CN108853091A - Aurovertin B在制备预防或治疗肿瘤细胞转移药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Aurovertin B在制备预防或治疗肿瘤细胞转移药物中的应用，aurovertin B在不影响正常细胞生长的情况下，通过非抑制肿瘤细胞生长的途径，能抑制癌细胞的迁移、侵袭、粘附；aurovertin B在乳腺癌细胞中的IC50与临床常用药紫杉醇活性相当，但对正常乳腺细胞MCF10A抑制作用弱，具有很好的安全性，且其低浓度(0.01‑1.25μg/ml)时能显著抑制肿瘤细胞转移，可作为易发生转移的肿瘤临床治疗的辅助用药之一，该化合物不论单独使用或者联合用药均具有开发价值。

Description

Aurovertin B在制备预防或治疗肿瘤细胞转移药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是ATP合成酶抑制剂aurovertin B用于制备抗肿瘤转移药物以及作为联合用药的新用途。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁着人类健康，成为死亡率最高的疾病。肿瘤转移是恶性肿瘤最重要的特征之一，也是临床肿瘤治疗失败的主要原因。绝大多数癌症患者死亡的主要原因是转移瘤生长的结果。肿瘤转移是个复杂的，多步骤，多阶段的综合过程。首先，肿瘤细胞之间的粘附能力下降，继而脱离原发灶，逐渐侵袭，粘附于细胞外基质，同时分泌蛋白水解酶，降解基质，并进入血液或淋巴循环系统，同时还要逃避机体免疫系统的攻击，在移出血管外形成转移灶。因此阻断转移的任何一个过程均会抑制转移的发生，对肿瘤转移的合理治疗对于延长生存时间，提高治愈率，均有重大意义。
本发明所述的化合物aurovertin B是早前从真菌Calcarisporium arbuscula齿梗孢霉中分离得到的一组代谢产物(其制备方法见Wang F.,Luo D.Q.,LiuJ.K.Aurovertin E,a new polyene pyrone from the basidiomycete Albatrellusconfluens[J].J.Antibiot.,2005,58:412–415.)，它是线粒体酶系统催化的三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)合成和ATP水解的有效抑制剂。已有体外活性研究证明aurovertin B可结合和选择性地抑制肿瘤细胞表面ATP合成酶，促进肿瘤细胞死亡。Aurovertin B对多种乳腺癌细胞株的增殖均具有较强的抑制作用，其活性与紫杉醇相当，且对正常乳腺细胞MCF10A的影响不大。Aurovertin B通过抑制ATP合成酶活性，诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期G0/G1期进而抑制乳腺癌细胞的增殖(Tsui-Chin Huang,Hsin-YiChang,et al.Targeting Therapy for Breast Carcinoma by ATP Synthase InhibitorAurovertin B. Journal of Proteome Research,2008,7,1433–1444)。这些结果表明，aurovertin B可以作为一种潜在的高选择性作用的抗肿瘤化合物，并可能被用于癌症治疗以及作为联合用药的候选。
本研究首次发现，在不引起肿瘤增殖抑制的浓度下，aurovertin B具有抑制肿瘤转移作用。实例研究结果表明aurovertin B对乳腺癌细胞的转移具有很好的抑制作用，即其可在高浓度时抑制三阴乳腺癌细胞生长，促进其凋亡，低浓度又能显著抑制肿瘤转移。Aurovertin B这一特性这恰好与TNBC治疗效果差，易转移的特性相对应，同时也表明在安全剂量下发挥抗肿瘤转移的aurovertin B也可作为除乳腺癌之外，其他易发生转移的肿瘤临床治疗的辅助治疗策略之一。对于本发明涉及的aurovertin B在制备抗肿瘤转移药物中的用途属于首次公开，且其抗肿瘤转移效果显著。
发明内容
本发明的目的在于提供aurovertin B制备预防或治疗肿瘤转移药物中的应用，可作为治疗肿瘤的辅助药物。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种Aurovertin B在制备预防或治疗肿瘤细胞转移药物中的应用。
进一步，所述肿瘤转移药物为抑制肿瘤细胞迁移的药物。
进一步，所述肿瘤转移药物为抑制肿瘤细胞黏附的药物。
进一步，所述抗肿瘤细胞转移药物为抗三阴乳腺癌细胞转移药物，所述三阴乳腺癌细胞为MDA-MB-231细胞。
本发明所述化合物aurovertin B结构式如下：
本发明aurovertin B在制备抗肿瘤转移药物中的应用，尤其是针对三阴乳腺癌的抗肿瘤转移药，其发挥抗肿瘤转移作用的机制是抑制肿瘤细胞的迁移、粘附和侵袭，不是通过抑制肿瘤细胞生长来实现的。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：aurovertin B在不影响正常细胞生长的情况下，通过非抑制肿瘤细胞生长的途径，能抑制癌细胞的迁移、侵袭、粘附；aurovertin B在乳腺癌细胞中的IC50与临床常用药紫杉醇活性相当，但对正常乳腺细胞MCF10A抑制作用弱，具有很好的安全性，且其低浓度(0.01-1.25μg/ml)时能显著抑制肿瘤细胞转移，可作为易发生转移的肿瘤临床治疗的辅助用药之一，该化合物不论单独使用或者联合用药均具有开发价值。
