CN108865909A - 用于固态发酵的酵母菌种组合物及其固态发酵方法、所得酵母培养物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于固态发酵的酵母菌种组合物及其固态发酵方法、所得酵母培养物，该用于固态发酵的酵母菌种组合物由酿酒酵母菌、面包酵母菌、产朊假丝酵母菌和生香酵母菌组成。采用该组合物进行固体发酵，各菌种之间充分发挥协同作用效果，提高菌种发酵过程中对固体培养基的利用率，充分增殖酵母菌，增加所得产物中酵母菌的活菌数，使酵母充分利用发酵原料，提高发酵效果。本发明的又一方面还提供了该酵母菌种组合物的固态发酵方法及发酵后所得酵母培养物。

Description

用于固态发酵的酵母菌种组合物及其固态发酵方法、所得酵 母培养物

技术领域

本发明涉及微生物固态发酵技术领域，具体的涉及一种用于固态发酵的酵母菌种组合物及其固态发酵方法、所得酵母培养物。

背景技术

酵母培养物是一种微生态制剂，是指在特定工艺条件控制下，在特定培养基上经充分好氧、厌氧发酵后所形成的微生态制品。该微生态制品不含大量的活性酵母细胞，酵母菌只起发酵作用，其存活与否对产品的使用效果没有影响。酵母培养物中主要作用成分是酵母利用固体基质发酵所产生的细胞外代谢产物、发酵后变性的固体基质、酵母细胞内容物以及酵母细胞壁等。该产品成分复杂，主要包括小肽、有机酸、维生素、呈味物质、甘露寡糖、β-葡聚糖和氨基酸以及“未知促生长因子”等，这些物质是动物胃肠道内微生物的绝好营养底物，可以有效刺激动物胃肠道内有益菌的生长，激发有益菌的代谢活性，稳定动物胃肠道微生态环境，进而提高动物的生产性能。尤其在反刍动物生产实践中应用效果明显，酵母培养物可通过调控反刍动物中的瘤胃微生物进而有效提高反刍动物对饲料的利用率，是集保健和营养等多重功效于一体的微生态饲料添加剂。酵母培养物的功能及其机制主要为：改善胃肠道菌群落结构，提高动物生产性能；补充营养，改善消化功能；提高机体免疫力及抗病力。

酵母培养物能发挥以上作用，是基于酵母中多种代谢产物组成的生长因子，也就是说发酵基质中代谢产物越丰富、量越大，酵母培养物作为饲料添加剂效果就越明显；而酵母代谢产物的多少是由发酵水平决定的，发酵水平越高，酵母代谢产物就越丰富、量越大。目前酵母培养物的生产方式主要有液体发酵和固体发酵两种方式：(1)液体发酵：以液体培养基发酵扩繁酵母菌，之后再用载体吸附酵母菌，后续进行破壁处理或者液体发酵后进行酶解再用载体吸附酵母菌，烘干后做成产品，此类产品大部分是酵母菌的菌体蛋白和酵母胞内物质，酵母代谢产物极少。(2)固体发酵：酵母的固体发酵主要有浅盘发酵、袋式发酵、发酵池发酵等方式。固体发酵后所得产品中酵母代谢产物比液体发酵后所得产品丰富。但现有固态发酵普遍存在发酵水平降低，酵母活菌数低的问题，从而影响了固体发酵所得产品的应用效果。这是因为在固态发酵过程中，酵母不能充分利用固体发酵原料，导致发酵效果低，经济成本也较高；从而影响产品质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于固态发酵的酵母菌种组合物及其固态发酵方法、酵母培养物，该发明解决了现有技术中，固体发酵酵母菌中发酵水平降低，酵母活菌数低，酵母不能充分利用固体发酵原料的技术问题。

