CN108926715A - Tagln基因表达抑制剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，具体涉及到TAGLN基因表达抑制剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用，申请人从生物力学的角度，研究不同基质硬度对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响，通过表达谱芯片，筛选出的基因TAGLN作为一个力学敏感性基因，在卵巢癌恶性进展中发挥了重要的作用。申请人通过靶向TAGLN基因进行的治疗，下调TAGLN基因的表达，通过体外和体内实验证明，TAGLN基因表达抑制剂能明显抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为，对卵巢癌具有临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及到TAGLN基因表达抑制剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用，申请人发现TAGLN基因具有力学敏感性，实验证明该基因能明显影响卵巢癌的恶性进展，在卵巢癌治疗中具有应用价值。
背景技术
肿瘤组织大多具有更硬的细胞外基质成分(ECM)，所以呈现出来较正常组织更硬的力学特征。肿瘤组织常常发生“desmoplasia”现象，也就是纤维化现象。生物力学是一门从组织和细胞内外的物理环境对生物体进行研究的学科，近年来，从生物力学的方向对肿瘤进行研究是研究的热门方向之一，目前国际上对此已经有一定的研究进展。在衰老过程中，癌症、纤维化和心血管疾病的病理过程中，组织会变得僵硬。细胞外基质变硬是一种明显的力学信号，它先于疾病，通过改变细胞生物学行为来推动疾病进展。针对细胞外基质力学，通过阻止或逆转组织硬化或阻断细胞对力学信号的反应，是一种很有潜力的临床治疗方法。目前，靶向肿瘤基质硬度及相关力学信号通路的治疗方式已经成为肿瘤治疗的新方向。
针对肿瘤中力学信号敏感的基因对肿瘤进行治疗已有研究成果。例如，YAP基因和Rho家族蛋白作为力学信号通路相关的基因，针对这些基因的治疗已经成为纤维化相关疾病的治疗手段之一。赖氨酰氧化酶(LOX)是细胞产生的蛋白质，因此，酶引起的细胞外基质交连可以在转录，转录后以及催化水平进行干扰。由于其在纤维化和动脉粥样硬化过程中的活性作用，LOX在肿瘤基质和前转移灶的形成中具有双重作用，因此越来越被认为是一个治疗靶点。采用非特异性铜螯合物四硫钼酸盐处理，它是铜的LOX催化部位，在2期临床试验中降低了血清LOXL2的浓度，对高危的初级阶段乳腺癌患者进行了临床试验。四硫钼酸盐也被应用在胆汁性肝硬化(NCT00805805)和非小细胞肺癌(NCT01837329)中。
发明内容
本发明的目的在于提供了TAGLN基因表达抑制剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术手段：
申请人的发明思路如下：
针对目前对卵巢癌治疗手段有限的情况，申请人从生物力学的角度，研究探索针对肿瘤基质硬度及生物力学相关基因对卵巢癌的治疗价值。本研究在体外证明了不同基质硬度对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响。通过表达谱芯片，筛选出的基因TAGLN作为一个力学敏感性基因，在卵巢癌恶性进展中发挥了重要的作用。
TAGLN基因表达抑制剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述的抑制剂包括利用本发明的常规方案，制备成的人TAGLN基因表达抑制剂。
以上所述的应用中，所述的表达抑制剂包括但不限于TAGLN基因RNAi慢病毒，或是TAGLN基因iRNA，或是抑制TAGLN基因表达的化合物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
申请人通过研究发现，基质硬度能影响卵巢癌细胞的恶性生物学行为，证明了基质硬度在卵巢癌中的重要作用。鉴于基质硬度对卵巢癌恶性进展的促进作用，改变基质硬度对卵巢癌调控的关键基因成为了一种可以抑制肿瘤进展的手段。申请人首次发现，TAGLN作为一个对组织机械力刺激具有反应性的基因，在卵巢癌恶性进展中发挥了重要作用，揭示了TAGLN基因作为力学敏感性基因，在基质硬度相关的卵巢癌恶性行为中具有重要调控作用。
通过靶向TAGLN基因进行的治疗，下调TAGLN基因的表达，对卵巢癌具有临床应用价值。
附图说明
图1为基质硬度促进卵巢癌细胞恶性表型示意图；
其中：a：软件分析白光图下不同硬度培养的SK-OV-3和ES-2细胞的表面积，*p<0.05,***p<0.001；
