CN108893521A - 检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测红细胞葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶的试剂盒及检测方法,所述检测方法在检测葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶酶促反应活性的同时,检测了另一同功酶6‑‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶酶促反应活性,通过两种酶的酶促反应活性比值计算,判断是否缺乏葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶。本发明测试效率大幅提高,同时排除了因病人红细胞增多,测试标本吸入量不准,贫血、标本溶血、凝血、陈旧、污染等因素造成的假阳性、假阴性。本发明女性杂合子检出率可达到80%左右,而女性杂合子的检出,正是降低葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶缺乏症发病率,预防致死致残新生儿核黄疸发生的重要一环。
Description
技术领域
本发明属于血液检测技术领域,具体涉及一种检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒及检测方法。
背景技术
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是一种存在于人体红细胞内,协助葡萄糖进行新陈代谢的酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在协助葡萄糖进行新陈代谢的过程中会产生还原型辅酶Ⅱ以保护红细胞免受氧化性物质的破坏。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏时,若身体接触到具有氧化性的特定物质或服用了氧化性药物,红细胞就容易被破坏而发生急性溶血反应。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题,本发明提供一种检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒及检测方法。
本发明的技术方案为:
一种检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒,原料组分包括反应液R1、反应液R2和缓冲液;
所述反应液R1为葡萄糖-6-磷酸盐水溶液;
所述反应液R2为6-磷酸葡萄糖酸盐水溶液;
所述缓冲液为氧化型辅酶II、镁离子和三羟甲基氨基甲烷的混合水溶液,所述混合水溶液中氧化型辅酶II、镁离子和三羟甲基氨基甲烷的摩尔比为(0.13-1.17):(0.012-0.1065):(0.25-1.65)。
一种应用所述的试剂盒检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法,包括如下步骤:
(a1)取待测人抗凝全血,加入双蒸水,混匀后,等分得到两份溶血液;
(a2)取一份步骤(a1)所述溶血液,先加入缓冲液,混匀后进行第一次保温,然后加入反应液R1,混匀后进行第二次保温,得到混合液S1,测定所述混合液S1的吸光度得到吸光度A1;取另一份步骤(a1)所述溶血液,先加入缓冲液,混匀后进行第一次保温,然后加入反应液R2,混匀后进行第二次保温,得到混合液S2,测定所述混合液S2的吸光度得到吸光度A2;
(a3)计算A1和A2的比值,以判断是否缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
步骤(a1)中,所述双蒸水与所述抗凝全血的体积比为20:1-30:1。
步骤(a2)中,所述混合液S1中的溶血液、缓冲液以及反应液R1的体积比为1:20:10;所述混合液S2中的溶血液、缓冲液以及反应液R2的体积比为1:20:10。
步骤(a2)中,进行所述第一次保温的温度为37℃,进行所述第一次保温的时间为1-3min;进行所述第二次保温的温度为37℃,进行所述第二次保温的时间为3-7min;
步骤(a2)中,所述吸光度均为波长340nm处的吸光度。
进一步优选的所述反应液R1还添加硝基四氮唑蓝和吩嗪二甲酯硫酸盐,所述反应液R1中,硝基四氮唑蓝的浓度为0.00690-0.0207mol/L,吩嗪二甲酯硫酸盐的浓度为0.004469-0.01338mol/L;所述反应液R2还添加硝基四氮唑蓝和吩嗪二甲酯硫酸盐,所述反应液R2中,硝基四氮唑蓝的浓度为0.00690-0.0207mol/L,吩嗪二甲酯硫酸盐的浓度为0.004469-0.01338mol/L。
一种应用所述的试剂盒检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法,包括如下步骤:
(b1)取待测人抗凝全血,加入双蒸水,混匀后,等分得到两份溶血液;
(b2)取一份步骤(b1)所述溶血液,先加入反应液R1,混匀后进行保温,然后加入缓冲液,混匀后,得到混合液L1,测定所述混合液L1的吸光度得到吸光度A1';取另一份步骤(b1)所述溶血液,先加入反应液R2,混匀后进行保温,然后加入缓冲液,混匀后,得到混合液L2,测定所述混合液L2的吸光度得到吸光度A2';
