CN108887553B - 枯草芽孢杆菌作为防霉剂在饲料中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌作为防霉剂在饲料中的应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BSh0851，其应用方法是按饲料总重2.7%的比例称取发酵培养后喷雾干燥制得的菌粉，将其溶解于生理盐水中，再喷洒于饲料表面。该方法防霉效果显著，能够有效延长饲料的保存期。在此处理方法下，对于水分含量12%的饲料，其保藏期可达到6个月以上。

Description

枯草芽孢杆菌作为防霉剂在饲料中的应用
技术领域
本发明属于饲料防霉保鲜技术，具体涉及一种枯草芽孢杆菌作为防霉剂在饲料中的应用。
背景技术
霉菌是危害饲料的主要生物性污染源。饲料在贮藏、运输及使用过程中，由于高温多湿的环境，极易污染霉菌，从而导致饲料污染霉菌毒素，营养价值降低，适口性变差。畜禽食用霉变饲料会引起腹泻、肠炎从而消化能力降低，甚至造成大面积中毒死亡。
为了防止饲料霉变，在饲料中添加防霉剂是最经济有效的方法，目前市场上应用最广是化学防霉剂，如丙酸及其盐类、苯甲酸及其盐类等，但化学防霉剂由于可能有刺激性气味和腐蚀性而会影响饲料适口性、也容易造成药物残留，不符合当今及未来对绿色食品的消费需求。所以，寻找一种无毒无害、高效广谱、成本低廉的生物饲料保鲜剂是目前国内市场急需解决的主要问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌作为防霉剂在饲料中的应用，从而为饲料，特别是含水量稍高的鱼饲料的防霉保鲜提供新的途径。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌作为防霉剂在饲料中的应用，该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtulis）BSh0851，其于2009年12月13日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3502。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为革兰氏阳性菌，芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，常形成皱醭；需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，V-P阳性。
所述枯草芽孢杆菌在作为饲料防霉剂中的具体应用方法为：将饲料总重2.7%的枯草芽孢杆菌菌粉溶于生理盐水中，然后将其均匀喷洒于饲料表面，并控制饲料含水率为10%-12%，再将饲料于28℃密封储藏。
其中，所述枯草芽孢杆菌菌粉的制备方法包括如下步骤：
（1）种子液的制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃、200r·min-1培养24h，得种子液；所述种子培养基的配方为：牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL，pH7.0；
（2）发酵液培养基的制备：将酵母浸膏14g、无水葡萄糖14g、MgSO4 1g、蒸馏水1000mL配成发酵液培养基，调节pH至7.2-7.4后进行分装，装液量为40%（v/v），灭菌备用；
（3）枯草芽孢杆菌发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为5%（v/v）；然后于37℃、200r·min-1条件下培养24h，得发酵液；
（4）菌粉的制备：将步骤（3）所得发酵液以5000r·min-1离心15min，去除上清液后加入等体积生理盐水，通过旋涡震荡制成菌悬液，再加入15%（v/v）的阿拉伯胶作为保护剂，在入口温度150℃、进料速率500mL/h的条件下喷雾干燥，得活菌数为1.0×108cfu/g的菌粉，于4℃条件下保存备用。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明提供的枯草芽孢杆菌对饲料中常见的丝状真菌具有生长拮抗作用，从而可对鱼饲料霉变起到很好的抑制效果。
（2）本发明通过将枯草芽孢杆菌直接喷洒于饲料表面，以延长饲料的保质期，其方法简便、成本低廉、效果持久且对饲料无副作用。在此处理方法下，对水分含量12%的饲料，其保藏期可达到6个月以上。
（3）本发明方法应用于饲料防霉中无毒无害，安全高效。
具体实施方式
一种枯草芽孢杆菌作为防霉剂在饲料中的应用，即将饲料总重2.7%的枯草芽孢杆菌菌粉溶于生理盐水中，然后将其均匀喷洒于饲料表面，并控制饲料含水率为10%-12%，再将饲料于28℃密封储藏。所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtulis）BSh0851，其于2009年12月13日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3502。
取蜜蜂肠道不同时期获得的6株枯草芽孢杆菌菌株BSh0851~ BSh0856作为筛选菌株，采用平板对峙法进行筛选。
测定目标菌株对三种饲料中常见的霉菌（黑曲霉、根霉和青霉）的拮抗性。将打好的直径为5 mm的病原菌块放于PDA平板中央，四周等距离2 cm点接种枯草芽孢杆菌，倒置放入28℃恒温箱中培养，同时以仅接种饲料源霉菌的PDA平板作对照，接种后7 d内逐天检查菌落周围有无抑菌圈，并计算抑菌圈直径（mm），从而计算抑菌率，结果见表1。抑制率的计算公式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
表1 不同枯草芽孢杆菌菌株对几种霉菌菌丝生长的抑制率（%）
Figure DEST_PATH_IMAGE004
从表1可知，菌株BSh0851拮抗性最强；菌株BSh0852具有弱拮抗性；而其余菌株基本不具拮抗性。
所述枯草芽孢杆菌菌粉的制备方法包括如下步骤：