本发明提供一种用于固态发酵的酵母菌种组合物，由酿酒酵母菌、面包酵母菌、产朊假丝酵母菌和生香酵母菌组成。

进一步地，所述用于固态发酵的酵母菌种组合物中，酿酒酵母菌、面包酵母菌、产朊假丝酵母菌和生香酵母菌的质量比为20～30：10～30：20～40：10～40。

本发明的又一方面还提供了一种如上述的用于固态发酵的酵母菌种组合物的固态发酵方法，包括以下步骤：

步骤S100：发酵制备酵母菌液体发酵种子液；

步骤S200：配置固体培养基后，将所述种子液接种至所述固体培养基中；

步骤S300：采用气相脉动式固态发酵法进行固态发酵，发酵结束得到所述酵母培养物。

进一步地，所述步骤S100包括以下步骤：

步骤S110：活化所述酵母菌种组合物，分离纯化所述酵母菌种组合物中的酵母菌种，并接种至一级摇瓶培养基中进行一级培养得到一级种子液；

步骤S120：将所述一级种子液接种至二级摇瓶培养基中，进行二级培养，得到三角瓶液体种子液；

步骤S130：将所述三角瓶液体种子液以2～5％的接种量接种至糖蜜液体培养基中扩繁，得到所述酵母菌液体发酵种子液；

进一步地，所述扩繁条件为：在28～30℃条件下有氧发酵20～24小时；

所述一级培养条件为：培养基装瓶体积为容器总容器的10～30％，在温度为28～30℃，摇瓶速度为180～220rpm下，摇瓶培养15～24小时；

更优选的，所述一级培养步骤的所述培养基装瓶体积为容器总容器的20％。

进一步地，所述糖蜜液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：糖蜜8.5％，玉米浆0.1％，硫酸镁0.15％，氯化钙0.05％，磷酸二氢钾0.1％，余量为水；所述糖蜜液体培养基的初始pH为6.0～6.5；所述糖蜜液体培养基的灭菌条件为：在121℃温度条件下灭菌30分钟；所述糖蜜液体培养基在发酵过程中不调pH，控制所述糖蜜液体培养基的溶氧量在30％～50％范围内。

进一步地，所述二级培养条件为：培养基装瓶体积为容器总容器的10～30％，在温度为28～30℃摇瓶速度为180～220rpm下，摇瓶培养18～24小时；

更优选的，所述二级培养的所述培养基装瓶体积为容器总容器的25％。

进一步地，所述步骤S200中包括以下步骤：

步骤S210：所述固体培养基的配置：按照质量百分比为玉米粉10～30％、麸皮20～40％、玉米胚芽粕10～20％、稻壳粉15～20％、豆粕粉10～20％和豆腐渣5～10％配置，得到基础混合物，再按所述基础混合物与水质量比为1:0.8加入水，混合均匀，得到所述固体培养基；

步骤S220：对所述固体培养基进行灭菌处理，灭菌条件为：采用汽爆灭菌法对所述固体培养基进行灭菌处理，灭菌条件为：蒸汽压力0.8MPa，罐压0.5～0.6MPa，保压时间5～8分钟；

步骤S230：将所述酵母菌液体发酵种子液以5～10％的接种量接种到所述固体发酵培养基中，混合均匀。

进一步地，所述步骤S300中包括以下步骤：

1)开启脉动式固体发酵罐，在28～30℃下对完成接种操作的所述固体发酵培养基进行有氧发酵；

2)所述有氧发酵过程中在罐压为0.05～0.3MPa条件下，保压10～60秒，之后泄压至0.00～0.03MPa后，保压60～120分钟；

3)增压到0.05～0.3MPa后循环进行所述步骤2)，直到进行所述有氧发酵20～24小时后，取样检测发酵液中酵母菌数；

4)进行隔绝空气地厌氧发酵，升高所述脉动式固体发酵罐内温度至40～60℃，保温12～24小时后，结束所述固态发酵。

本发明提供的固体发酵方法，具体包括以下步骤：

步骤一：三角瓶液体菌种的制备

分别将酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌菌种活化，再将分离纯化后的酵母菌接种到一级摇瓶培养基中，250ml三角瓶培养基装量为50ml，28～30℃、180～220rpm摇瓶培养15～24小时，得到一级种子液；

然后将酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌的一级种子液按20～30：10～30：20～40：10～40接种到二级摇瓶培养基，2000ml三角瓶装量500ml，28℃～30℃、180～220rpm摇瓶培养18～24小时，得到三角瓶的液体种子液。其中，所述酵母菌的种子培养基为YPD液体培养基，所述YPD液体培养基的组成为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母粉10g，1000ml水，自然pH。该培养基在121℃条件下高温灭菌20分钟。

步骤二：种子罐液体菌种的制备

将步骤一中得到的酵母菌三角瓶液体菌种以2～5％的接种量接种至糖蜜液体培养基中扩繁，于28～30℃条件下有氧发酵20～24小时，制得酵母菌种子罐的液体菌种。其中，所述糖蜜液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：糖蜜8.5％，玉米浆0.1％，硫酸镁0.15％，氯化钙0.05％，磷酸二氢钾0.1％，余量为水；调节该培养基的初始pH至6.0～6.5，在121℃温度条件下灭菌30分钟。发酵过程中不调pH，控制该培养基溶氧在30％～50％。

