CN108893527A - 一种检测苔藓虫在污损早期附着程度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测苔藓虫在海洋污损中早期附着程度的方法，该方法包含以下步骤：(1)苔藓虫特异性引物的设计；(2)污损早期不同涂层表面海水污损样本的采集和基因组提取；(3)利用苔藓虫特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来定量检测苔藓虫的附着程度。本发明基于海洋污损真核生物苔藓虫的18S核糖体RNA基因序列设计特异性引物，提供了一种不依赖于纯培养体系的苔藓虫附着测定方法，为海水现场污损样本中苔藓虫的附着程度检测提供了高效、快速的技术手段。同时，该方法也适用于室内纯培养体系中不同涂层表面的苔藓虫附着测定。

Description

一种检测苔藓虫在污损早期附着程度的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及在主要的海洋污损生物中对污损早期苔藓虫附着的测定。

背景技术

苔藓虫、牡蛎等多种附着海洋生物，它们的幼虫或孢子吸附在轮船底部或海洋结构物表面，吸附生长厚度有时可达10公分，给行船额外带来大量能耗，同时释放酸性物质腐蚀船底，这就是海洋生物污损。海洋生物污损给全世界海洋产业的发展带来严重危害，极大程度上限制了人类对于海洋资源的开发和利用，海洋防污成为亟待解决的重要问题。

主要的海洋污损生物(macrofouler)是苔藓虫、藤壶、牡蛎、盘管虫、海鞘、某些藻类、贻贝、海绵等。作为海洋污损生物的代表物种之一，苔藓虫属真体腔动物，是海洋底栖动物的重要组成之一，种类多，分布广，常常形成群体，密布在岩壁、鱼网、船底、浮标等物体上，在海洋污损生物中的出现频率很大。

尽管国内外已有许多有关海洋防污技术的研究，但是这些发现很多尚没有针对主要的海洋污损生物进行实际的长期的海水实验。相关的防污机制研究、尤其是在分子水平上的深入研究，相对还是非常缺乏。而在世界不同海域不同的船舶所遇到的生物污损问题和程度不尽相同，尤其是污损生物种类繁多，各自附着的分子机制有所不同，很难使用一种或几种防污涂料就能解决所有问题。将来可能陆续需要研制分别针对不同污损生物附着的防污涂层以及组合防污涂层。所以，在细胞和分子生物学水平上对污损生物进行足够的研究就显得非常重要，否则，尽快找到通用的环保型防污技术的可能性将会大大降低。

而要完成上述研究任务，一个非常必要的先期任务是建立主要污损生物幼虫在早期污损期间附着程度的定量测定方法。而想要对苔藓虫早期附着时进行测试其附着率，分子标记方法成为首选的技术手段。该方法能够避开生物形态结构差异的干扰，直接通过检测生物体内大分子包含的稳定遗传信息，定量描述、分析附着情况，在相当程度上提高了鉴定主要海洋污损早期生物物种的准确度和效率。

苔藓虫的附着程度检测至少在如下几个方面非常重要:(1)快速比较一批防污涂层在海洋污损早期抑制苔藓虫附着能力的差异；(2)比较某个涂层在室内苔藓虫纯培养体系中幼虫附着率与实际海水中幼虫附着率的差异。(3)优质涂层抑制海洋污损的机制研究：有时需要测定在某个特定的涂层表面苔藓虫的附着生长被抑制是由于幼虫附着被抑制还是附着后生长被抑制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在海洋污损中对污损早期苔藓虫附着程度进行测定的方法。测定的特异性是由三对苔藓虫特异性引物来保障的，三对特异性引物均基于苔藓虫的18s rDNA设计。它们与核糖体模因18s rDNA的通用引物一起使用可以确保苔藓虫基因扩增的特异性。扩增结果可以通过 qPCR或一般PCR结束后的凝胶扫描来实现定量测定。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