附图说明
图1.不同浓度aurovertin B对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231存活率的影响，横坐标单位为药物浓度，以μg/ml表示，纵坐标单位为细胞存活率，以％表示(与对照组相比，*P＜0.05)。
图2.aurovertin B对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的影响，A为对照组培养0h，B为0.01μg/ml给药20h，C为对照组培养20h，D为1.25μg/ml给药20h(与对照组相比， *P＜0.05)。
图3.aurovertin B对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231粘附的影响，A为1.25μg/ml给药 24h，B为0.01μg/ml给药24h，C为0.0004μg/ml给药24h，D为对照组培养24h(与对照组相比，*P＜0.05)。
图4.aurovertin B对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭的影响，A为0.05μg/ml给药， B为0.01μg/ml给药，C为对照(与对照组相比，*P＜0.05)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不受具体实施例的任何限制，而是通过权利要求加以限定。
实施例1aurovertin B的制备
本发明所涉及化合物aurovertin B的制备方法参见文献(Wang F.,Luo D.Q.,LiuJ.K. Aurovertin E,a new polyene pyrone fromthe basidiomycete Albatrellusconfluens[J].J.Antibiot., 2005,58:412–415.)。
培养基成分为马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4 1.5g，柠檬酸0.1g，盐酸硫胺素10mg，溶于1L去离子水中。选用500ml锥形瓶，加入培养基300ml。调整pH值为 6.5。在22℃和150rpm的摇床上进行发酵10天。
发酵结束后，发酵液(12L)用乙酸乙酯萃取两次。乙酸乙酯层减压浓缩，得到油状浸膏 1.1g，使用硅胶柱层析，以氯仿-甲醇体系梯度洗脱，得到Fr1部分18mg。Fr1部分进一步使用Sephadex LH-20凝胶柱纯化得到化合物aurovertin B(2.3mg，淡黄色黏液)。
实施例2、不同浓度aurovertin B对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231生长的影响
aurovertin B母液：实施例1制备的aurovertin B用DMSO配制成6mg/ml的aurovertin B母液，后续实验中用DMSO稀释至0.25mg/ml，而后5倍稀释5个浓度。
人源三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自中国科学院细胞库)以2×104个/孔接种于含有10％胎牛血清(FBS)的L-15培养基(GIBCO)的96孔板中，37℃培养细胞生长至融合状态后，每孔对应加入1μl各浓度aurovertin B稀释液，使aurovertin B终浓度分别为0.0004μg/ml、 0.002μg/ml、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.25μg/ml和1.25μg/ml，对照组加入1μlDMSO，37℃培养24h后，MTT法检测细胞的存活率，结果见图1。24h内，与正常对照组比，各给药组aurovertin B对MDA-MB-231细胞增殖无影响。说明aurovertin B对肿瘤细胞转移的抑制作用并非是通过抑制细胞生长来实现的。
实施例3、划痕修复实验检测aurovertin B对细胞迁移能力的影响
aurovertin B母液：实施例1制备的aurovertin B用DMSO配制成6mg/ml的aurovertin B母液，后续实验中用DMSO稀释至1.25mg/ml，而后5倍稀释5个浓度。
实验中以8×105细胞/孔的浓度，将MDA-MB-231细胞接种至含有10％胎牛血清(FBS)的 L-15培养基的24孔板中，37℃过夜。待细胞贴壁长成汇合后，用无菌移液器尖端枪头划痕，细胞用PBS洗涤3次，去除划下的细胞，每孔加入1ml无血清L-15培养基，给药组对应加入1μl 各浓度aurovertin B稀释液，使aurovertin B终浓度分别为0.0004μg/ml、0.002μg/ml、0.01μg/ml、 0.05μg/ml、0.25μg/ml和1.25μg/ml以加入1μlDMSO的1ml无血清L-15培养基为对照。在37℃、 5％CO2培养箱培养，过夜温育后，观察到给药组划痕宽度明显较对照组宽时拍照记录比较分析，结果见图2所示。实验结果显示，aurovertin B作用后各组划痕宽度明显小于初始划痕宽度，且给药组划痕宽度均明显大于对照组，给药组1.25μg/ml划痕相较于给药组0.25μg/ml较宽。结果表明，aurovertin B可有效抑制MDA-MB-231细胞迁移。
