CN108893418A - 一种沼泽红假单胞菌ly-6菌剂及制备及其对番茄白绢病防治的应用 - Google Patents

一种沼泽红假单胞菌ly-6菌剂及制备及其对番茄白绢病防治的应用 Download PDF

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Abstract

一种沼泽红假单胞菌LY‑6菌剂及制备及其对番茄白绢病防治的应用，所述沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌，所述沼泽红假单胞菌菌剂由沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备得到，本发明的沼泽红假单胞菌的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到番茄白绢病防控的生防菌剂及生防发酵液；沼泽红假单胞菌制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性。

Description

一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂及制备及其对番茄白绢病防治 的应用
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，特别涉及一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂的制备及其对番茄白绢病防治的应用。
背景技术
微生物广泛存在于自然界中，因其在防治植物病虫害过程中表现出无毒、无害、无污染、高效和不易产生抗药性等优点，成为研究的热点。光合细菌(PhotosyntheticBacteria， PBS)是能在厌氧条件下进行不放氧气的光合作用的一类细菌的总称，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物。已知的光合细菌共有绿硫细菌科(Chlorobiaceae)、红硫细菌科(Chromatiaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)3个科。沼泽红假单胞菌 (Rhodopseudanonas palustris)属于红螺菌科、红假单胞菌属。光合细菌能对植物病原细菌、真菌、线虫进行有效防治。光合细菌菌剂在芝麻上对芝麻枯萎病、茎点枯病、叶病具有一定的防治效果；用菌液喷施烟草，能提高烟草抵御病毒感染的能力；光合细菌球形红假单胞菌P4培养物能分别诱导苋色藜和蚕豆增强对石竹斑驳病毒(CarMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的抗感染能力；光合细菌红假单胞菌06-5的菌体与发酵上清液均在生物测定试验中能抑制稻曲病菌。目前随着光合细菌的深入研究，其被广泛应用于农畜业、饲料、环保、食品加工、生物能源和医药保健等领域。
番茄白绢病主要为害茎基部或根部，病部初呈暗褐色水漫状斑，主要为害茎基部或根部。病部初呈暗褐色水浸状斑，表面生白色绢丝状菌丝体，集结成束，向茎上部延伸，致植株叶色变淡，菌丝自病茎基部向四周地面呈辐射状扩展，侵染与地面接触的果实，致病果软腐，表面产出白色绢丝状物，后菌丝形成菜籽状的深褐色菌核，致茎部皮层腐烂，露出木质部，或在腐烂部上方长出菌丝，终致全株萎蔫枯死。
目前防治番茄白绢病的方法主要是：(1)轮作：发病重的菜地应与禾本科作物轮作，有条件的可行水旱轮作效果更好。(2)深耕土壤：深耕可将表层土壤中的病菌翻入深土层，病菌菌核在深土层中难以萌发。因此，深翻土壤可有效地防止番茄白绢病的危害，同时还有利于根系生长。(3)施用充分腐熟的有机肥，适当追施硫酸铵、尿素、硝酸钙等含氮肥料，提高土壤中N 的含量，以抑制白绢病核的萌发。(4)调节土壤酸碱度：整地时，结合整地亩施消石灰100‐150kg，使土壤呈中性至微碱性，在田间病株上的菌核形成前，拔除病株，在病穴处撒上消石灰消毒。(5)药剂防治。发病初期可用20％的甲基立枯灵800倍液灌根或按1：50‐100的比例拌细土撒在病部根茎处，或用50％的五氯硝基苯800倍液灌根。上述防治番茄白绢病的方法过程长、见效慢、实施不简便，易对环境造成污染，长期使用农药，会使防治效果降低和产生抗药性。因此发明一种无毒、无污染、高效不易产生抗性的菌剂对防治番茄白绢病有将有重大的社会和经济意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂及制备及其对番茄白绢病防治的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种沼泽红假单胞菌LY-6 菌剂，所述沼泽红假单胞菌LY-6菌剂由沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备得到。沼泽红假单胞菌LY-6，分类命名为“沼泽红假单胞菌LY-6 Rhodopseudomonas PalustrisLY-6”，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M2014525。保藏日期为：2014年10月29日。
一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：活化：将沼泽红假单胞菌菌株的保存菌种按双层平板培养法进行培养，直至红色单菌落出现，采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：(NH4)2SO4 1.6-1.8g/L、NaCO3 0.8-1.0g/L、酵母膏1.2-1.5g/L、K2HPO4 0.2-0.4g/L、MgSO4 0.3-0.6g/L、琼脂粉18-20g/L，pH＝7.0；