b：Transwell方法分析不同基质硬度培养下的细胞的迁移能力，*p<0.05；
c：Transwell方法分析不同基质硬度培养下的细胞的侵袭能力，*p<0.05,**p<0.01；
d：EdU实验分析不同硬度培养下细胞的增殖能力，蓝色：DAPI(细胞核)。比例尺：50μm。
图2为TAGLN基因确定为在卵巢癌中是受硬度调控的关键基因示意图；
其中：a：表达谱芯片分析不同硬度培养下的SK-OV-3细胞内基因表达差异，热图显示SK-OV-3细胞在较硬PA胶培养下与在较软PA胶培养下的细胞内差异表达基因，热图中的红色和绿色分别代表基因差异倍数相对很大或很小；
b：Real-time PCR检测不同硬度PA胶培养下的SK-OV-3和ES-2细胞内TAGLN基因表达水平，以0.5kPa作相对表达值，**p<0.01；
c：Western blot分析不用硬度培养下的SK-OV-3和ES-2细胞内TAGLN,GAPDH表达情况。GAPDH作为内参；
d：对western blot结果进行定量分析的统计图。***p<0.001，****p<0.0001。
图3显示下调TAGLN基因表达能明显抑制卵巢癌的恶性进展；
其中：a：三对siRNA转染下调SK-OV-3和ES-2细胞内TAGLN表达，western blot方法检测TAGLN蛋白表达情况，GAPDH作为内参；
b：SK-OV-3和ES-2细胞内转染TAGLN的siRNA以及对照siRNA，用Transwell方法检测不同基质硬度培养下的各处理组细胞迁移能力的差异，*p<0.05；
c：SK-OV-3和ES-2细胞内转染TAGLN的siRNA以及对照siRNA，用Transwell方法检测不同基质硬度培养下的各处理组细胞侵袭能力的差异，*p<0.05；
d：SK-OV-3和ES-2细胞内转染TAGLN的siRNA以及对照siRNA,EdU实验分析细胞的增殖能力，显示代表性视野，蓝色：DAPI(细胞核)，比例尺：50μm；
e：慢病毒转染细胞(sh-control,sh-TAGLN(RNAi)),western blot方法检测TAGLN蛋白表达情况，GAPDH作为内参；
f：小动物活体成像系统检测不同细胞处理组小鼠体内肿瘤负荷情况，显示代表性图像；
g：软件对荧光素酶发光强度进行定量分析，对各组小鼠肿瘤负荷定量结果进行统计分析(n＝8)，**p<0.01。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
TAGLN基因的表达量与基质硬度相关：
1).使用胶原蛋白包被的不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶(polyacrylamidehydrogel(PA gel))系统在体外模拟不同基质硬度对卵巢癌细胞的影响。
SK-OV-3,ES-2细胞(人卵巢癌细胞系SK-OV-3,ES-2细胞系购自美国典型物种保存中心，American Type Culture Collection)均培养于含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中(含青霉素100U/ml及链霉素100μg/ml),置于含5％CO2，相对湿度为95％的37℃培养箱中，细胞为贴壁生长。当密度达到80％-90％时，用含EDTA的胰蛋白酶消化传代)种到胶原蛋白包被好的不同硬度的PA胶上，发现细胞在较大基质硬度的培养情况下，细胞形态伸展得更好，细胞表面积更大(SK-OV-3:soft:705.6±69.54μm2,stiff:1628±209.7μm2,p＝0.0002；for ES-2:soft:512.9±82.34μm2,stiff:901.8±117.6μm2,p＝0.0187)[图1中a]，同时，我们发现，细胞的侵袭能力(fold change:SK-OV-3:4.242±0.797,p＝0.0152；ES-2:2.527±0.410,p＝0.0205)[图1中b]和迁移能力(fold change:SK-OV-3:1.707±0.2213,p＝0.0331；ES-2:1.763±0.145,p＝0.0062)[图1中c]均明显强于在较软的基质上培养时。此外，我们用EdU实验检测发现较硬基质上培养的卵巢癌细胞增殖能力明显强于在较软基质上培养时[图1中d]。因此，证明基质硬度能影响卵巢癌细胞的恶性生物学行为。