步骤三：固体培养基的制备

按照玉米粉10～30％、麸皮20～40％、玉米胚芽粕10～20％、稻壳粉15～20％、豆粕粉10～20％、豆腐渣5～10％配置成固体培养基，再按1:0.8(w:w)添加自来水，混合均匀；

固体培养基的灭菌处理：将上述固体培养基投入汽爆灭菌罐后，进行灭菌处理，灭菌条件：蒸汽压力：0.8MPa，罐压：0.5～0.6MPa，保压时间5～8分钟，灭菌时间10分钟。

步骤四：固体发酵

将步骤二制备的种子罐液体菌种以5～10％的接种量接种到步骤三制备的固体发酵培养基中，混合均匀，进入脉动式固体发酵罐，于28～30℃条件下有氧发酵20～24小时，发酵条件：罐压保持0.05～0.3MPa，保压时间10～60秒后泄压，维持低压0.00～0.03MPa保压60～120分钟后增压到0.05～0.3MPa，如此往复，直到有氧发酵结束。有氧发酵结束时，取样检测酵母菌数。

上述有氧发酵结束后进行厌氧发酵，厌氧发酵过程中不在通入空气，关闭脉动式固体发酵罐所有气阀升高罐内温度至40～60℃，维持12～24小时。

步骤五：烘干粉碎

将步骤四中得到的物料用闪蒸干燥机进行干燥，干燥条件：温度90～130℃，时间30-120s。将干燥物料进行粉碎后得到成品。

本发明的又一方面还提供了一种上述的固态发酵方法发酵得到的酵母培养物。

本发明的技术效果：

本发明提供的用于固态发酵的酵母菌种组合物，采用该组合物进行固体发酵，各菌种之间充分发挥协同作用效果，提高菌种发酵过程中对固体培养基的利用率，充分增殖酵母菌，增加所得产物中酵母菌的活菌数，使酵母充分利用发酵原料，提高发酵效果。

本发明提供的固态发酵方法，该方法采用气相脉动式固态发酵法进行发酵。发酵过程中通过向固体培养基中阶段性地通入无菌空气来补充氧气，酵母活菌数大大提高，生产效率显著提高。

本发明提供的酵母培养物，所制得的酵母培养物中包含具有诱食作用的脂类代谢物，将其作为添加剂加入饲料中能提高产品香味，提高诱食性；所制得的酵母培养物中包含丰富的微生物蛋白和维生素B，为动物提供丰富维生素和蛋白，增加动物营养，同时该培养物中还含有小肽、有机酸、维生素、呈味物质、甘露寡糖、β-葡聚糖、氨基酸等多种代谢产物，使其具有改善胃肠道菌群落结构，提高动物生产性能；补充营养，改善消化功能；提高机体免疫力及抗病力的作用。

具体请参考根据本发明的用于固态发酵的酵母菌种组合物及其固态发酵方法提出的各种实施例的如下描述，将使得本发明的上述和其他方面显而易见。

具体实施方式

本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

本发明提供的用于固态发酵的酵母菌种组合物，包括：酿酒酵母菌、面包酵母菌、产朊假丝酵母菌和生香酵母菌。

该酵母菌种组合物中利用生香酵母菌在代谢过程中产生的大量脂类代谢物质，提高所得酵母培养物的香味，从而提高添加酵母培养物的饲料对动物的诱食效果。面包酵母产气可以使发酵培养基蓬松更利于发酵过程中热量和空气的传输，从而为其他酵母菌在固态发酵条件下，提供更多的运动通道，提高酵母菌对固态培养基的利用率。酿酒酵母菌在发酵过程中能产生丰富的微生物蛋白，为前提增殖微生物提供物质基础，也能提高所得酵母培养物中的优质蛋白质含量。产朊假丝酵母菌可以代谢产生丰富的蛋白质和维生素B，为动物提供丰富维生素和蛋白质来源。四种酵母还能同时在酵母培养物中提供小肽、有机酸、维生素、呈味物质、甘露寡糖、β-葡聚糖、氨基酸等丰富的代谢产物。