步骤二：种子培养：将步骤一中培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以沼泽红假单胞菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液，种子培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0；
步骤三：生产培养：将步骤二种子培养后得到的菌液按沼泽红假单胞菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以沼泽红假单胞菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂，生产培养的温度为 30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0，培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂；
步骤四：离心：将步骤三中获得的沼泽红假单胞菌的生防菌剂投入到高速离心机中，离心的转速为7500-8000rpm，离心温度为4-6℃，离心时间为 10-15mins，经过离心后收集上清液，将上清液用细菌过滤器进行过滤，后制得沼泽红假单胞菌生防发酵液，制得的生防发酵液放置在2-4℃的情况下保存备用。
优选的，所述步骤二中光合细菌液体培养基的配方为：(NH4)2SO4 1.7-1.9g/L、NaCO3 0.8-1.2g/L、酵母膏1.2-1.6g/L、K2HPO4 0.3-0.5g/L、 MgSO4 0.5-0.7g/L。
优选的，所述步骤一中的沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌LY-6。
优选的，所述沼泽红假单胞菌生防菌剂应用于拮抗齐整小核菌或防控番茄白绢病。
本发明的技术效果和优点：
1.本发明的沼泽红假单胞菌的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到番茄白绢病防控的生防菌剂及生防发酵液；
2.本发明的沼泽红假单胞菌制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂，沼泽红假单胞菌菌剂由沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备得到。
一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：活化：将沼泽红假单胞菌菌株的保存菌种按双层平板培养法进行培养，直至红色单菌落出现，采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：(NH4)2SO4 1.6g/L、NaCO3 0.8g/L、酵母膏1.2g/L、K2HPO4 0.2g/L、MgSO4 0.3g/L、琼脂粉18g/L，pH＝7.0；
步骤二：种子培养：将步骤一中培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以沼泽红假单胞菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液，种子培养的温度为30℃，光照条件为2500Lx，pH为7.0；
步骤三：生产培养：将步骤二种子培养后得到的菌液按沼泽红假单胞菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以沼泽红假单胞菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂，生产培养的温度为 30℃，光照条件为2500Lx，pH为7.0，培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂；
步骤四：离心：将步骤三中获得的沼泽红假单胞菌的生防菌剂投入到高速离心机中，离心的转速为7500rpm，离心温度为4℃，离心时间为10mins，经过离心后收集上清液，将上清液用细菌过滤器进行过滤，后制得沼泽红假单胞菌生防发酵液，制得的生防发酵液放置在2℃的情况下保存备用。
步骤二中光合细菌液体培养基的配方为：(NH4)2SO4 1.7g/L、NaCO3 0.8g/L、酵母膏1.2g/L、K2HPO4 0.3g/L、MgSO4 0.5g/L；
步骤一中的沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌LY-6；
沼泽红假单胞菌生防菌剂应用于拮抗齐整小核菌或防控番茄白绢病；
本发明涉及到的菌株经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为沼泽红假单胞菌。主要生物学特征有：该菌株在双层固体平板培养基上培养4d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm；液体培养基中培养7d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30℃， pH＝7；
沼泽红假单胞菌LY-6生防发酵液在拮抗齐整小核菌中的应用，具体的应用方法为：
番茄齐整小核菌丝平板测定试验：以齐整小核菌为靶标，采用平板法做抑菌试验。将沼泽红假单胞菌生防发酵液与45℃熔融态的5×PDA培养基(马铃薯200g切块加水煮沸20分钟后用八层纱布过滤取汁，葡萄糖20g、琼脂 15g，加水至1000mL)按1:1混合，并以光合细菌培养基及甲基托布津为对照，接入培养4d的番茄白绢病病原菌，28℃培养，重复4次，28℃培养3d后计算沼泽红假单胞菌生防发酵液对白绢病菌的抑制率为76.7％。
