CN108845016A - 一种l-半胱氨酸自供能生物传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种L‑半胱氨酸（L‑Cys）自供能生物传感器的制备方法，该方法成功将酶生物燃料电池（EBFC）和碳布电极结合起来，利用EBFC输出电信号的变化实现L‑半胱氨酸的检测。自供能生物传感的设计主要集中于EBFC的阳极，富含胞嘧啶（C）的适配体修饰于阳极表面，当Ag⁺存在时，适配体中的C‑C碱基对能够选择性捕获Ag⁺形成稳定的DNA双链，将修饰葡萄糖氧化酶的共轭体固定在阳极表面，开路电压增大。当目标物L‑Cys存在时，L‑Cys与Ag⁺形成不溶性的硫醇盐，部分共轭体脱落，信号降低。开路电压值与L‑Cys浓度呈负相关，从而实现L‑Cys的检测。该传感器检测过程中无需外加电源、成本低廉、仪器简单、易于实现小型化。

Description

一种L-半胱氨酸自供能生物传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及一种L-半胱氨酸（L-Cys）自供能生物传感器的制备方法，设计一种基于酶生物燃料电池的自供能生物传感器的制备及其超灵敏检测L-Cys。

背景技术

酶生物燃料电池（EBFC）也称为生物电化学燃料电池，是将电化学能量转换效率与生物催化效率结合的混合系统，可以将化学能直接转化为电能。基于EBFC的自供能生物传感器，是一类将电池输出信号作为分析检测信号的传感器，该传感器信号与被检测分析物的浓度成比例关系。与传统的传感器相比，自供能生物传感器在检测过程中无需外加电源，其具体优点主要表现在：（1）抗干扰能力强。测试体系没有施加额外的电源，能有效避免易发生氧化还原的电活性物质在电极表面发生反应，从而提高了传感器的抗干扰能力；（2）仪器设备简单。检测过程不同于传统的电化学检测三电极体系，自供能生物传感器仅需两根电极，即EBFC的阴阳两极，即可实现检测；（3）实现简单、快速、实时检测。检测过程中可以摒弃昂贵复杂的电化学工作站和放大器，是植入式和便携式生物医疗设备的能量发生器。信号可以用简易电压表检测，能实现实时监测。

L-半胱氨酸（L-Cys）是天然蛋白质中一种重要的氨基酸，对维持生物系统的正常功能也至关重要，许多疾病与L-Cys的异常表达水平有关，如皮肤病变、老年痴呆症、肝肝功能损害、嗜睡、肌肉和脂肪的损失、生长缓慢和心血管疾病等。因此，建立简单、快速、准确、灵敏的L-Cys检测方法在生理和临床诊断领域具有重要意义。最常用检测L-Cys的方法主要有：原子吸收光谱法、高效液相色谱法、时间分辨光致发光光谱法、毛细管电泳法。虽然检测方法较多，但或灵敏度不够；或操作繁琐；或依赖大型仪器、分析成本高昂，难以满足准确、简单、快速、高灵敏的检测需求。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种基于EBFC的自供能生物传感器的制备方法，实现L-Cys的超高灵敏、高选择性检测，有助于监测L-Cys的异常表达。

本发明的目的是这样实现的：

一种L-半胱氨酸自供能生物传感器的制备方法，基于超薄多孔碳壳/金纳米颗粒复合物（UPCS/AuNPs）和碳布构建自供能生物传感器的阴极和阳极；

所述阳极的组装步骤如下：步骤1.将30~50 μL UPCS/AuNPs滴涂在碳布电极表面（1×1cm²），37 ℃干燥2~4 h后，将其浸在5~10 mg/mL EDC/NHS溶液中0.5~1 h，超纯水冲洗后涂滴上50~100 μL 1~5 mMDNA1，室温下放置12 h，加入20~50 μL浓度为1、5 mM的六巯基己醇（MCH）反应0.5~1 h，离心去除过量的MCH；

步骤2. 当0.2 μM~20 μM Ag⁺存在时，将20~50 μL DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs溶液滴涂于步骤1制得的电极表面，在37 ℃反应1~2 h，适配体中的C-C碱基选择性捕获Ag⁺，将修饰葡萄糖氧化酶的共轭体固定在电极表面，制得生物阳极。

所述的DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1. DNA2-GOD的制备：将50~100 μL 1~5 mM DNA2与2~5 mL 5~10 mg/mL的EDC/NHS溶液在室温下混合1~2 h，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）纯化8~10次；将400~600 μL 5~10 mg/mLGOD与1~2 mg 4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC）混合1~2 h，纯化去除多余的sulfo-SMCC；将活化的GOD与DNA2混合24~48 h，用PBS纯化8~10次除去未结合的DNA2；