优选的，用于固态发酵的酵母菌种组合物由酿酒酵母菌、面包酵母菌、产朊假丝酵母菌和生香酵母菌组成。

更优选的，用于固态发酵的酵母菌种组合物中，酿酒酵母菌、面包酵母菌、产朊假丝酵母菌和生香酵母菌的质量比为20～30：10～30：20～40：10～40。

优选的，所述用于固态发酵的酵母菌种组合物中，酿酒酵母菌、面包酵母菌、产朊假丝酵母菌和生香酵母菌的质量比为20：15：30：35。酿酒酵母菌、面包酵母菌、产朊假丝酵母菌和生香酵母菌的质量比为25：20：25：30。酿酒酵母菌、面包酵母菌、产朊假丝酵母菌和生香酵母菌的质量比为28：22：27：23。

该菌种组合物在使用时，可以按上述质量比例将菌种混合后使用，也可以对各菌种分别在液体培养基条件下增殖后，将各菌种的种子液按该质量比例进行混合后接种或分别接种。

本发明的又一方面还提供了上述酵母菌种组合物的固态发酵方法，包括以下步骤：

步骤S100：发酵制备酵母菌液体发酵种子液；

步骤S200：配置固体培养基后，将所述种子液接种至所述固体培养基中；

步骤S300：采用气相脉动式固态发酵法进行固态发酵，发酵结束得到所述酵母培养物；

现有固体发酵过程中多采用发酵池、发酵床、曲盘发酵等方式进行，生产过程中需要频繁翻料补充氧气，采用上述方法所补充进入培养基的氧气含量仍然无法完全满足酵母生长中，尤其是生长初期对氧气的需求。本发明提供的固体发酵方法，针对酵母发酵前期需要充足的氧气，氧气不足的情况下酵母菌生长易受影响的问题。采用气相脉动式固态发酵法进行发酵。发酵过程中通过向固体培养基中阶段性地通入无菌空气来补充氧气，酵母活菌数大大提高，生产效率显著提高。

优选的，所述步骤S100包括以下步骤：

步骤S110：活化所述酵母菌种组合物，分离纯化所述酵母菌种组合物中的酵母菌种，并接种至一级摇瓶培养基中进行一级培养得到一级种子液；所述一级培养条件为：培养基装瓶体积为容器总容器的10～30％，在温度为28～30℃，摇瓶速度为180～220rpm下，摇瓶培养15～24小时；更优选的，培养基装瓶体积为容器总容器的20％。

步骤S120：将所述一级种子液接种至二级摇瓶培养基中，进行二级培养，得到三角瓶液体种子液；

步骤S130：将所述三角瓶液体种子液以2～5％的接种量接种至糖蜜液体培养基中扩繁，得到所述酵母菌液体发酵种子液；所述扩繁条件为：在28～30℃条件下有氧发酵20～24小时。

所述糖蜜液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：糖蜜8.5％，玉米浆0.1％，硫酸镁0.15％，氯化钙0.05％，磷酸二氢钾0.1％，余量为水。调节所述糖蜜液体培养基的初始pH至6.0～6.5，在121℃温度条件下灭菌30分钟。发酵过程中不调pH，控制该培养基溶氧量在30％～50％范围内。

优选的，所述二级培养条件为：培养基装瓶体积为容器总容器的10～30％，在温度为28～30℃，摇瓶速度为180～220rpm下，摇瓶培养18～24小时；更优选的，培养基装瓶体积为容器总容器的25％；

所述一级摇瓶培养基为YPD液体培养基；所述YPD液体培养基包括：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母粉10g和1000ml水。所述YPD液体培养基的pH为未调整的自然pH。所述YPD液体培养基的灭菌条件为：在常压121℃下灭菌20分钟。

采用上述培养基，能提高酵母菌种组合物中各菌种的增殖数量，避免后续固态发酵过程中种子菌种数量过少的问题。使种子液中各菌种数量均衡，更有利于后续固态发酵时，各菌种协同作用提高所得酵母培养物中活菌数量和有益物质数量，并提高发酵彻底程度。

作为本发明的一个实施例，所述步骤S100为对所述酵母菌种组合物中各组分菌种分别进行步骤S110，得到各组分的所述一级种子液，按所述酵母菌种组合物中质量比分别接种至所述二级摇瓶培养基中后再进行所述步骤S120。

作为本发明的另一个实施例，所述步骤S100为将所述酵母菌种组合物中各组分菌种，按质量比例混合后进行步骤S110，并对得到含有酵母菌种组合物中各组分菌种的一级种子液进行所述步骤S120。