(1)苔藓虫特异性引物的设计；

(2)污损早期(肉眼可见附着之前)海水污损样本的采集和基因组提取；

(3)利用苔藓虫特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来测定苔藓虫的附着程度。

苔藓虫特异性引物的设计方法如下：比较主要海洋污损真核生物的18S核糖体基因序列，找出来苔藓虫的特异性SNP(单核苷酸多态性)位点。该位点作为引物的3’最末端位置使用。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间没有错配或形成一个错配(弱错配:A-C,T-G；或者是中等强度的错配:A-A,C-C,G-G)，与非靶序列也形成一个错配(强错配:T-T,T-C,A-G；或者是中等强度的错配:A-A,C-C,G-G)。这样一来，引物与靶序列完全配对或只有一个3’倒数第二位的错配，一般不影响扩增效果，而与非靶序列有两个3’最末端的连续两个错配，一般导致扩增失败。如此可以获得苔藓虫特异性引物。

通过上述方法设计的三对苔藓虫特异性引物分别为：

上述引物与通用引物比如F566:5’-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’一起使用可以完成早期污损样品中苔藓虫存在与否的测定判断。其中特异性引物Bug1在唇口目(Cheilostomatida)覆盖率较大，特异性引物Bug2是新唇口亚目(Neocheilastomina)特异性引物，特异性引物Bug3是网纱帐苔虫(Conopeum reticulum)的种特异性引物。

将设计筛选出的3对苔藓虫特异性引物应用到污损早期不同涂层表面的真核生物群落，依据PCR或 qPCR扩增结果及对应引物信息从而定量检测苔藓虫的附着程度。

上述有关步骤的具体内容如下：

(1)设计苔虫属对应的特异性引物：

通过某海水污损样本中18s rDNA的扩增(扩增引物为5’-AAC CTG GTT GAT CCTGCC AGT-3’和5’-GAT CCT TCT GCA GGT TCA CCT AC-3’)及克隆测序，获得一批有效克隆,之后进行 BLAST生物信息学分析,确认一批污损真核生物(含苔藓虫)的各自的18S序列。很多18S序列也可以通过数据库下载整理得到。通过对上述18S序列的多序列比对和反复比较,找出来苔藓虫的若干个特征性SNP(单核苷酸多态性)位点多个。以这些SNP位点作为引物的3’最末端位置尝试设计引物。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间形成一个错配，与非靶序列也形成一个错配。这样一来，引物与靶序列只有一个3’倒数第二位的错配，而与非靶序列有两个3’最末端的连续两个错配。扩增长度在100-500碱基以便于用于qPCR(也可以用于一般PCR)。这些引物对经过合成后以苔藓虫18S序列的克隆纯质粒为模板进行PCR验证扩增特异性，以及qPCR验证 (要求只扩增出来特异性的条带，Tm值分析只有主带(不含引物二聚体)，确定各对引物的特异性。选出最佳扩增特异性的引物(对)。特异性引物也可以与通用引物配对使用。原则上可以设计出来不止一对最佳引物。因为苔藓虫本身的亚种很多，可以依据丄述方法设计某个或某些特定亚种的特异性引物，也可以设计某类苔藓虫区分特定其他物种(如盘管虫)的特异性引物。最佳引物对之一为Bug1F: 5’-CGGCACGAACACTGTTATGACA-3’与通用引物F566:5’-GGC ATC ACA GAC CTG TTA TTGC-3’使用，扩增出来的产物(400左右碱基对)经过DNA测序证明全部为苔藓虫18S序列。经过查阅资料，获知苔藓虫的分类信息，见表格1。

表1苔藓虫分类信息

经过分析，设计筛选出的3对苔藓虫特异性引物可针对不同的苔藓虫层级。特异性引物Bug1在唇口目(Cheilostomatida)覆盖率较大，特异性引物Bug2是新唇口亚目(Neocheilastomina)特异性引物，特异性引物Bug3是网纱帐苔虫(Conopeum reticulum)的种特异性引物。

