CN108888614A - 二氢姜黄素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途 - Google Patents

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刘亚云
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Abstract

本发明公开了二氢姜黄素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途。体外细胞实验结果表明：(1)二氢姜黄素通过降低肝细胞内SREBP‑1C和PNPLA3mRNA和蛋白表达，增加PPARa mRNA和蛋白的表达，降低肝细胞内TG含量，改善肝脂代谢。(2)二氢姜黄素增加了肝细胞内PI3K/AKT的表达，提高了肝细胞对葡萄糖的摄取能力从而增强了胰岛素敏感性。(3)二氢姜黄素通过提高肝细胞内Nrf2蛋白的表达，降低CYP4A的表达，降低ROS含量从而改善氧化应激。(4)二氢姜黄素通过降低肝细胞内NO的含量减缓炎症反应。因此是一种可用于治疗非酒精性脂肪肝的优良候选药物。

Description

二氢姜黄素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途
技术领域
本发明属于制药领域，涉及二氢姜黄素的新用途，尤其是在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的新用途。
背景技术
非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指由非酒精和其它不明确的损肝因素所导致的综合征，主要临床特征是肝细胞呈弥散性,伴随有大泡状脂肪病变，包含单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎和肝硬化三个阶段。NAFLD通常与肥胖和高血糖症有关，并伴有高甘油三酯、高血压和高胆固醇。
由于NAFLD的发病机制比较复杂，病因尚不明确，目前没有确切的特效药，控制饮食、纠正不良生活作息、加强体育锻炼控制体重是控制NAFLD最好的方法。在过去的几十年以来，包括减少脂质积累，胰岛素增敏剂，抗氧化物质，减少炎症因子释放的药物被应用于临床治疗NAFLD。但是这些药物有潜在的副作用，比如胰岛素增敏剂吡格列酮有体重增加、水肿、心力衰竭和骨密度降低等副作用，抗氧化剂维生素E会增加健康男性患前列腺癌的风险。因此，目前没有完全对症的的药物用来治疗NAFLD，故研究相关治疗药物具有重大的现实意义。
姜黄素是从姜黄植物的根茎中提取的一种多酚类化合物，它被报道有预防糖尿病和改善肥胖症的功效，二氢姜黄素(Dihydrocurcumin，本文中简称DHC)是姜黄素的代谢产物，分子式C21H21NO5。目前对二氢姜黄素的药理活性研究很少，尚没有发现其治疗NAFLD的报导。
发明内容
本发明的目的是提供二氢姜黄素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的新用途。
申请人将HepG2细胞和L02细胞在油酸诱导下建立NAFLD的体外模型，研究DHC对NAFLD的作用效果，进而验证了DHC对NAFLD的治疗作用。
主要从四个方面展开研究：
(1)DHC对NAFLD模型细胞肝脂代谢紊乱的调控作用
肝脏脂质的积累在NAFLD中是一个显著特征，脂肪酸的代谢之间失去平衡导致脂质过多，其中SREBP-1C是脂质代谢过程中的关键因子；PPARa在肝脏中含量较多具有减少三酰甘油的作用，PPARa的表达增加能减少脂质的积累能降低肝脏的损害；PNPLA3在糖脂代谢中起重要作用。
(2)DHC对NAFLD模型细胞胰岛素抵抗的调控作用
