CN108926558A

CN108926558A - 含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物

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Publication number: CN108926558A
Application number: CN201810738572.8A
Authority: CN
Inventors: 王文坤; 赵振燕; 董芳梅; 童小丽
Original assignee: Pan Baofeng
Current assignee: Pan Baofeng
Priority date: 2018-07-06
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2018-12-04

Abstract

含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物，其由作为活性成分的联苯苄唑和去异丁酰蜂斗菜内酯H，和至少一种适用于皮肤外用的辅料组成；所述外用组合物中去异丁酰蜂斗菜内酯H与联苯苄唑的质量比为1:1.3～1.9，联苯苄唑质量百分比量为0.8％～1.2％。所述组合物制成凝胶剂；所述凝胶剂的辅料选自卡波姆、保湿剂、溶剂、防腐剂、表面活性剂、pH调节剂中的一种或几种，以及余量的水。所述卡波姆为卡波姆940，卡波姆940用量为组合物总质量的0.5％～1.5％；所述溶剂为乙醇；所述的保湿剂为丙三醇，用量为4％～8％；所述表面活性剂优选吐温‑80，用量为0.5％～1％；所述防腐剂为尼泊金乙酯。

Description

含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物

技术领域：

本发明提供了一种外用抗真菌组合物。

背景技术：

真菌性皮肤病是指由病原真菌所引起的人类皮肤以及黏膜、毛发和甲等皮肤附属器的一大类感染性疾病，其病原菌有多种，如红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏小孢子菌及念珠菌(光滑念珠菌、白色念珠菌)等，在现有技术中在治疗真菌性皮肤病时，广泛使用典型抗真菌药物如联苯苄唑、酮康唑、硝酸咪康唑等的外用制剂，然而。由于广泛使用，真菌致病菌的对联苯苄唑的耐药性问题越来越突出，现有抗真菌药物外用制剂在应对皮肤真菌病时已经越来越力不从心。继续增加剂量会造成副反应增加的潜在风险，且更加容易刺激致病菌的抗药性。

菊科蜂斗菜属包括如蜂斗菜、中国台湾蜂斗菜、掌叶蜂斗菜等，一般认为其具有解毒祛瘀、消肿止痛等功效，治疗痈肿疔毒，毒蛇咬伤等。随着药材活性成分提取分离技术的发展，从蜂斗菜属植物中逐渐分离提取出多种化合物，研究中认为以蜂斗菜中分离的以蜂斗菜内酯为首的倍半萜型内酯化合物具有提高细胞抗缺氧性能的效果，具有作为抗脑缺血药物的潜力，在先期研究中发现，提取自中国台湾蜂斗菜中的一种倍半萜内酯——去异丁酰蜂斗菜内酯H(结构如下式)

以一定比例与联苯苄唑共同给药时，可以提高对人工诱导耐药治病真菌的治疗效果，因此如何在该研究的基础上，提供能够对耐药致病真菌具有较好治疗效果的含有蜂斗菜提取物的外用组合物成为现有技术中中亟待解决的问题。

发明内容：

为解决前述技术问题，本发明提供的技术方案为：

含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物，其特征在于所述外用组合物由作为活性成分的联苯苄唑和去异丁酰蜂斗菜内酯H，和至少一种适用于皮肤外用的辅料组成；所述外用组合物中去异丁酰蜂斗菜内酯H与联苯苄唑的质量比为1:1.3～1.9，联苯苄唑质量百分比量为0.8％～1.2％。

含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物，其特征在于所述去异丁酰蜂斗菜内酯H 与联苯苄唑的质量比为1:5～1.7。特别优选去异丁酰蜂斗菜内酯H与联苯苄唑的质量比为1:1.6，联苯苄唑的质量百分比含量为1％。

所述的含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物，其特征在于所述组合物制成凝胶剂、乳膏剂、涂膜剂，优选制成凝胶剂。所述凝胶剂的辅料选自卡波姆、保湿剂、溶剂、防腐剂、表面活性剂、pH调节剂中的一种或几种，以及余量的水。

所述卡波姆为卡波姆940，卡波姆940用量为组合物总质量的0.5％～1.5％；所述溶剂为乙醇；所述的保湿剂为丙三醇，用量为4％～8％；所述表面活性剂优选吐温-80，用量为 0.5％～1％；所述防腐剂为尼泊金乙酯。

本发明中所述百分比均为占组合物的重量百分比。

本发明提供的含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物，虽然去异丁酰蜂斗菜内酯H本身对致病真菌的标准菌株和人工诱导耐药菌株均几乎无抑菌效果，但在质量比为 1:1.2～1.8的范围内，去异丁酰蜂斗菜内酯H和联苯苄唑联合使用可以对经过人工诱导耐药的红色毛癣菌菌株表现出更好的抑菌效果。且动物实验表明，本发明提供的含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物对于人工诱导耐药红色毛癣菌导致的真菌性皮肤病的的治疗效果高于单独施用联苯苄唑和去异丁酰蜂斗菜内酯H。去异丁酰蜂斗菜内酯H无明显的皮肤刺激性和口服的蓄积毒性。说明特定比例的去异丁酰蜂斗菜内酯H与联苯苄唑能够联用能够产提高对耐药致病菌导致的皮肤真菌病治疗效果。在进一步实验中我们发现，去异丁酰蜂斗菜内酯H与联苯苄唑的配比在约1:1.6时，上述协同效果更为明显。