优选的，步骤S200中包括以下步骤：

步骤S210：所述固体培养基按照质量百分比为玉米粉10～30％、麸皮20～40％、玉米胚芽粕10～20％、稻壳粉15～20％、豆粕粉10～20％、豆腐渣5～10％配置，得到基础混合物，再按所述基础混合物与水质量比为1:0.8添加水，混合均匀，得到所述固体培养基；

步骤S220：对所述固体培养基进行灭菌处理，灭菌条件为：采用汽爆灭菌法对所述固体培养基进行灭菌处理，灭菌条件为：蒸汽压力：0.8MPa，罐压：0.5～0.6MPa，保压时间5～8分钟，灭菌时间10分钟；

步骤S230：将所述酵母菌液体发酵种子液以5～10％的接种量接种到所述固体发酵培养基中，混合均匀。

本发明针对现有固体发酵前，需要采取蒸锅的灭菌方式，存在灭菌时间长，产能小，劳动强度大、工作效率低等缺点。本发明采用汽爆灭菌法对固体培养基灭菌，彻底解决现有固体培养基灭菌产能小、灭菌时间长的问题，大大提高了工作效率。

优选的，步骤S300中所述固态发酵包括以下步骤：

1)开启脉动式固体发酵罐，在28～30℃下对完成接种操作的所述固体发酵培养基进行有氧发酵；

2)所述有氧发酵过程中罐压为0.05～0.3MPa条件下，保压10～60秒，之后泄压至0.00～0.03MPa后，保压60～120分钟；

3)增压到0.05～0.3MPa后循环进行所述步骤2)，直到进行所述有氧发酵20～24小时后，取样检测发酵液中酵母菌数；

4)进行隔绝空气地厌氧发酵，升高所述脉动式固体发酵罐内温度至40～60℃，保温12～24小时后，结束所述固态发酵。通过反复升压和降压，能提高菌种在固态培养基纵向深度中的分布，提高菌种对培养基物料的利用率，提高发酵效率，避免发酵不均匀、活菌数量少情况的出现。

结束固态发酵后，对所得产物进行常规处理即可得到酵母培养物，例如用闪蒸干燥机对发酵后物料进行干燥，干燥条件：在温度90～130℃，时间30-120s。将干燥物料进行粉碎后得到酵母培养物。

本发明的又一方面还提供了一种按上述方法发酵得到的酵母培养物。

实施例

以下实施例中所用物料，如非特殊说明均为商业渠道购买。

实施例1

作为本发明的一个实施例，所述酵母培养物的制备方法包括以下步骤：

步骤一：三角瓶液体菌种的制备

分别将酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌菌种活化，再将分离纯化后的酵母菌接种到一级摇瓶培养基中，250ml三角瓶培养基装量为50ml，28℃，180rpm摇瓶培养15小时，得到一级种子液；

然后将酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌的一级种子液按20：15：30：35接种到二级摇瓶培养基，2000ml三角瓶装量500ml，28℃、180rpm摇瓶培养18～24小时，得到三角瓶的液体种子液。其中，所述酵母菌的种子培养基为YPD液体培养基，所述YPD液体培养基的组成为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母粉10g，1000ml水，自然pH。该培养基在121℃条件下高温灭菌20分钟。

步骤二：种子罐液体菌种的制备

将步骤一中得到的酵母菌三角瓶液体菌种以2％的接种量接种至糖蜜液体培养基中扩繁，于28℃条件下有氧发酵20小时，制得酵母菌种子罐的液体菌种。其中，所述糖蜜液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：糖蜜8.5％，玉米浆0.1％，硫酸镁0.15％，氯化钙0.05％，磷酸二氢钾0.1％，余量为水；调节该培养基的初始pH至6.0，在121℃温度条件下灭菌30分钟。发酵过程中不调pH，控制该培养基溶氧在30％。

步骤三：固体培养基的制备

按照玉米粉20％、麸皮30％、玉米胚芽粕10％、稻壳粉20％、豆粕粉10％、豆腐渣10％配置成固体培养基，再按1:0.8(w:w)添加自来水，混合均匀；

固体培养基的灭菌处理：将上述固体培养基投入汽爆灭菌罐后，进行灭菌处理，灭菌条件：蒸汽压力：0.8MPa，罐压：0.5MPa，保压时间5分钟，灭菌时间10分钟。

步骤四：固体发酵

将步骤三制备的种子罐液体菌种以5％的接种量接种到步骤三制备的固体发酵培养基中，混合均匀，进入脉动式固体发酵罐，于28℃条件下有氧发酵20小时，发酵条件：罐压保持0.05MPa，保压时间10秒后泄压，维持低压0.01MPa 60分钟后增压到0.05MPa，如此往复，直到有氧发酵结束。有氧发酵结束时，得到有氧发酵产物1，取样检测酵母菌数。