肝脏中脂质的积累过多会引发胰岛素抵抗，胰岛素抵抗会导致肝脏脂肪发生变性，产生大量的炎症细胞因子，引发脂质毒性，产生氧化应激，导致炎症反应。PI3K通路调节细胞代谢，影响细胞生长，改变细胞存活率，而AKT又是PI3K的下游基因，PI3K/AKT途径可以调节肝脏胰岛素敏感性，通过增加胰岛素敏感性来促进肝细胞对葡萄糖的摄取能力，抑制NAFLD的发展。
(3)DHC对NAFLD模型细胞氧化应激损伤的调控作用
游离脂肪酸的积累过多可能导致活性氧(ROS)产生。氧化应激被证实在NAFLD的发病进程中扮演重要角色，它在细胞水平造成一定的损伤，比如细胞膜脂质过氧化，细胞死亡。Nrf2的表达上调能增强肝细胞的抗氧化能力。CYP2E1和CYP4A是脂质过氧化中的关键酶，其蛋白的过表达会引发氧化损伤。
(4)DHC对NAFLD模型细胞炎症反应的调控作用
硝化应激存在于NAFLD的发病进程中，NO是硝化应激的关键指标，其含量会升高在NAFLD中，与肝细胞的炎症反及氧化损伤密切相关。
结果表明：
(1)在肝脂代谢方面：DHC通过降低肝细胞内SREBP-1C和PNPLA3mRNA和蛋白表达，增加PPARa mRNA和蛋白的表达，降低肝细胞内TG含量，改善肝脂代谢。
(2)在胰岛素抵抗方面：DHC增加了肝细胞内PI3K/AKT的表达，提高了肝细胞对葡萄糖的摄取能力从而增强了胰岛素敏感性。
(3)在氧化应激方面：DHC通过提高肝细胞内Nrf2蛋白的表达，降低CYP4A的表达，降低ROS含量从而改善氧化应激。
(4)在炎症反应方面：DHC通过降低肝细胞内NO的含量减缓炎症反应。
因此，DHC可用于改善肝细胞脂代谢，降低肝细胞氧化应激损伤，增强肝细胞对胰岛素敏感性，减缓肝细胞炎症反应，是一种可用于治疗非酒精性脂肪肝的优良候选药物。
附图说明
图1：DHC对HepG2和L02细胞内TG含量的影响。
图2：DHC对HepG2和L02细胞内2-NBDG含量的影响。
图3：DHC对HepG2和L02细胞内PI3K，pAKT，AKT蛋白的表达影响。
图4：DHC对HepG2和L02细胞内ROS含量的影响。
图5：DHC对HepG2和L02细胞内NO含量的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
表1名词术语及相关解释：
TG 三酰甘油
NO 一氧化氮
ROS 活性氧
SREBP-1C 固醇调节元件结合蛋白1c
PNPLA3 Patatin样磷脂酶结构域蛋3
PPARɑ 过氧化物酶体增殖物激活受体ɑ
PI3K 胞内磷脂酰肌醇激酶
AKT 蛋白激酶B
Nrf2 核转录因子Nrf2
CYP4A 细胞色素4A
CYP2E1 细胞色素P450 2E1
HepG2细胞 人肝癌细胞系HepG2
L02细胞 人正常肝细胞系L02
实施例：
首先采用MTT实验确定给药剂量。MTT实验结果表明，0-20μM DHC对HepG2细胞增值没有明显影响，在50-100μM时有显著抑制作用。0-50μM DHC对L02细胞活性没有明显影响，在100μM时有显著抑制作用。后面的实验选取DHC的给药浓度为：作用于HepG2细胞时，给药浓度：5μM，10μM，20μM；作用于L02细胞时，给药浓度：5μM，20μM，50μM。作用时间均为24h。
1.DHC对HepG2和L02细胞内TG的影响
不同浓度的DHC处理HepG2和L02细胞24h，采用TG试剂盒检测细胞中TG相对含量，结果如图1所示。
结果显示：油酸处理后的模型组与正常组相比显著增加了细胞内TG的含量(p<0.01)，DHC在这两种细胞中呈剂量依赖性地降低了TG的含量，并且在HepG2细胞中10μM和20μM时具有显著性(p<0.05)，在L02细胞中50μM时具有显著性(p<0.05)。
2.DHC对HepG2和L02细胞脂代谢基因表达的影响
不同浓度的DHC处理HepG2和L02细胞24h，用实时荧光定量PCR检测PPARα，PNPLA3和SREBP-1C mRNA表达水平。
结果表明：相比空白组，OA组降低了PPARαmRNA的含量，增加了PNPLA3和SREBP-1CmRNA的含量，降低了PPARαmRNA与SREBP-1C mRNA的比值(p<0.05)。细胞经DHC处理24h之后，PNPLA3mRNA和SREBP-1C mRNA的含量降低，PPARαmRNA的含量升高，PPARαmRNA与SREBP-1CmRNA的比值增加(p<0.05)。