具体实施方式：

原料药：去异丁酰蜂斗菜内酯H，含量≥98％；联苯苄唑，含量≥99％

药理实施例1、耐药菌株的制备

制备方法

1)标准菌株采用红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)，(编号:ATCC228188)，将红色毛癣菌的标准菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，于28℃的培养箱中活化7～14d，选取生长状态良好，无污染的菌落作为受试菌株，选取生长状态良好，无污染

的菌落作为受试菌株，于菌落上滴加适量0.85％无菌生理盐水，用无菌棉棒轻轻反复刮擦菌落表面，使孢子充分与生理盐水充分混合。用两层纱布过滤菌悬液至离心管中，再放置于涡旋振荡器中振荡15s左右。用血细胞计数板进行计数，用无菌生理盐水调整菌液浓度至 2～6×10⁵cfu/mL，最后用不含氮源的PRMI-1640培养基稀释10倍，备用#

2)检测联苯苄唑对红色毛癣菌的最小抑菌浓度(MIC)，按照CLSIM38-2方案进行，质控菌株为近平滑念珠菌(ATCC 22019)对红色毛癣菌标准菌株的MIC结果与阴性对照组相比，能够显著抑制真菌生长(约80％)的最小浓度为最小抑菌浓度

3)耐药菌株的诱导根据MIC测定的结果，配制2倍MIC浓度的联苯苄唑药液培养基，分别分装到10个EP管中，每管0.5mL。转移0.5mL红色毛癣菌菌液至每管EP管中，吹打均匀后放置到28℃培养箱中培养3d后转移PE管中10μL菌液至4倍联苯苄唑MIC浓度的 PDA培养基上，用无菌接种环划平板，放入28℃培养箱中培养7d～14d，以获得单克隆耐药菌株。以诱导后菌株对联苯苄唑MIC浓度为诱导前8倍，并在PDA培养基传代2次后仍能 MIC值仍能保持为诱导前8倍以上，作为成功诱导耐药的标准，若未达此标准，则重复前述步骤。

药理实施例2、体外抑菌效果实验

1、培养基的制备

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，质量分数为马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂1.8％。每个试管中加入5ml培养基制备成斜面培养基；直径90mm的平皿中加入20ml培养基制备成平板培养基

2、实验方法

2.1菌株的处理

①将药理实施例1中制备的人工诱导耐药的红色毛癣菌菌株和标准菌株分别使用灭菌接种环转种于平皿PDA培养基活化菌株，丝状型真菌采取一区划线法，置于28℃恒温培养箱，培养7天。

2.2制作菌悬液

挑取适当菌落团块，溶于1mL加入吐温80的0.9％灭菌生理盐水。用微量振荡器震荡2min，充分震荡洗脱出孢子，使用血细胞计数器调节菌悬液浊度至5分震荡⁶～10分震荡⁶CFU/mL。

2.3制作含菌平板

抽取0.5ml菌悬液置于PDA平皿培养基，用灭菌涂布棒使之均匀分布于培养基表面。

2.4打孔加药

以直径6mm的打孔器在涂菌后的培养基上打孔，挑去孔内琼脂，将待测试药物分别挤入1ml无菌注射器中，每孔内加药0.1ml。

将活性成分溶于DMSO后再按下表所示浓度配制成混合溶液后，作为各组的待测试药物

2.5培养与结果测量

药敏实验平板置于28℃恒温培养箱，培养10天。使用游标卡尺测量每种药的抑菌环半径，记录各药孔周围抑菌圈半径mm值。每株菌同时做3个平板。

结果如下(单位mm，n＝3，means±s)

体外抑菌实验的结果表明，单用去异丁酰蜂斗菜内酯H的实验组几乎无抑菌活性，与单用活性成分的实验组7/8和采用不同比例的实验组1/6相比，实验组3/4/5对耐药菌株和标准菌株的抑制效果均显著提高，且对于耐药菌株提高效果更为明显。基于上述实验结果，将去异丁酰蜂斗菜内酯H与联苯苄唑的比例为1:1.3～1：1.9，并基于该比例制备制剂实施例的外用组合物。

。实施例1

去异丁酰蜂斗菜内酯H 6.25g联苯苄唑10g，

卡波姆940 5g，丙三醇50g吐温80 5g

尼泊金乙酯1g蒸馏水加至1000g

将卡波姆与吐温80及300ml蒸馏水混合，再将联苯苄唑及去异丁酰蜂斗菜内酯H溶于适量乙醇后逐渐加入搅匀，补足余量的水搅匀即得透明凝胶。

实施例2

去异丁酰蜂斗菜内酯H 7.6g联苯苄唑10g

卡波姆934 10g丙三醇50g吐温80 5g

蒸馏水加至1000g

将卡波姆与吐温80及300ml蒸馏水混合，0.1M氢氧化钠溶液调节上液pH为7，再将联苯苄唑及去异丁酰蜂斗菜内酯H溶于适量乙醇后逐渐加入搅匀，补足余量的水搅匀即得透明凝胶。