步骤2. DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs的制备：5~10 mL N-GR/AuNPs与2~5 mL 5~10 mg/mL的EDC/NHS溶液混合，然后加入300~500 μL步骤1中制得的DNA2-GOD，在4 ℃条件下放置12~24 h；随后，加入20~50 μL浓度为1.5 mM的六巯基己醇（MCH）反应0.5~1 h，阻断非特异性结合位点，离心去除过量的MCH，沉淀物重新分散在pH 7.4的PBS溶液中，得到DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs；

所述的阴极的组装步骤如下：取30~50 μL UPCS/AuNPs滴涂在碳布电极表面，在37 ℃干燥2~4 h，将电极浸在3~6 mM pH 8.5的多巴胺溶液（DA）中，反应2~4 h，用超纯水冲洗；滴涂上20~50 μL 30~50 mg/mL的漆酶（laccase）孵育12~24 h，用超纯水洗涤后，在4 ℃条件下保存；

所述的L-半胱氨酸自供能生物传感器的制备方法制得的传感器的检测，包括如下步骤：

在不引入目标L-半胱氨酸（L-Cys）时，测量传感器的开路电压（E ^OCV ）；引入目标L-Cys时，不同浓度的L-Cys与生物阳极在37 ℃下孵育10~60 min后，测量传感器的开路电压E ^OCV ；

上述搭建的无膜葡萄糖/氧气传感器的支持电解液为含5 mM葡萄糖pH 7.4的0.1 MPBS缓冲体系。

积极有益效果：本发明是一种基于EBFC的自供能L-Cys传感器，实现L-Cys简单、方便、快速、灵敏、高选择性检测，相对现有的L-Cys检测方法，具有以下特点：

（1）本发明所述的自供能生物传感器，检测过程不同于传统的电化学检测三电极体系，自供能生物传感器仅需两根电极，即EBFC的阴阳两极，即可实现检测；

（2）本发明所述的自供能生物传感器测试体系没有施加额外的电源，能有效避免易发生氧化还原的电活性物质在电极表面发生反应，从而提高了传感器的抗干扰能力；

（3）本发明所述的自供能生物传感器采用L-Cys与Ag⁺形成不溶性的硫醇盐进行识别，不仅具有极高选择性，还具有成本低、操作简单等优点；

（4）本发明所述的自供能生物传感器中，UPCS/AuNPs具有电催化活性高、比表面积大、生物相容性好等优点，作为基底材料在EBFC阴阳极得失电子，实现对目标物L-Cys的超灵敏检测，大大提高了检测灵敏度；

（5）本发明所述的自供能生物传感器无需外加电源，可以摒弃昂贵复杂的电化学工作站和放大器，是植入式和便携式生物医疗设备的能量发生器，可实现L-Cys检测的微型化、便携化和集成化。

附图说明

图1. DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs组装过程示意图；

图2. 自供能L-Cys生物传感器阴阳极组装过程示意图；

图3. 自供能L-Cys生物传感器检测装置示意图；

图4. 基于EBFC的自供能生物传感器超灵敏检测L-Cys的原理示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步的说明：

一种DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs（DNA2-GOD bioconjugate N-GR/AuNPs）的制备方法，它由下列步骤组成：

步骤1.N-GR的制备：将30~60 mg 氧化石墨烯（GO）溶于30~50 mL去离子水中（pH 10，用30%氨水调pH），然后加入2~5 mL水合肼，搅拌10~30 min后，在200 ℃下加热3~5 h，用超纯水洗涤后，在60~80 ℃真空条件下干燥8 h；随后加入2~5 mL的PDDA，超声0.5~1 h，洗涤干燥；

步骤2. N-GR/AuNPs的制备：取30~50 μL制得的N-GR与5~10 mL 10~100 nM的AuNPs混合，在室温下平缓摇动一夜，离心（8000~12000，5~20 min）除去多余的AuNPs，得到N-GR/AuNPs；

步骤3. DNA2-GOD的制备：将50~100 μL 1~5 mM DNA2与2~5 mL 5~10 mg/mL的EDC/NHS溶液在室温下混合1~2 h，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）纯化8~10次；将400~600 μL 5~10 mg/mLGOD与1~2 mg 4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC）混合1~2 h，纯化去除多余的sulfo-SMCC；将活化的GOD与DNA2混合24~48 h，用PBS纯化8~10次除去未结合的DNA2；

步骤4. DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs的制备：取5~10 mL步骤2中制得的N-GR/AuNPs与2~5 mL 5~10 mg/mL的EDC/NHS溶液混合，然后加入300~500 μL步骤3中制得的DNA2-GOD，在4℃下放置12~24 h；随后，加入20~50 μL浓度为1、5 mM的MCH反应0.5~1 h，阻断非特异性结合位点，离心去除过量的MCH，沉淀物重新分散在pH 7.4的PBS溶液中，得到DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs，其组装过程如图1。