3.DHC对HepG2和L02细胞内2-NBDG含量的影响
不同浓度的DHC处理HepG2和L02细胞24h，NO试剂盒检测细胞中ROS相对含量，结果如图2所示。
结果显示：对于HepG2和L02细胞细胞，相比空白组，油酸处理后均降低了细胞内2-NBDG含量，DHC处理之后呈剂量依赖性增加了细胞2-NBDG含量。
4.DHC对HepG2和L02细胞内PI3K，pAKT和AKT蛋白表达的影响
不同浓度的DHC处理细胞24h，利用Wenstern blotting实验检测PI3K，pAKT，AKT蛋白表达，结果如图3所示。
结果表明，OA诱导之后的模型组PI3K、pAKT蛋白表达水平均低于空白组(p<0.05)，DHC处理后促进了PI3K，pAKT蛋白表达，改善了细胞的胰岛素抵抗能力。
5.DHC对HepG2和L02细胞内ROS的影响
不同浓度的DHC处理HepG2和L02细胞，检测细胞中ROS相对含量，结果如图4所示。
结果表明：对于HepG2细胞，OA处理后，相比空白组，细胞内ROS含量增加(p<0.05)，DHC处理之后，相比OA处理组，细胞内ROS含量呈剂量依赖性增加。对于L02细胞，相比空白组，OA处理增加了细胞内ROS含量(p<0.05)，DHC处理之后呈剂量依赖性降低了细胞ROS含量。
6.DHC对HepG2和L02细胞CYP4A，CYP2E1，Nrf2蛋白表达的影响
不同浓度的DHC处理HepG2和L02细胞，利用Wenstern blotting实验检测CYP4A，CYP2E1，Nrf2蛋白表达。
结果表明：细胞经过油酸诱导之后，蛋白CYP2E1和CYP4A的蛋白表达水平明显高于空白组(P<0.05)，DHC处理后，在HepG2细胞和L02细胞中CYP2E1蛋白的表达水平没有发生明显改变。但是经过OA诱导的细胞，DHC处理后CYP4A蛋白的表达水平呈剂量依赖性下降。
另一方面，与空白组相比，OA处理降低了Nrf2蛋白的表达水平，在HepG2细胞和L02细胞中，DHC处理细胞后，Nrf2蛋白表达水平均呈剂量依赖性增加。
7.DHC对HepG2和L02细胞内NO含量的影响
不同浓度的DHC处理HepG2和L02细胞，NO试剂盒检测细胞中NO相对含量，结果如图5所示。
结果显示NO的含量在OA诱导后的细胞中显著高于空白组(P<0.01)，经过DHC处理后，相比OA处理组，NO的含量呈剂量依赖性降低(与油酸诱导组相比P<0.05)。
结论：
(1)在肝脂代谢方面：DHC通过降低肝细胞内SREBP-1C和PNPLA3mRNA和蛋白表达，增加PPARa mRNA和蛋白的表达，降低肝细胞内TG含量，改善肝脂代谢；
(2)在胰岛素抵抗方面：DHC增加了肝细胞内PI3K/AKT的表达，通过检测肝细胞内2-NBDG的含量评价肝细胞对葡萄糖的摄取能力，结果表明DHC提高了肝细胞对葡萄糖的摄取能力从而增强了胰岛素敏感性；
(3)在氧化应激方面：DHC通过提高肝细胞内Nrf2蛋白的表达，降低CYP4A的表达，降低ROS含量从而改善氧化应激；
(4)在炎症反应方面：DHC通过降低肝细胞内NO的含量减缓炎症反应。

Claims (2)

1.二氢姜黄素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：二氢姜黄素用于改善肝细胞脂代谢，降低肝细胞氧化应激损伤，增强肝细胞对胰岛素敏感性，减缓肝细胞炎症反应。
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CN113679840A (zh) * 2020-05-19 2021-11-23 上海市同济医院 一种磷脂酶d1(pld1)基因及其抑制剂在治疗非酒精性脂肪肝病中的应用

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