上述有氧发酵结束后进行厌氧发酵，厌氧发酵过程中不在通入空气，关闭脉动式固体发酵罐所有气阀升高罐内温度至40℃，维持24小时。

步骤五：烘干粉碎

将步骤四中得到的物料用闪蒸干燥机进行干燥，干燥条件：温度100℃，时间75s。将干燥物料进行粉碎后得到成品。

实施例2

作为本发明的一个实施例，所述酵母培养物的制备方法包括以下步骤：

步骤一：三角瓶液体菌种的制备

分别将酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌菌种活化，再将分离纯化后的酵母菌接种到一级摇瓶培养基中，250ml三角瓶培养基装量为50ml，30℃、220rpm摇瓶培养15～24小时，得到一级种子液；

然后将酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌的一级种子液按25：20：25：30接种到二级摇瓶培养基，2000ml三角瓶装量500ml，30℃、220rpm摇瓶培养24小时，得到三角瓶的液体种子液。其中，所述酵母菌的种子培养基为YPD液体培养基，所述YPD液体培养基的组成为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母粉10g，1000ml水，自然pH。该培养基在121℃条件下高温灭菌20分钟。

步骤二：种子罐液体菌种的制备

将步骤一中得到的酵母菌三角瓶液体菌种以5％的接种量接种至糖蜜液体培养基中扩繁，于30℃条件下有氧发酵24小时，制得酵母菌种子罐的液体菌种。其中，所述糖蜜液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：糖蜜8.5％，玉米浆0.1％，硫酸镁0.15％，氯化钙0.05％，磷酸二氢钾0.1％，余量为水；调节该培养基的初始pH至6.5，在121℃温度条件下灭菌30分钟。发酵过程中不调pH，控制该培养基溶氧在50％。

步骤三：固体培养基的制备

按照玉米粉25％、麸皮35％、玉米胚芽粕10％、稻壳粉15％、豆粕粉10％、豆腐渣5％配置成固体培养基，再按1:0.8(w:w)添加自来水，混合均匀；

固体培养基的灭菌处理：将上述固体培养基投入汽爆灭菌罐后，进行灭菌处理，灭菌条件：蒸汽压力：0.8MPa，罐压：0.6MPa，保压时间8分钟，灭菌时间10分钟。

步骤四：固体发酵

将步骤三制备的种子罐液体菌种以10％的接种量接种到步骤四制备的固体发酵培养基中，混合均匀，进入脉动式固体发酵罐，于28～30℃条件下有氧发酵24小时，发酵条件：罐压保持0.3MPa，保压时间10～60分钟后泄压，维持低压120分钟后增压到0.3MPa，如此往复，直到有氧发酵结束。有氧发酵结束时，得到有氧发酵产物2，取样检测酵母菌数。

上述有氧发酵结束后进行厌氧发酵，厌氧发酵过程中不在通入空气，关闭脉动式固体发酵罐所有气阀升高罐内温度至60℃，维持16小时。

步骤五：烘干粉碎

将步骤四中得到的物料用闪蒸干燥机进行干燥，干燥条件：温度110℃，时间40s。将干燥物料进行粉碎后得到成品。

实施例3

作为本发明的一个实施例，所述酵母培养物的制备方法包括以下步骤：

步骤一：三角瓶液体菌种的制备

分别将酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌菌种活化，再将分离纯化后的酵母菌接种到一级摇瓶培养基中，250ml三角瓶培养基装量为50ml，29℃、200rpm摇瓶培养20小时，得到一级种子液；

然后将酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌的一级种子液按28：22：27：23接种到二级摇瓶培养基，2000ml三角瓶装量500ml，30℃、200rpm摇瓶培养20小时，得到三角瓶的液体种子液。其中，所述酵母菌的种子培养基为YPD液体培养基，所述YPD液体培养基的组成为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母粉10g，1000ml水，自然pH。该培养基在121℃条件下高温灭菌20分钟。