2).将在不同硬度基质上(0.5kPa,10kPa)培养的SK-OV-3细胞进行了表达谱芯片的检测，筛选受硬度调控的影响卵巢癌恶性表型的关键性基因。通过对表达谱芯片的结果进行分析，我们发现TAGLN这个基因是一个受基质硬度调控的基因[图2中a]，实时定量PCR结果证明，卵巢癌细胞在较硬基质上培养时，TAGLN的mRNA表达水平明显高于在较软基质上培养时(1.383±0.06 fold in SK-OV-3,p<0.01；1.467±0.088 fold in ES-2，p<0.01)[图2中b]。同时，western blot实验证明，卵巢癌细胞在较硬基质上培养时TAGLN的蛋白表达水平明显高于在较软基质上培养时(western blot quantification:for SK-OV-3:foldchange:3.863±0.093,p<0.0001；for ES-2:fold change:2.85±0.121,p＝0.0001,respectively)[图2c-d]。因此，我们筛选并证明TAGLN是一个在卵巢癌中受基质硬度调控的基因。
实施例2：
TAGLN基因表达抑制剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用：
我们在SK-OV-3及ES-2细胞系中使用siRNA干扰技术下调TAGLN的表达，进一步研究TAGLN基因表达抑制剂在体外对卵巢癌细胞的作用。
我们使用了三对不同序列的siRNA以及阴性对照(对照siRNA(siControl)购自广州锐博生物(siN05815122147-1-5)；TAGLN干扰siRNA购自Invitrogen，货号：HSS144175,HSS144177,HSS186189)对两种细胞进行转染，转染过程如下：
取对数期生长的细胞，消化后接种于6孔板中，至密度约为30％-50％。2.依照常规转染方法，在Opti-MEM(Gibco)培养基中，使用lipo3000(Invitrogen)转染试剂转染，4-6h后终止换液。72h后对细胞进行TAGLN蛋白检测，结果显示，三对siRNA均能很有效的下调TAGLN的蛋白表达[图3中a]。
下调TAGLN的SK-OV-3和ES-2细胞在较硬的基质培养条件下，细胞的迁移和侵袭能力均较对照组明显下调；不同的是，下调TAGLN的细胞在较软的基质培养条件下，细胞的迁移[图3中b]和侵袭能力[图3中c]与对照组相比，无明显变化。
该实验结果证明TAGLN基因表达抑制剂能明显抑制受基质硬度调控的卵巢癌细胞的侵袭转移能力。EdU实验结果证明，下调TAGLN的两种细胞在较硬的基质培养情况下，细胞增殖能力均较对照细胞相比有明显降低[图3中d]，显示TAGLN基因表达抑制剂能明显抑制细胞的增殖能力。因此，我们通过体外实验证明，TAGLN基因表达抑制剂能明显抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为。
实施例3：
TAGLN基因表达抑制剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用：
用TAGLN慢病毒(sh-TAGLN(RNAi))构建了稳定下调TAGLN基因表达的SK-OV-3细胞系，对照慢病毒(sh-control)转染SK-OV-3细胞作为对照。
稳定下调TAGLN基因表达的SK-OV-3细胞系的构建过程如下：
1.取对数期生长的SK-OV-3细胞，消化后接种于6孔板中，至密度约为30％-50％。
2.在Opti-MEM培养基中按照说明书加入适量Polybrene，根据推荐的MOI计算病毒剂量(MOI＝5)，加入细胞中。TAGLN慢病毒(sh-TAGLN(RNAi))及对照病毒(sh-control)购自吉凯基因(上海)。24h后终止换液。Western blot实验结果显示，与对照病毒(sh-control)转染SK-OV-3细胞相比，sh-TAGLN(RNAi)转染的SK-OV-3细胞，TAGLN蛋白水平表达明显降低，证明构建成功[图3中e]。
用构建的稳定下调TAGLN表达的SK-OV-3细胞系及对照细胞系在Balb/c-nu雌性5周龄小鼠中构建卵巢原位移植瘤，5周后终止实验，使用小动物活体成像系统检测不同细胞处理组小鼠体内肿瘤负荷情况。实验结果显示，TAGLN表达下调组(sh-TAGLN(RNAi))较对照组(sh-control)相比，肿瘤体积明显较小(p<0.01)，且未观察到明显的腹腔转移情况[图3中f]，用软件对荧光素酶发光强度进行定量分析，也进一步证明了这一结论[图3中g]。因此，我们通过体内实验证明，TAGLN基因表达抑制剂能明显抑制卵巢癌的恶性进展。
Claims (2)
1.TAGLN基因表达抑制剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的TAGLN基因表达抑制剂为TAGLN基因RNAi慢病毒，或是TAGLN基因iRNA，或是抑制TAGLN基因表达的化合物。
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