(2)污损早期(肉眼可见附着之前)海水污损样本的采集和(宏)基因组提取：

适用于海上现场取样或室内纯培养体系中的污损样本取样。海上早期污损样本的现场采集和宏基因组提取可采用热酚氯仿抽提法，其具体步骤为：1)将污损样品在海上(现场)刮下来约200微升，内含各种海洋生物及附着的苔藓虫(纯培养体系中就只有苔藓虫)，添加600微升饱和酚(pH8)，剧烈震荡一分钟，带回实验室。2)75℃水浴震荡10分钟后，室温静置3min，10000r/min离心10min；3)吸取上原清液至新EP管中并加入等体积酚，剧烈震荡1min后10000r/min离心 10min；4)取其上层清液再加入等体积酚氯仿(1:1)，混匀1min后10000r/min离心15min；5)取上层清液再加入等体积的氯仿，混匀1min后10000r/min离心15min；取上清即为样品的(宏)基因组。也可以使用其他合适的宏基因组提取试剂盒。

(3)利用苔藓虫特异性引物对上述(宏)基因组样本进行一般PCR扩增来测定苔藓虫的附着：

以上述基因组样品作为PCR扩增模板，以设计得到的三对苔藓虫特异性引物之一与通用引物作为扩增引物进行PCR扩增反应。反应体系如表2所示。(NPK系列试剂盒来自威海晓东生物)

表2 PCR体系的组成(以NPK64试剂盒为例)

PCR循环参数为：94℃4min—(94℃30sec—60℃50sec—72℃50sec)×40cycles；PCR 扩增结束后，将12μL产物，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，并用凝胶成像系统观察并保存结果。结果判断：只有条带扩出且条带长度在400bp左右的，则是苔藓虫。

(4)利用苔藓虫特异性引物对上述(宏)基因组样本进行qPCR扩增来测定苔藓虫的附着：

上述表格2中的一般PCR体系也可以添加合适的荧光染料后以qPCR的方式进行，这样进行的qPCR 是针对样品中附着苔藓虫的18S核糖体基因的总拷贝数的定量方法，而非包括的苔藓虫的详细个数。这样的定量测定也有其一定的实用价值。定量所使用的标准物质可以是特异性引物所覆盖的任意一种苔藓虫的18S核糖体基因(片段)的克隆质粒。准确测定克隆质粒原液样本的浓度，并按10倍稀释

本发明的优点和有益效果：

1.提供了一种不依赖于纯培养体系的苔藓虫附着测定方法；

2.本发明提供的方法既适用于海水现场污损样本中苔藓虫的附着测定，也适用于适用于室内纯培养体系中不同涂层表面的苔藓虫附着测定；

3.本发明在分类层面上适合范围较广的苔藓虫亚种；

4.本发明的实施所涉及的耗材都是常见的分子生物学试剂，方便易得，成本低廉。所述的qPCR体系配置可以使用任何常见的试剂盒。

附图说明

图1第一次挂板表面污损早期苔藓虫幼虫附着程度的相对定量测试结果

图2第二次挂板表面污损早期苔藓虫幼虫附着程度的相对定量测试结果

图3苔藓虫引物(Bug1)对三次取样的绝对定量

具体实施方式

本发明结合附图通过以下实施案例进一步详述，但不局限于下述实施案例。

实施案例1.海洋污损样本的制备

为了探究加入不同纳米材料的防污涂层表面的苔藓虫附着情况进行挂板试验，模拟船体在海水的状态，从而得到海洋污损苔藓虫样品。在威海小石岛共挂板3次。

(1)第一次挂板，选用纳米12、33、51、58纳米涂层，共30块钢板，钢板的一面均涂铁红漆，另一面以铁红、PDMS(聚二甲基硅氧烷)两种不同涂料与这四种纳米材料进行混匀，组合后10种防污涂层，形成组内和组间的对照。进行海上挂板取样，结合有关对照，以便测定纳米材料在不同涂层基质(这里是铁红和聚二甲基硅氧烷PDMS两种基质)中混合均匀后形成的涂层表面对苔藓虫的附着程度的影响。纳米材料及钢板涂层种类相关信息见表3。