实施例3

去异丁酰蜂斗菜内酯H 5.3g、联苯苄唑10g

卡波姆940 15g丙三醇50g吐温80 5g

尼泊金乙酯1g氢氧化钠4g蒸馏水加至1000g

将卡波姆与吐温80及300ml蒸馏水混合，0.1M氢氧化钠溶液调节上液pH为7，再将联苯苄唑及去异丁酰蜂斗菜内酯H溶于乙醇后逐渐加入搅匀，补足余量的水搅匀即得透明凝胶。

实施例4

去异丁酰蜂斗菜内酯H 6.6g、联苯苄唑10g

卡波姆940 10g乙醇60g丙三醇80g吐温80 10g

尼泊金乙酯1g氢氧化钠4g蒸馏水加至1000g

将卡波姆与吐温80及300ml蒸馏水混合，0.1M氢氧化钠溶液调节上液pH为7，再将联苯苄唑及去异丁酰蜂斗菜内酯H溶于乙醇后逐渐加入搅匀，补足余量的水搅匀即得透明凝胶。.

实施例5

去异丁酰蜂斗菜内酯H 6g、联苯苄唑10g

卡波姆940 15g丙三醇80g吐温80 10g

尼泊金乙酯1g氢氧化钠4g蒸馏水加至1000g

对比例1

按照实施例1的配方，将活性成分改为联苯苄唑10g。

对比例2

按照实施例1的配方，将活性成分改为去异丁酰蜂斗菜内酯H 10g。

药理实施例2真菌抑菌效果对比实验

1、材料

实验动物为Hartley豚鼠，体重300±20g,雌雄各半，

2、菌悬液的制备

将药理实施例1值得的的红色毛癣菌人工诱导耐药菌株在PDA固体培养基上连续传代培养2次(28℃)，以保证其活力。于第二次培养5d后，挑其菌落与0.9％生理盐水中，制成终浓度为1×10⁸CFU/mL的菌悬液。

3、造模

豚鼠背部剃刀剃毛，用日本脱毛蜡脱毛，形成沿脊柱对称的两个4.0cm×4.0cm的无毛区。对无毛区进行真菌直接镜检及培养,结果均为阴性确认为阴性后用砂纸在豚鼠背上轻轻均匀地摩擦,并将菌悬液200μL均匀涂布于背部无毛区。涂菌1次后,连续观察10天。

4、分组及给药

取造模成功的实验动物随机分组，每组5只，每只动物的两个无毛区，给予同一种药物，连续给药7d，并记录给药前和给药7d后的评分，

评分标准

4分：红、肿、皮肤增厚，皮屑致密布满整个皮损部位。

3分：红、肿，皮损部位皮屑间有点状正常皮肤,累计小于25％。

2分：微红、不肿，皮损部位皮屑间有线状正常皮肤,累计小于50％。

1分：不红、不肿，皮损部位有少许皮屑间，75％以上皮肤正常。

0分：不红、不肿，基本正常。

分组给药与实验结果见下表

实验结果表明，实验1～5组采用本发明实施例提供的组合物，对人工诱导耐药红色毛癣菌感染模型动物的治疗效果既优于对照组，也优于采用单一活性成分的实验6/7组，说明本发明提供的组合物通过优选去异丁酰蜂斗菜内酯H和联苯苄唑的比例，提高了对于皮肤真菌感染的治疗效果，而采用实施例1的实验1组，其效果也明显优于其他实实验组。

Claims

1.含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物，其特征在于所述外用组合物由作为活性成分的联苯苄唑和去异丁酰蜂斗菜内酯H，和至少一种适用于皮肤外用的辅料组成；所述外用组合物中去异丁酰蜂斗菜内酯H与联苯苄唑的质量比为1:1.3～1.9，联苯苄唑质量百分比量为0.8％～1.2％。

2.如权利要求1所述的含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物，其特征在于所述去异丁酰蜂斗菜内酯H与联苯苄唑的质量比为1:5～1.7。

3.如权利要求1所述的含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物，其特征在于去异丁酰蜂斗菜内酯H与联苯苄唑的质量比为1:1.6，联苯苄唑的质量百分比含量为1％。

4.如权利要求1～3任一所述的含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物，其特征在于所述组合物制成凝胶剂；所述凝胶剂的辅料选自卡波姆、保湿剂、溶剂、防腐剂、表面活性剂、pH调节剂中的一种或几种，以及余量的水。

5.如权利要求4所述的含有一种蜂斗菜提取物的抗耐药真菌外用组合物，其特征在于所述卡波姆为卡波姆940，卡波姆940用量为组合物总质量的0.5％～1.5％；所述溶剂为乙醇；所述的保湿剂为丙三醇，用量为4％～8％；所述表面活性剂优选吐温-80，用量为0.5％～1％；所述防腐剂为尼泊金乙酯。