生物阳极DNA2-GOD bioconjugate NG-AuNPs/Ag⁺/MCH/DNA1/UPCS/AuNPs的制备方法，由下列步骤组成：

步骤1. UPCS的制备：1.5~3 g柠檬酸钠在140~160 ℃烘箱中干燥12~24 h后球磨12~24h，然后在氮气保护下，600~800 ℃下煅烧0.5~2 h，升温速率设为5~10 ℃min^-1。所得产品用1%的HCl和大量的去离子水清洗，直至滤液变为中性。最后，产品在80 ℃真空条件下干燥一夜，制得UPCS；

步骤2. 取3~10 mg步骤1制得的UPCS分散在1~2倍于UPCS质量的1% PDDA的盐溶液中，超声0.5~1 h溶解，将上述溶液离心（8000~12000，5~20 min）去除剩余的PDDA，干燥后得到PDDA修饰的UPCS；

步骤3. 取3~10 mg步骤2中制得的UPCS/PDDA与2~8 mL浓度为10~100 nM的AuNPs相混合，在室温下平缓摇动一夜，离心（8000~12000，5~20 min）除去多余的AuNPs，得到UPCS/AuNPs；

步骤4. 将30~50 μL步骤3中制得的UPCS/AuNPs滴涂在碳布电极表面，在37 ℃条件下干燥2~4 h后，接着将电极沉浸在5~10 mg/mL的EDC/NHS溶液中0.5~1 h，随后，用超纯水冲洗过量的EDC/NHS溶液；

步骤5. 将50~100 μL 1~5 mM DNA1涂滴到步骤4中活化电极的表面，在室温下放置12h，随后加入20~50 μL浓度为1、5 mM的六巯基己醇（MCH）反应0.5~1 h，阻断非特异性结合位点，离心去除过量的MCH；

步骤6. 当0.2 μM~20 μM Ag⁺存在时，将20~50 μL DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs溶液滴涂于步骤5制得的电极表面，在37 ℃条件下反应1~2 h，适配体中的C-C碱基对能够选择性捕获Ag⁺，将修饰葡萄糖氧化酶的共轭体固定在电极表面，制得DNA2-GOD bioconjugateNG-AuNPs/Ag⁺/MCH/DNA1/UPCS/AuNPs生物阳极，其组装过程如图2。

生物阴极laccase/PDA/UPCS/AuNPs的制备方法，由以下步骤组成：

取30~50 μL制得的UPCS/AuNPs滴涂在碳布电极表面，在37 ℃条件下干燥2~4 h后，随后将电极沉浸在3~6 mM pH 8.5的多巴胺溶液（PDA）中，反应2~4 h，随后，用超纯水冲洗过量未反应的多巴胺溶液；接着在电极表面滴涂20~50 μL 30~50 mg/mL的漆酶（laccase）孵育12~24 h，用超纯水洗涤后，在4 ℃储存备用，其组装过程如图2。

一种自供能L-Cys生物传感器的搭建及测量，由下列步骤组成：

步骤1.在不引入目标L-Cys时，测量传感器的E ^OCV ；

步骤2. 引入目标L-Cys时，不同浓度的L-Cys与生物阳极在37 ℃下孵育10~60 min后，再次测量传感器的E ^OCV ；

上述搭建的无膜葡萄糖/氧气传感器的支持电解液为含5 mM葡萄糖pH 7.4的0.1 MPBS缓冲体系，测量装置如图3。

基于EBFC的自供能生物传感器超灵敏检测L-Cys的原理如图4所示：

当无目标物L-Cys存在时，适配体中的C-C碱基对能够选择性捕获Ag⁺形成稳定的DNA双链，将修饰葡萄糖氧化酶的共轭体固定在阳极表面，此时，EBFC的开路电压较大；当引入目标L-Cys时，L-Cys与Ag⁺形成不溶性的硫醇盐，部分DNA2-GOD bioconjugate NG-AuNPs脱离阳极表面，葡萄糖氧化酶减少，随着引入L-Cys浓度的增加，脱离阳极表面共轭体的量增加，从而导致EBFC的开路电压减低，通过开路电压减少值与目标L-Cys的对应关系得出L-Cys含量。

实施例1

通过捕获Ag⁺固定共轭体构建自供能生物传感器用于L-Cys的检测：

（1）N-GR/AuNPs的制备：将60 mg GO溶于30 mL去离子水中（pH 10，用30%氨水调pH），然后加入2 mL水合肼，搅拌10 min后，在200 ℃下加热3 h，用超纯水洗涤后，在80 ℃真空条件下干燥8 h；取5 mg上述N-GR分散在5 mL浓度为1%的PDDA的盐溶液中，超声1 h溶解，将上述溶液离心去除剩余的PDDA（8000，10 min），得到PDDA修饰的N-GR；将上述沉淀物与5 mL浓度为10 nM的AuNPs相混合，在室温下平缓摇动一夜，离心（8000，10 min）除去多余的AuNPs，最终得到的产物重新分散得浓度为1 mgmL^-1 N-GR/AuNPs；