表3第一次挂板纳米材料及钢板涂层种类信息

(2)第二次挂板，选用纳米材料19-24，共36块钢板，钢板的一面均涂铁红漆，另一面以铁红、 PDMS(聚二甲基硅氧烷)两种不同涂层基质与这十八种纳米材料进行混匀(例如：纳米19+铁红、纳米19+PDMS)，在不同纳米材料间形成对照。进行海上挂板取样，以便测定纳米材料在不同涂层基质(这里是铁红和聚二甲基硅氧烷PDMS两种基质)中混合均匀后形成的涂层表面对苔藓虫的附着程度的影响。纳米材料及钢板涂层种类相关信息见表4。

表4第二次挂板纳米材料级钢板涂层种类信息

第三次挂板选用纳米材料33、58、8、9制备纳米涂层，共30块钢板，钢板的一面均涂铁红漆，另一面以铁红、PDMS(聚二甲基硅氧烷)两种不同涂料与这四种纳米材料进行混匀，组合后10种防污涂层，整体以铁红作为对照。纳米材料及钢板涂层种类相关信息见表5。

表5第三次挂板纳米材料级钢板涂层种类信息

实施案例2.从海水挂板样本中通过相对定量测定苔藓虫的附着

实施案例1中，第一次挂板期间海水温度为15度左右，钢板表面污损样品采集时间为①第11 天、②第17天和③第23天。提出污损样本的宏基因组，使用本发明中的苔藓虫特异性引物(Bug1F:5’ -CGG CAC GAA CAC TGT TAT GAC A-3’与通用引物F566:5’-GGC ATCACA GAC CTG TTA TTGC-3’)和表格2 实验条件扩增目标400bp片段。借助Gel-Pro软件扫描胶图的光密度值、分子量markerMD(上海生 工：100，250，500，750，1000，2000bp条带，上样6微升时750bp条带DNA含量为150ng)的定 量信息、样本上样体积及其总体积等数值可以计算不同涂层样本中苔藓虫扩增靶序列扩增总量，可以 作为各个样本中苔藓虫的相对附着量。结果如图1。

实施案例1中，第二次挂板期间海水温度为13度左右，钢板表面污损样品采集时间为①第9天、 ②第17天和③第24天。提出污损样本的宏基因组，使用本发明中的苔藓虫特异性引物(Bug1F:5’-CGG CAC GAA CAC TGT TAT GAC A-3’与通用引物F566:5’-GGC ATC ACAGAC CTG TTA TTGC-3’)和表格2实验 条件扩增目标400bp片段。借助Gel-Pro软件扫描胶图的光密度值、分子量marker MD(上海生工： 100，250，500，750，1000，2000bp条带，上样6微升时750bp条带DNA含量为150ng)的定量信 息、样本上样体积及其总体积等数值可以计算不同涂层样本中苔藓虫扩增靶序列扩增总量，可以作为 各个样本中苔藓虫的相对附着量。结果如图2。

实施案例3.从海水挂板样本中qPCR定量分析苔藓虫的附着

以实施案例1中第威海小石岛第三次挂板取的早期海洋污损真核生物幼虫混合样本宏基因组作为模板，选择苔藓虫引物(Bug1)完成不同钢板上的混合模版的定量。主要通过标准曲线、扩增曲线、及方差和扩增效率几个方面进行阐述。第三次挂板共10种涂层样本，涂层类型见表5。

(1)苔藓虫引物对(Bug1)定量第一次取样的宏基因组

标准样本为多室草苔虫(Bugula neritina)纯模板制备的18S rRNA扩增产物，其浓度为19ng/ul；通过10倍倍比稀释制备5个标准样品用于绘制标准曲线。第一次取样三次重复定量结果见表6。