实施例4、粘附实验检测aurovertin B对细胞粘附能力的影响
aurovertin B母液：实施例1制备的aurovertin B用DMSO配制成6mg/ml的aurovertin B母液，后续实验中用DMSO稀释至0.25mg/ml，而后5倍稀释5个浓度。
用PBS磷酸盐缓冲液将层粘连蛋白FN(EMD，Millipore，Billerica，ca，USA)稀释至10μg/ml，96孔板每孔加入FN稀释液50μl，于37℃包被2h，凝胶后用PBS洗涤2次。以8×103细胞/孔的浓度种板，每孔加入含有不同浓度的aurovertin B稀释液(终浓度0.0004μg/ml、0.002μg/ml、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.25μg/ml和1.25μg/ml)的无血清L-15培养基1μL。放入 37℃、5％CO2培养箱培养，观察到对照组细胞呈现出良好的梭形形态，而给药组细胞形态不明显时，除去培养基，每孔加入50μl90％乙醇水溶液(v/v)固定粘附细胞。随后于显微镜下拍摄固定的细胞，结果见图3。实验结果显示，aurovertin B处理24h，给药组细胞形态与对照组有明显差异，aurovertin B 1.25μg/ml组细胞形态基本呈圆形，几乎不黏附，aurovertin B 0.01μg/ml组细胞形态大多呈圆形，只有少部分黏附，0.0004μg/ml组细胞大多呈梭形，大部分黏附，而对照组细胞基本都呈现细长梭形，基本完全黏附。结果表明，aurovertin B可有效抑制MDA-MB-231细胞黏附。
实施例5、Transwell细胞侵袭实验检测aurovertin B对细胞迁移能力的影响
aurovertin B母液：实施例1制备的aurovertin B用DMSO配制成6mg/ml的aurovertin B母液，后续实验中用DMSO稀释至0.25mg/ml，而后5倍稀释5个浓度。
Transwell侵袭试验以Transwell Boyden Chamber(Costar，USA)为Transwell小室，将 Transwell小室放入培养板中，以Transwell小室为上室，培养板内为下室，上下层培养液使用孔径为8μm的聚碳酸酯滤膜相隔。每孔上室滤膜表面加入25μg Matrigel(BD公司)，37℃下放置30min凝胶包被。随后在每个Matrigel上室加入0.2ml用含10％胎牛血清的L-15培养基配置的MDA-MB-231细胞悬液(5×105个细胞/ml)。待细胞贴壁后，用含1μl各浓度aurovertin B的无血清L-15培养基替换上室培养液，aurovertin B给药终浓度分别为0.0004μg/ml、0.002μg/ml、 0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.25μg/ml和1.25μg/ml，对照组为加入1μlDMSO的无血清L-15培养基。下室加入0.6ml含10％(v/v)趋化因子FBS的L-15培养基。在37℃、5％CO2培养箱孵育，观察到细胞侵袭至下室时，用棉签从聚碳酸酯滤膜的上层除去所有非移动细胞；于下室加入 600μl4％多聚甲醛固定迁移的细胞，20min后用0.1％结晶紫染色。随后在显微镜下(K15445， Nikon，日本)对染色的细胞照相(40×)和定量，然后用10％乙酸(v/v)萃取。在630nm 处测定吸光度值，并使用下式计算迁移抑制率：
抑制率＝[1-(ODaurovertin B-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)]×100％
ODaurovertin B为不同浓度aurovertin B实验孔，ODcontrol为对照孔，ODblank为未处理的原空白孔。
实验结果见图4所示，aurovertin B作用后给药组进入下室的细胞量明显少于对照组，与给药组0.01μg/ml相比，0.05μg/ml组进入下室的细胞量明显减少，相对抑制率分别为32.66％和 43.15％，各组细胞形态均相似。结果表明，aurovertin B可有效抑制MDA-MB-231细胞侵袭。
综上所述，aurovertin B对三阴乳腺癌癌细胞转移具有良好的抑制效果，可用于制备治疗肿瘤转移疾病的药物，是一种潜在的抗肿瘤转移药。

Claims (5)

1.Aurovertin B在制备预防或治疗肿瘤细胞转移药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述肿瘤转移药物为抑制肿瘤细胞迁移的药物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述肿瘤转移药物为抑制肿瘤细胞黏附的药物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞转移药物为三阴乳腺癌细胞转移药物。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于三阴乳腺癌细胞为MDA-MB-231细胞。
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