抑制率＝(菌落直径对照菌落-菌落直径蛋白处理)/菌落直径对照菌落×100％。
沼泽红假单胞菌生防发酵液处理对白绢病菌后，菌丝生长速度比对照慢，且菌丝稀疏，菌核量明显减少。
实施例二
一种沼泽红假单胞菌菌剂，沼泽红假单胞菌菌剂由沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备得到。
一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：活化：将沼泽红假单胞菌菌株的保存菌种按双层平板培养法进行培养，直至红色单菌落出现，采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：(NH4)2SO4 1.7g/L、NaCO3 0.9g/L、酵母膏1.3g/L、K2HPO4 0.3g/L、MgSO4 0.5g/L、琼脂粉19g/L，pH＝7.0；
步骤二：种子培养：将步骤一中培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以沼泽红假单胞菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液，种子培养的温度为31℃，光照条件为3200Lx，pH为7.0；
步骤三：生产培养：将步骤二种子培养后得到的菌液按沼泽红假单胞菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以沼泽红假单胞菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂，生产培养的温度为 31℃，光照条件为3500Lx，pH为7.0，培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂；
步骤四：离心：将步骤三中获得的沼泽红假单胞菌的生防菌剂投入到高速离心机中，离心的转速为7800rpm，离心温度为5℃，离心时间为12mins，经过离心后收集上清液，将上清液用细菌过滤器进行过滤，后制得沼泽红假单胞菌生防发酵液，制得的生防发酵液放置在3℃的情况下保存备用。
步骤二中光合细菌液体培养基的配方为：(NH4)2SO4 1.8g/L、NaCO3 1.0g/L、酵母膏1.4g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO4 0.6g/L；
步骤一中的沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌LY-6；
沼泽红假单胞菌生防菌剂应用于拮抗齐整小核菌或防控番茄白绢病；
本发明涉及到的菌株经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为沼泽红假单胞菌。主要生物学特征有：该菌株在双层固体平板培养基上培养6d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.4mm；液体培养基中培养7d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度31℃， pH＝7；
沼泽红假单胞菌生防发酵液在拮抗齐整小核菌中的应用，具体的应用方法为：
番茄齐整小核菌丝平板测定试验：以齐整小核菌为靶标，采用平板法做抑菌试验。将沼泽红假单胞菌生防发酵液与48℃熔融态的5×PDA培养基(马铃薯200g切块加水煮沸25分钟后用八层纱布过滤取汁，葡萄糖20g、琼脂 18g，加水至1000mL)按1:1混合，并以光合细菌培养基及甲基托布津为对照，接入培养4d的番茄白绢病病原菌，28℃培养，重复5次，28℃培养3d后计算沼泽红假单胞菌生防发酵液对白绢病菌的抑制率为76.7％。
抑制率＝(菌落直径对照菌落-菌落直径蛋白处理)/菌落直径对照菌落×100％。
沼泽红假单胞菌生防发酵液处理对白绢病菌后，菌丝生长速度比对照慢，且菌丝稀疏，菌核数明显减少。
实施例三
一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂，沼泽红假单胞菌菌剂由沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备得到。
一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：活化：将沼泽红假单胞菌菌株的保存菌种按双层平板培养法进行培养，直至红色单菌落出现，采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：(NH4)2SO4 1.8g/L、NaCO3 1.0g/L、酵母膏1.5g/L、K2HPO4 0.4g/L、MgSO4 0.6g/L、琼脂粉20g/L，pH＝7.0；
步骤二：种子培养：将步骤一中培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以沼泽红假单胞菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液，种子培养的温度为32℃，光照条件为4000Lx，pH为7.0；
步骤三：生产培养：将步骤二种子培养后得到的菌液按沼泽红假单胞菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以沼泽红假单胞菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂，生产培养的温度为 32℃，光照条件为4000Lx，pH为7.0，培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂；