表6利用Bug1引物对和qPCR定量测定第一次取样样本中苔藓虫的相对附着量

(2)苔藓虫引物对(Bug1)定量第二次取样

标准样本为多室草苔虫(Bugula neritina)纯模板制备的18S rRNA扩增产物，其浓度为19ng/ul；通过10倍倍比稀释制备5个标准样品用于绘制标准曲线。引物Bug1以第二次取样的混合样本为模板QPCR定量结果见表7。

表7利用Bug1引物对和qPCR定量测定第二次取样样本中苔藓虫的相对附着量

(3)苔藓虫引物对(Bug1)定量第三次取样

引物Bug1以第三次取样的混合样本为模板进行qPCR定量。标准样本为多室草苔虫(Bugula neritina)纯模板制备的18S rRNA扩增产物，其浓度为19ng/ul；通过10倍倍比稀释制备5个标准样 品用于绘制标准曲线。第三次取样三次重复定量结果见表8。

表8利用Bug1引物对和qPCR定量测定第三次取样样本中苔藓虫的相对附着量

三次取样的定量结果如图3所示。由图3得知，(1)整体趋势上，随着挂板时间的延长，幼虫 的附着量随之增加；(2)在防止苔藓虫幼虫附着效果上，测试的4种纳米涂层，均不具有此效用。 与对照组铁红涂层相比，加有纳米材料的防污涂层在防止苔藓虫幼虫附着上仅在距挂板第9天前，具 有一定的防止幼虫附着的效果；而距挂板第24天时，加有纳米材料涂层上(除铁红+纳米材料9)苔 藓虫幼虫附着量明显大于等于对照组上幼虫的附着量。

Claims (4)

1.一种检测苔藓虫幼虫早期附着程度的方法，该方法包含以下步骤：

(1)苔藓虫特异性引物的设计

(2)污损早期，海水污损样本的采集和基因组的提取。

(3)利用苔藓虫特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来测定苔藓虫的附着情况。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：苔藓虫特异性引物设计方法如下：

比较主要海洋污损生物的18S核糖体基因序列，找出苔藓虫的特异性单核苷酸多态性位点。该位点作为引物的3’最末端位置使用。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间没有错配或形成一个错配(弱错配:A-C,T-G；或者是中等强度的错配:A-A,C-C,G-G)，与非靶序列也形成一个错配(强错配:T-T,T-C,A-G；或者是中等强度的错配:A-A,C-C,G-G)。这样一来，引物与靶序列完全配对或只有一个3’倒数第二位的错配，一般不影响扩增效果，而与非靶序列有两个3’最末端的连续两个错配，一般导致扩增失败。如此可以获得苔藓虫特异性引物。

3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所设计的三对苔藓虫特异性引物分别为：

Bug1F CGGCACGAACACTGTTATGACA

Bug1R GGCATCACAGACCTGTTATTGC

Bug2F TTAATTCCGATAACGAACGAGTTT

Bug2R GGCATCACAGACCTGTTATTGC

Bug3F TCGTACACGTTTTGTTGGTGCT

Bug3R CCCGTGTTGAGTCAAATTAAGC

上述引物或上述引物之一与若干18S rDNA通用引物一起使用可以完成早期污损样品中苔藓虫存在与否的测定判断。其中特异性引物Bug1在唇口目(Cheilostomatida)覆盖率较大，特异性引物Bug2是新唇口亚目(Neocheilastomina)特异性引物，特异性引物Bug3是网纱帐苔虫(Conopeum reticulum)的种特异性引物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将设计筛选出的3对苔藓虫特异性引物应用到污损早期不同涂层表面的生物群落，依据PCR或qPCR扩增结果及对应引物信息从而定量检测苔藓虫的附着程度。