(b3)计算A1'和A2'的比值,以判断是否缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
步骤(b1)中,所述双蒸水与所述抗凝全血的体积比为40:3-50:3。
步骤(b2)中,所述混合液L1中的溶血液、反应液R1以及缓冲液的体积比为1:1:40;所述混合液L2中的溶血液、反应液R2以及缓冲液的体积比为1:1:40。
步骤(b2)中,所述保温的温度均为37℃,所述保温的时间均为15-20min;
步骤(b2)中,所述吸光度均为波长650nm处的吸光度。
本发明的有益效果为:
(1)本发明所述的检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒及检测方法,检测原理为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化反应液R1中的葡萄糖-6-磷酸盐转化成6-磷酸盐葡萄糖酸时,伴随缓冲液中的氧化型辅酶II转化成还原型辅酶II,通过测定还原型辅酶II在340nm波长处的特征性光吸收,可间接反映出葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶促反应中的活性;再者,本发明在检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶促反应中的活性(吸光度A1)的同时,采用同样方法检测了另一同功酶6--磷酸葡萄糖酸脱氢酶酶促反应中的活性(吸光度A2),所述6--磷酸葡萄糖酸脱氢酶在红细胞内含量非常稳定,不易缺乏,因此所述6--磷酸葡萄糖酸脱氢酶就为每一个葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的测试标本提供了内质控,通过两个酶的活性比值(A1/A2)计算,判断是否缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,当A1/A2小于1时,即为缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
(2)所述反应液R1还添加硝基四氮唑蓝、吩嗪二甲酯硫酸盐,所述反应液R2还添加硝基四氮唑蓝、吩嗪二甲酯硫酸盐。这是由于:当缓冲液中的氧化型辅酶II转化成还原型辅酶II后,在所述还原型辅酶II以及吩嗪二甲酯硫酸盐的作用下,使得硝基四氮唑蓝发生还原反应,由黄色变为蓝色,通过测定蓝色物质在650nm处的特征性光吸收可间接反映出葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶促反应中的活性。本发明在检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶促反应中的活性(吸光度A1')的同时,检测了另一同功酶6--磷酸葡萄糖酸脱氢酶酶促反应中的活性(吸光度A2'),即为每一个测试标本提供了内质控,通过两个酶的活性比值(A1'/A2')计算,判断是否缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
(3)本发明测试方法测试效率大幅提高,同时排除了因病人红细胞增多,测试标本吸入量不准,贫血、标本溶血、凝血、陈旧、污染等因素造成的假阳性、假阴性;由于女性杂合子葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性多呈轻度降低,当检测结果显示0.95≤A1/A2≤1.05或0.95≤A1'/A2'≤1.05时即为可疑女性杂合子,本发明测试方法女性杂合子检出率可达到80%左右,远远超过同类其他检测方法38%的杂合子检出率,而女性杂合子的检出,正是降低葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症发病率,预防致死致残新生儿核黄疸发生的重要一环。
具体实施方式
下面通过具体实施例,对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒,原料组分包括:
反应液R1:0.45mmol/L葡萄糖-6-磷酸钠水溶液;
反应液R2:0.32mmol/L6-磷酸葡萄糖酸钠水溶液;
缓冲液:0.260mmol/L氧化型辅酶II水溶液0.5ml、0.0240mol/L氯化镁水溶液0.5ml和0.25mmol/L三羟甲基氨基甲烷水溶液1ml。
进一步,提供一种制备所述检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒的方法,包括如下步骤:
(a1)取50μl待测人抗凝全血,加入1ml双蒸水,混匀,得到溶血液;
(a2)取50μl步骤(a1)所述溶血液,先加入1ml缓冲液,混匀后在37℃保温1min,然后加入500μl反应液R1,混匀后在37℃保温3min,得到混合液S1,测定所述混合液S1在波长340nm处的吸光度A1;另取50μl步骤(a1)所述溶血液,先加入1ml缓冲液,混匀后在37℃保温1min,然后加入500μl反应液R2,混匀后在37℃保温3min,得到混合液S2,测定所述混合液S2在波长340nm处的吸光度A2;
(a3)A1/A2<1,说明缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
实施例2
本实施例提供一种检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒,原料组分包括:
反应液R1:1.35mmol/L葡萄糖-6-磷酸钠水溶液;
反应液R2:1.14mmol/L6-磷酸葡萄糖酸钠水溶液;
缓冲液:0.780mmol/L氧化型辅酶II水溶液1.5ml、0.0710mmol/L氯化镁水溶液1.5ml和0.55mmol/L三羟甲基氨基甲烷水溶液3ml。
进一步,提供一种制备所述检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒的方法,包括如下步骤:
(a1)取50μl待测人抗凝全血,加入1.5ml双蒸水,混匀,得到溶血液;
(a2)取50μl步骤(a1)所述溶血液,先加入1ml缓冲液,混匀后在37℃保温1min,然后加入500μl反应液R1,混匀后在37℃保温3min,得到混合液S1,测定所述混合液S1在波长340nm处的吸光度A1;另取50μl步骤(a1)所述溶血液,先加入1ml缓冲液,混匀后在37℃保温1min,然后加入500μl反应液R2,混匀后在37℃保温3min,得到混合液S2,测定所述混合液S2在波长340nm处的吸光度A2;
(a3)A1/A2<1,说明缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
实施例3
本实施例提供一种检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒,原料组分包括:
反应液R1:0.52mmol/L葡萄糖-6-磷酸钠水溶液80μl、0.00690mol/L硝基四氮唑蓝水溶液94μl、0.004469mol/L吩嗪二甲酯硫酸钠水溶液40μl;
反应液R2:0.45mmol/L6-磷酸葡萄糖酸钠水溶液80μl、0.00690mol/L硝基四氮唑蓝水溶液94μl、0.004469mol/L吩嗪二甲酯硫酸钠水溶液40μl;
缓冲液:0.780mmol/L氧化型辅酶II水溶液1.5ml、0.0710mmol/L氯化镁水溶液1.5ml和0.55mmol/L三羟甲基氨基甲烷水溶液3ml。
进一步,提供一种制备所述检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒的方法,包括如下步骤:
(b1)向15μl抗凝全血中加入200μl双蒸水,混匀后,得到溶血液;
(b2)取50μl步骤(b1)所述溶血液,先加入50μl反应液R1,混匀后在37℃保温15min,然后加入2ml缓冲液,混匀后,得到混合液L1,测定所述混合液L1在650nm处的吸光度A1';另取50μl步骤(b1)所述溶血液,先加入50μl反应液R2,混匀后在37℃保温15min,然后加入2ml缓冲液,混匀后,得到混合液L2,测定所述混合液L2在650nm处的吸光度A2';
(b3)A1'/A2'>1,说明不缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
实施例4
本实施例提供一种检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒,原料组分包括:
反应液R1:1.25mmol/L葡萄糖-6-磷酸钠水溶液80μl、0.0207mol/L硝基四氮唑蓝水溶液94μl、0.01338mol/L吩嗪二甲酯硫酸钠水溶液40μl;
反应液R2:1.05mmol/L6-磷酸葡萄糖酸钠水溶液80μl、0.0207mol/L硝基四氮唑蓝水溶液94μl、0.01338mol/L吩嗪二甲酯硫酸钠水溶液40μl;
缓冲液:0.780mmol/L氧化型辅酶II水溶液1.5ml、0.0710mmol/L氯化镁水溶液1.5ml和0.55mmol/L三羟甲基氨基甲烷水溶液3ml。
进一步,提供一种制备所述检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒的方法,包括如下步骤:
(b1)向15μl抗凝全血中加入250μl双蒸水,混匀后,得到溶血液;
(b2)取50μl步骤(b1)所述溶血液,先加入50μl反应液R1,混匀后在37℃保温20min,然后加入2ml缓冲液,混匀后,得到混合液L1,测定所述混合液L1在650nm处的吸光度A1';另取50μl步骤(b1)所述溶血液,先加入50μl反应液R2,混匀后在37℃保温20min,然后加入2ml缓冲液,混匀后,得到混合液L2,测定所述混合液L2在650nm处的吸光度A2';
(b3)A1'/A2'<1,说明缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
实施例5
本实施例提供一种检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒,原料组分包括:
反应液R1:0.86mmol/L葡萄糖-6-磷酸钠水溶液80μl、0.0207mol/L硝基四氮唑蓝水溶液94μl、0.01338mol/L吩嗪二甲酯硫酸钠水溶液40μl;
反应液R2:0.75mmol/L6-磷酸葡萄糖酸钠水溶液80μl、0.0207mol/L硝基四氮唑蓝水溶液94μl、0.01338mol/L吩嗪二甲酯硫酸钠水溶液40μl;
缓冲液:0.780mmol/L氧化型辅酶II水溶液1.5ml、0.0710mmol/L氯化镁水溶液1.5ml和0.55mmol/L三羟甲基氨基甲烷水溶液3ml。
进一步,提供一种制备所述检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒的方法,包括如下步骤:
(b1)向15μl抗凝全血中加入200μl双蒸水,混匀后,得到溶血液;
(b2)取50μl步骤(b1)所述溶血液,先加入50μl反应液R1,混匀后在37℃保温20min,然后加入2ml缓冲液,混匀后,得到混合液L1,测定所述混合液L1在650nm处的吸光度A1';另取50μl步骤(b1)所述溶血液,先加入50μl反应液R2,混匀后在37℃保温20min,然后加入2ml缓冲液,混匀后,得到混合液L2,测定所述混合液L2在650nm处的吸光度A2';
(b3)A1'/A2'<1,说明缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒,其特征在于,原料组分包括反应液R1、反应液R2和缓冲液;
所述反应液R1为葡萄糖-6-磷酸盐水溶液;
所述反应液R2为6-磷酸葡萄糖酸盐水溶液;
所述缓冲液为氧化型辅酶II、镁离子和三羟甲基氨基甲烷的混合水溶液,所述混合水溶液中氧化型辅酶II、镁离子和三羟甲基氨基甲烷的摩尔比为(0.13-1.17):(0.012-0.1065):(0.25-1.65)。
2.根据权利要求1所述的检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂盒,其特征在于,所述反应液R1还添加硝基四氮唑蓝和吩嗪二甲酯硫酸盐,所述反应液R1中,硝基四氮唑蓝的浓度为0.00690-0.0207mol/L,吩嗪二甲酯硫酸盐的浓度为0.004469-0.01338mol/L;所述反应液R2还添加硝基四氮唑蓝和吩嗪二甲酯硫酸盐,所述反应液R2中,硝基四氮唑蓝的浓度为0.00690-0.0207mol/L,吩嗪二甲酯硫酸盐的浓度为0.004469-0.01338mol/L。
3.一种应用权利要求1所述的试剂盒检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(a1)取待测人抗凝全血,加入双蒸水,混匀后,等分得到两份溶血液;
(a2)取一份步骤(a1)所述溶血液,先加入缓冲液,混匀后进行第一次保温,然后加入反应液R1,混匀后进行第二次保温,得到混合液S1,测定所述混合液S1的吸光度得到吸光度A1;取另一份步骤(a1)所述溶血液,先加入缓冲液,混匀后进行第一次保温,然后加入反应液R2,混匀后进行第二次保温,得到混合液S2,测定所述混合液S2的吸光度得到吸光度A2;
(a3)计算A1和A2的比值,以判断是否缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
4.一种应用权利要求2所述的试剂盒检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(b1)取待测人抗凝全血,加入双蒸水,混匀后,等分得到两份溶血液;
(b2)取一份步骤(b1)所述溶血液,先加入反应液R1,混匀后进行保温,然后加入缓冲液,混匀后,得到混合液L1,测定所述混合液L1的吸光度得到吸光度A1';取另一份步骤(b1)所述溶血液,先加入反应液R2,混匀后进行保温,然后加入缓冲液,混匀后,得到混合液L2,测定所述混合液L2的吸光度得到吸光度A2';
(b3)计算A1'和A2'的比值,以判断是否缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
5.根据权利要求3所述的检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法,其特征在于,步骤(a1)中,所述双蒸水与所述抗凝全血的体积比为20:1-30:1。
6.根据权利要求3所述的检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法,其特征在于,步骤(a2)中,所述混合液S1中的溶血液、缓冲液以及反应液R1的体积比为1:20:10;所述混合液S2中的溶血液、缓冲液以及反应液R2的体积比为1:20:10。
7.根据权利要求3所述的检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法,其特征在于,步骤(a2)中,进行所述第一次保温的温度为37℃,进行所述第一次保温的时间为1-3min;进行所述第二次保温的温度为37℃,进行所述第二次保温的时间为3-7min;
步骤(a2)中,所述吸光度均为波长340nm处的吸光度。
8.根据权利要求4所述的检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法,其特征在于,步骤(b1)中,所述双蒸水与所述抗凝全血的体积比为40:3-50:3。
9.根据权利要求4所述的检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法,其特征在于,步骤(b2)中,所述混合液L1中的溶血液、反应液R1以及缓冲液的体积比为1:1:40;所述混合液L2中的溶血液、反应液R2以及缓冲液的体积比为1:1:40。
10.根据权利要求4所述的检测红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的方法,其特征在于,步骤(b2)中,所述保温的温度均为37℃,所述保温的时间均为15-20min;
步骤(b2)中,所述吸光度均为波长650nm处的吸光度。
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