步骤四：离心：将步骤三中获得的沼泽红假单胞菌的生防菌剂投入到高速离心机中，离心的转速为8000rpm，离心温度为6℃，离心时间为15mins，经过离心后收集上清液，将上清液用细菌过滤器进行过滤，后制得沼泽红假单胞菌生防发酵液，制得的生防发酵液放置在4℃的情况下保存备用。
步骤二中光合细菌液体培养基的配方为：(NH4)2SO4 1.9g/L、NaCO3 1.2g/L、酵母膏1.6g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4 0.7g/L；
步骤一中的沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌LY-6；
沼泽红假单胞菌生防菌剂应用于拮抗齐整小核菌或防控番茄白绢病；
本发明涉及到的菌株经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为沼泽红假单胞菌。主要生物学特征有：该菌株在双层固体平板培养基上培养8d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.60mm；液体培养基中培养7d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度32℃， pH＝7；
沼泽红假单胞菌生防发酵液在拮抗齐整小核菌中的应用，具体的应用方法为：
番茄齐整小核菌丝平板测定试验：以齐整小核菌为靶标，采用平板法做抑菌试验，将沼泽红假单胞菌生防发酵液与50℃熔融态的5×PDA培养基(马铃薯200g切块加水煮沸30分钟后用八层纱布过滤取汁，葡萄糖20g、琼脂 20g，加水至1000mL)按1:1混合，并以光合细菌培养基及甲基托布津为对照，接入培养4d的番茄白绢病病原菌，28℃培养，重复6次，28℃培养3d后计算沼泽红假单胞菌生防发酵液对白绢病菌的抑制率。
抑制率＝(菌落直径对照菌落-菌落直径蛋白处理)/菌落直径对照菌落×100％。
沼泽红假单胞菌生防发酵液处理对白绢病菌后，菌丝生长速度比对照慢，且菌丝稀疏。
通过以上三组实施例均可以制得沼泽红假单胞菌菌剂，本发明的沼泽红假单胞菌的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到番茄白绢病防控的生防菌剂及生防发酵液；本发明的沼泽红假单胞菌制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种沼泽红假单胞菌LY-6菌剂，其特征在于：所述沼泽红假单胞菌菌剂由沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养制备得到。
2.一种如权利要求1所述的沼泽红假单胞菌LY-6菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：活化：将沼泽红假单胞菌菌株的保存菌种按双层平板培养法进行培养，直至红色单菌落出现，采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：(NH4)2SO4 1.6-1.8g/L、NaCO3 0.8-1.0g/L、酵母膏1.2-1.5g/L、K2HPO4 0.2-0.4g/L、MgSO4 0.3-0.6g/L、琼脂粉18-20g/L，pH＝7.0；
步骤二：种子培养：将步骤一中培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以沼泽红假单胞菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液，种子培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0；
步骤三：生产培养：将步骤二种子培养后得到的菌液按沼泽红假单胞菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以沼泽红假单胞菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂，生产培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0，培养至对数生长期即制得沼泽红假单胞菌生防菌剂；
步骤四：离心：将步骤三中获得的沼泽红假单胞菌的生防菌剂投入到高速离心机中，离心的转速为7500-8000rpm，离心温度为4-6℃，离心时间为10-15mins，经过离心后收集上清液，将上清液用细菌过滤器进行过滤，后制得沼泽红假单胞菌生防发酵液，制得的生防发酵液放置在2-4℃的情况下保存备用。
3.一种如权利要求2所述的沼泽红假单胞菌LY-6菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤二中光合细菌液体培养基的配方为：(NH4)2SO4 1.7-1.9g/L、NaCO3 0.8-1.2g/L、酵母膏1.2-1.6g/L、K2HPO4 0.3-0.5g/L、MgSO4 0.5-0.7g/L。
4.一种如权利要求2所述的沼泽红假单胞菌LY-6菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤一中的沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌PSB17-1。
5.一种权利要求1所述的沼泽红假单胞菌LY-6菌剂或权利要求4-6中任一所述制备方法制得的沼泽红假单胞菌LY-6菌剂的应用，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌LY-6菌剂应用于拮抗齐整小核菌或防控番茄白绢病。
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