测试用。测定奥卡宁的¹H-NMR。

(3)结果与分析：奥卡宁的¹H-NMR(CD3OD)谱如图19所示，¹H-NMR谱共振峰归属如表7所示。

表7¹H-NMR谱共振峰归属

m:多重峰，t:三重峰，d:双峰

1H-NMR(CD3OD)谱表明，除去活泼氢共振峰外，分子结构中共有7种不同环境的7个质子的共振峰，与奥卡宁的分子结构中氢原子组成相符。羟基仅出两个峰(δ：4.819；δ：4.545)，是因为羟基含有活泼氢，容易与溶剂发生氢氘交换，故有时会不出峰或者部分出峰。

5、熔点测定

(1)仪器：显微熔点仪(SGW X-4申光，上海精密科学仪器有限公司)。

(2)测定方法：调节升温速率使每分钟上升2.5-3.0℃，以样品开始产生气泡时的温度作为初熔温度，样品分解物开始膨胀上升时的温度为全熔温度。

测定奥卡宁之前，用酚酞标准品对显微熔点仪进行校正，其修正值为-2.2℃。

(3)结果与分析：供试品经鼓风干燥箱80℃干燥30min，取少量实验材料1于载玻片上，盖上盖玻片，放置在显微熔点仪载物台中央，开关调至加热状态，使温度不断升高，升温速率调至1-2℃/min，观察到奥卡宁由黄色固体变为液态。得到的熔点如表8所示。

表8显微熔点仪测得熔点

测定奥卡宁经过校正后其熔点为245.0-248.7℃，本实验测得值与文献报道奥卡宁熔点为235-242℃接近。

以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。

Claims

1.雪菊中奥卡宁的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将雪菊醇提物超声溶解于水中，超声时间为4-6min，得雪菊醇提物水溶液；

（2）将雪菊醇提物水溶液萃取2次，收集有机层并合并，得萃取液；所述萃取剂为正己烷和乙酸乙酯按照1:1的体积比混合而成；

（3）将萃取液真空干燥至浸膏状后，与硅胶混合均匀，研磨成粉末，用于干法上样，进行硅胶柱层析；

所述硅胶柱层析采用梯度洗脱，流速为4-6mL/min，流动相A为二氯甲烷，流动相B为甲醇，其体积分数变化依次为A 相90%，B 相10%； A 相80%，B 相20%；A 相70%，B 相30%； A 相60%，B 相40%；A 相50%，B 相50%；

（4）各管洗脱液通过TLC分析方法进行追踪分析，将相似组分合并后，进行真空干燥，浓缩至8-12ml后，冷却至室温并静置，待黄色晶体析出后，进行固液分离，收集晶体并洗涤、干燥，进行重结晶处理，得所述的奥卡宁。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中，

所述步骤（1）中，雪菊醇提物与水的质量体积比为1:30g/ml；

所述步骤（2）中，雪菊醇提物水溶液与萃取剂的体积比为1:1。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中，

所述步骤（3）中，真空干燥的温度为50-60℃，真空度为0.08Mpa；

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，其中，

所述步骤（3）中，真空干燥的温度为55℃。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中，

所述步骤（3）中，收集管数为25-37管。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中，

所述步骤（4）中，所述TLC分析方法中，展开剂为甲苯、乙酸乙酯和甲酸按照9:7:3的体积比混合而成；

显色剂为2-APB和PEG-400。

7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中，

所述步骤（4）中，所述相似组分合并后，进行真空干燥浓缩的具体步骤为：将相似组分合并后，分别在50-60℃、-0.08Mpa下真空干燥，浓缩至4-10mL后，加10mL的水，继续真空干燥，缩至8-12ml。