步骤二：种子罐液体菌种的制备

将步骤一中得到的酵母菌三角瓶液体菌种以3％的接种量接种至糖蜜液体培养基中扩繁，于28～30℃条件下有氧发酵22小时，制得酵母菌种子罐的液体菌种。其中，所述糖蜜液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：糖蜜8.5％，玉米浆0.1％，硫酸镁0.15％，氯化钙0.05％，磷酸二氢钾0.1％，余量为水；调节该培养基的初始pH至6.2，在121℃温度条件下灭菌30分钟。发酵过程中不调pH，控制该培养基溶氧在40％。

步骤三：固体培养基的制备

按照玉米粉20％、麸皮35％、玉米胚芽粕13％、稻壳粉17％、豆粕粉15％、豆腐渣5％配置成固体培养基，再按1:0.8(w:w)添加自来水，混合均匀；

固体培养基的灭菌处理：将上述固体培养基投入汽爆灭菌罐后，进行灭菌处理，灭菌条件：蒸汽压力：1.0MPa，罐压：0.8MPa，保压时间5分钟，灭菌时间10分钟。

步骤四：固体发酵

将步骤三制备的种子罐液体菌种以6％的接种量接种到步骤四制备的固体发酵培养基中，混合均匀，进入脉动式固体发酵罐，于29℃条件下有氧发酵23小时，发酵条件：罐压保持0.27MPa，保压时间50分钟后泄压，维持低压80分钟后增压到0.15MPa，如此往复，直到有氧发酵结束。有氧发酵结束时，得到有氧发酵产物3，取样检测酵母菌数。

上述有氧发酵结束后进行厌氧发酵，厌氧发酵过程中不在通入空气，关闭脉动式固体发酵罐所有气阀升高罐内温度至50℃，维持20小时。

步骤五：烘干粉碎

将步骤四中得到的物料用闪蒸干燥机进行干燥，干燥条件：温度90℃，时间90s。将干燥物料进行粉碎后得到成品。

实施例4

用于固态发酵的酵母菌种组合物中，酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌按质量比为20：30：20：40混合。

实施例5

用于固态发酵的酵母菌种组合物中，酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌按质量比为30：10：40：10混合。

实施例6

用于固态发酵的酵母菌种组合物中，酿酒酵母、面包酵母、产朊假丝酵母和生香酵母菌按质量比为25：15：30：30混合。

实施例7

与实施例3的区别在于：发酵制备酵母菌液体发酵种子液步骤中，将实施例6中所得用于固态发酵的酵母菌种组合物，在混合物的状态下依序进行活化、分离纯化、一级培养，得到含有酵母菌种组合物中所有菌种的一级种子液。之后再将一级种子液接种至二级摇瓶培养基中，进行二级培养，得到三角瓶液体种子液。

对比例1

按CN201510067831.5中公开的固态发酵方法及酵母菌菌种进行发酵，并检测固态发酵中，有氧发酵结束后所得产物中的酵母活菌数。

对比例2

按CN201710169464.9中公开的固态发酵方法及酵母菌菌种进行发酵，并检测固态发酵中，有氧发酵结束后所得产物中的酵母活菌数。

检测实施例1-3中经过步骤四有氧发酵后得到的固体有氧发酵产物1～3和对比例1～2中对应步骤中所得发酵产物的酵母菌活菌数，结果见表1。

表1实施例1～3中所得固体有氧发酵产物1～3中酵母活菌数统计结果表

	对比例1	对比例2	实施例1	实施例2	实施例3
						酵母菌活菌数/(亿cfu/g)	6	8	35.5	45	47.0

从表1可见，本发明提供的酵母菌种组合物，采用本发明提供的固体发酵法发酵后，有氧发酵后的产物中，酵母活菌数明显高于对比例1～2中方法所得结果，说明本发明提供方法酵母菌的发酵水平较高，活菌数显著提高，说明酵母菌能充分利用固体发酵中的原料。

本领域技术人员将清楚本发明的范围不限制于以上讨论的示例，有可能对其进行若干改变和修改，而不脱离所附权利要求书限定的本发明的范围。尽管己经在说明书中详细描述了本发明，但这样的说明和描述仅是说明或示意性的，而非限制性的。本发明并不限于所公开的实施例。

通过对说明书和权利要求书的研究，在实施本发明时本领域技术人员可以理解和实现所公开的实施例的变形。在权利要求书中，术语“包括”不排除其他步骤或元素，而不定冠词“一个”或“一种”不排除多个。在彼此不同的从属权利要求中引用的某些措施的事实不意味着这些措施的组合不能被有利地使用。权利要求书中的任何参考标记不构成对本发明的范围的限制。

Claims (10)