（1）种子液的制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃、200r·min-1培养24h，得种子液；所述种子培养基的配方为：牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL，pH7.0；
（2）发酵液培养基的制备：将酵母浸膏14g、无水葡萄糖14g、MgSO4 1g、蒸馏水1000mL配成发酵液培养基，调节pH至7.2-7.4后进行分装，装液量为40%（v/v），灭菌备用；
（3）枯草芽孢杆菌发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为5%（v/v）；然后于37℃、200r·min-1条件下培养24h，得发酵液；
（4）菌粉的制备：将步骤（3）所得发酵液以5000r·min-1离心15min，去除上清液后加入等体积生理盐水，通过旋涡震荡制成菌悬液，再加入15%（v/v）的阿拉伯胶作为保护剂，在入口温度150℃、进料速率500mL/h的条件下喷雾干燥，得活菌数为1.0×108cfu/g的菌粉，于4℃条件下保存备用。
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
1. 霉菌菌液的制备：用10ml生理盐水将PDA斜面上的霉菌孢子洗脱下来，转移到无菌试管中，反复吹吸后，吸取1ml菌液，加入到装有9ml无菌水的试管中，吹吸均匀。吸取5ml菌液，转移到装有495ml无菌水的锥形瓶中，获得稀释103倍的霉菌菌液，其浓度约为105CFU/g。
2. 鱼饲料的制备：将鱼饲料于121 ℃灭菌20min，然后分装于自封袋中，每袋装量150g。
3. 污染饲料的制备：用无菌枪头吸取稀释好的霉菌菌液10ml，装于小喷壶中，均匀喷洒在饲料表面，得污染饲料。
4. 饲料样品的制备：
（1）将枯草芽孢杆菌菌粉以0.1%、0.3%、0.6%、1.3%、2%、2.7%的添加量喷洒接种于污染饲料表面，依次得到饲料样品1~6。
（2）以不加枯草芽孢杆菌菌粉的污染饲料为饲料样品7。
（3）将枯草芽孢杆菌菌粉以2.7%的添加量喷洒接种于普通饲料表面，得到饲料样品8。
（4）以除了喷洒无菌水调节水分，不做其他处理的普通饲料为饲料样品9。
所有饲料样品的含水量均为12%，并将所得饲料样品放置于28℃培养箱中培养。
5. 以饲料外观和饲料中霉菌总数为指标评价枯草芽孢杆菌菌粉对饲料的防霉效果。
（1）饲料外观评判标准：具有光泽，饲料表面看不到菌丝生长，不见白斑或起丝，判定为无霉变，记为“-”；无光泽，饲料表面出现轻微斑点或菌丝，但内部没有斑点或菌丝，判定为轻度霉变，记为“+”；出现轻微白斑或菌丝，但内部未见菌丝，判定为一般霉变，记为“++”；出现明显白斑或裂纹，内部可见菌丝，以及更严重的菌体滋生现象，判定为完全霉变，记为“+++”。
（2）参考饲料中霉菌的测定标准（GB/T 13092-2006）测定饲料中霉菌总数。其具体是以无菌操作称取检样25g，放入装有225ml无菌水的玻璃三角瓶中，置振荡器上振摇30min，即为1:10稀释液。用灭菌吸管吸取1:10稀释液10ml，注入带玻璃珠的试管中，反复吹吸，使霉菌孢子分散开。取1ml稀释液注入含9ml无菌水试管中。另换一只试管吹吸5次，此为1:100稀释液。按上述操作顺序作10倍递增稀释液。每稀释一次，换一支无菌1ml枪头。根据对样品的污染情况估计，选择三个合适梯度的稀释液，取200μl涂布用平皿上，每个梯度做两个平皿。放置于28~30℃，48h后，观察菌落生长情况。
观察随着天数变化饲料中的霉变程度和菌落数，其结果分别见表2、3。
表2 饲料霉变程度观察表
Figure DEST_PATH_IMAGE006
表3 饲料表面霉菌生长情况表（单位：cfu/g）
Figure DEST_PATH_IMAGE008
由表2和表3可知，在温度为28℃的条件下，对于高水分（含水量12%）饲料而言，枯草芽孢杆菌菌粉作为生物防霉制剂可以有效防止饲料的发霉变质。对于外接霉菌的污染饲料在10-15天内就可查出霉变；而通过2.7%枯草芽孢杆菌的防霉作用，在90天外观发生轻微霉变，菌量为1.00×104，180天后外观仍属于轻微霉变，菌量仅增加1个数量级，为1.20×105。对于正常饲料在高水分条件下，60天发生轻微霉变，经枯草芽孢杆菌处理后，保质期可达到180天以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1. 一种枯草芽孢杆菌作为防霉剂在鱼饲料中的应用，其特征在于：该菌株为枯草芽孢杆菌BSh0851，其于2009年12月13日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3502；
其应用方法为：将饲料总重2.7%的枯草芽孢杆菌菌粉溶于生理盐水中，然后将其均匀喷洒于饲料表面，并控制饲料含水率为10%-12%，再将饲料于28℃密封储藏；
所述枯草芽孢杆菌菌粉的制备方法包括如下步骤：
（1）种子液的制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃、200r·min-1培养24h，得种子液；所述种子培养基的配方为：牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL，pH7.0；
（2）发酵液培养基的制备：将酵母浸膏14g、无水葡萄糖14g、MgSO4 1g、蒸馏水1000mL配成发酵液培养基，调节pH至7.2-7.4后进行分装，装液量为40%v/v，灭菌备用；
（3）枯草芽孢杆菌发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为5%v/v；然后于37℃、200r·min-1条件下培养24h，得发酵液；
（4）菌粉的制备：将步骤（3）所得发酵液以5000r·min-1离心15min，去除上清液后加入等体积生理盐水，通过旋涡震荡制成菌悬液，再加入15%v/v的阿拉伯胶作为保护剂，在入口温度150℃、进料速率500mL/h的条件下喷雾干燥，得活菌数为1.0×108cfu/g的菌粉，于4℃条件下保存备用。
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