1.一种用于固态发酵的酵母菌种组合物，其特征在于，由酿酒酵母菌、面包酵母菌、产朊假丝酵母菌和生香酵母菌组成。

2.根据权利要求1所述的用于固态发酵的酵母菌种组合物，其特征在于，所述用于固态发酵的酵母菌种组合物中，所述酿酒酵母菌、所述面包酵母菌、所述产朊假丝酵母菌和所述生香酵母菌的质量比为20～30：10～30：20～40：10～40。

3.一种如权利要求1或2中所述的用于固态发酵的酵母菌种组合物的固态发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S100：发酵制备酵母菌液体发酵种子液；

步骤S200：配置固体培养基后，将所述种子液接种至所述固体培养基中；

步骤S300：采用气相脉动式固态发酵法进行固态发酵，发酵结束得到所述酵母培养物。

4.根据权利要求3所述的固态发酵方法，其特征在于，所述步骤S100包括以下步骤：

步骤S110：活化所述酵母菌种组合物，分离纯化所述酵母菌种组合物中的酵母菌种，并接种至一级摇瓶培养基中进行一级培养得到一级种子液；

步骤S120：将所述一级种子液接种至二级摇瓶培养基中，进行二级培养，得到三角瓶液体种子液；

步骤S130：将所述三角瓶液体种子液以2～5％的接种量接种至糖蜜液体培养基中扩繁，得到所述酵母菌液体发酵种子液。

5.根据权利要求4所述的固态发酵方法，其特征在于，所述扩繁条件为：在28～30℃条件下有氧发酵20～24小时；

所述一级培养条件为：培养基装瓶体积为容器总容器的10～30％，在温度为28～30℃，摇瓶速度为180～220rpm下，摇瓶培养15～24小时；

更优选的，所述一级培养步骤的所述培养基装瓶体积为容器总容器的20％。

6.根据权利要求4所述的固态发酵方法，其特征在于，所述糖蜜液体培养基由以下物质按照质量百分比组成：糖蜜8.5％，玉米浆0.1％，硫酸镁0.15％，氯化钙0.05％，磷酸二氢钾0.1％，余量为水；所述糖蜜液体培养基的初始pH为6.0～6.5；所述糖蜜液体培养基的灭菌条件为：在121℃温度条件下灭菌30分钟；所述糖蜜液体培养基在发酵过程中不调pH，控制所述糖蜜液体培养基的溶氧量在30％～50％范围内。

7.根据权利要求4所述的固态发酵方法，其特征在于，所述二级培养条件为：培养基装瓶体积为容器总容器的10～30％，在温度为28～30℃摇瓶速度为180～220rpm下，摇瓶培养18～24小时；

更优选的，所述二级培养的所述培养基装瓶体积为容器总容器的25％。

8.根据权利要求3所述的固态发酵方法，其特征在于，所述步骤S200中包括以下步骤：

步骤S210：所述固体培养基的配置：按照质量百分比为玉米粉10～30％、麸皮20～40％、玉米胚芽粕10～20％、稻壳粉15～20％、豆粕粉10～20％和豆腐渣5～10％配置，得到基础混合物，再按所述基础混合物与水质量比为1:0.8加入水，混合均匀，得到所述固体培养基；

步骤S220：对所述固体培养基进行灭菌处理，灭菌条件为：采用汽爆灭菌法对所述固体培养基进行灭菌处理，灭菌条件为：蒸汽压力0.8MPa，罐压0.5～0.6MPa，保压时间5～8分钟；

步骤S230：将所述酵母菌液体发酵种子液以5～10％的接种量接种到所述固体发酵培养基中，混合均匀。

9.根据权利要求8所述的固态发酵方法，其特征在于，所述步骤S300中包括以下步骤：

1)开启脉动式固体发酵罐，在28～30℃下对完成接种操作的所述固体发酵培养基进行有氧发酵；

2)所述有氧发酵过程中在罐压为0.05～0.3MPa条件下，保压10～60秒，之后泄压至0.00～0.03MPa后，保压60～120分钟；

3)增压到0.05～0.3MPa后循环进行所述步骤2)，直到进行所述有氧发酵20～24小时后，取样检测发酵液中酵母菌数；

4)进行隔绝空气地厌氧发酵，升高所述脉动式固体发酵罐内温度至40～60℃，保温12～24小时后，结束所述固态发酵。

10.一种如权利要求3～9所述的固态发酵方法发酵得到的酵母培养物。