（2）DNA2-GOD的制备：将60 μL 1 mM DNA2与2 mL 10 mg/mL的EDC/NHS溶液在室温下混合1 h，用PBS纯化8次；将400 μL 5 mg/mL GOD与1 mg 4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC）混合1 h，纯化去除多余的sulfo-SMCC；将活化的GOD与DNA2混合48 h，用PBS纯化8次除去未结合的DNA2；

（3）DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs的组装：取5.5 mL步骤（1）中制得的N-GR/AuNPs与2 mL10 mg/mL的EDC/NHS溶液混合，然后加入400 μL步骤2中制得的DNA2-GOD，在4 ℃条件下储存12 h；随后，加入40 μL浓度为1 mM的六巯基己醇（MCH）反应0.5 h，阻断非特异性结合位点，离心去除过量的MCH，沉淀物重新分散在pH 7.4的PBS溶液中，得到DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs；

（4）UPCS的制备：2 g柠檬酸钠在150 ℃烘箱中干燥24 h后球磨12 h，然后在氮气保护下，800 ℃条件下煅烧0.5 h，升温速率设为5 ℃min^-1。所得产品用1%的HCl和大量的去离子水清洗，直至滤液变为中性。最后，产品在80 ℃真空条件下干燥一夜，制得UPCS；

（5）UPCS/AuNPs的制备：取5 mg步骤（4）制得的UPCS分散在5 mL浓度为1%的PDDA的盐溶液中，超声0.5 h溶解，将上述溶液离心去除剩余的PDDA（8000，10 min），得到PDDA修饰的UPCS；将上述沉淀物与5 mL浓度为10 nM的AuNPs相混合，在室温下平缓摇动一夜，离心（8000，10 min）除去多余的AuNPs，最终得到的产物重新分散得浓度为1 mgmL^-1 UPCS/AuNPs；

（6）DNA2-GOD bioconjugate NG-AuNPs/Ag⁺/MCH/DNA1/UPCS/AuNPs生物阳极的制备：取50 μL步骤（5）中制得的UPCS/AuNPs滴涂在碳布电极表面，在37 ℃条件下干燥2 h后，接着将电极沉浸在10 mg/mL的EDC/NHS溶液中0.5 h，随后，用超纯水冲洗过量的EDC/NHS溶液；将75 μL 1 mM DNA1涂滴到上述活化电极的表面，在室温下储存12 h，随后加入20 μL浓度为1 mM MCH反应0.5 h，阻断非特异性结合位点，离心去除过量的MCH；当8 μM Ag⁺存在时，将50 μL DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs溶液滴涂于电极表面，在37 ℃条件下反应1 h，制得DNA2-GOD bioconjugate NG-AuNPs/Ag⁺/MCH/DNA1/UPCS/AuNPs生物阳极，在4 ℃条件下储存备用；

（7）laccase/PDA/UPCS/AuNPs生物阴极的制备：取50 μL步骤（5）中制得的UPCS/AuNPs滴涂在碳布电极表面，在37 ℃条件下干燥2 h后，随后将电极沉浸在6 mM pH 8.5的PDA溶液中，反应3 h，随后，用超纯水冲洗过量未反应的多巴胺溶液；接着在电极表面滴涂50 μL30 mg/mL的laccase孵育12 h，用超纯水洗涤后，在4 ℃条件下储存备用；

（8）自供能L-Cys生物传感器的搭建及测量：在不引入目标L-Cys时，测量传感器的E ^OCV 。引入目标L-Cys时，不同浓度的L-Cys与生物阳极在37 ℃条件下孵育20 min后，再次测量传感器的E ^OCV ；

上述搭建的无膜葡萄糖/氧气传感器的支持电解液为含5 mM葡萄糖pH 7.4的0.1 MPBS缓冲体系；

DNA1适配体序列：5’-NH₂-C₆-CTC TCT CTC TCT CTC TCT CTC-3’

DNA2适配体序列：5’-NH₂-C₆-CAC ACA CAC ACA CAC ACA CAC-3’。

实施例2

通过捕获Hg²⁺固定共轭体构建自供能生物传感器用于L-Cys的检测

（6）DNA2-GOD bioconjugate NG-AuNPs/Hg²⁺/MCH/DNA1/UPCS/AuNPs生物阳极的制备：取50 μL UPCS/AuNPs滴涂在碳布电极表面，在37 ℃条件下干燥2 h后，接着将电极沉浸在10 mg/mL的EDC/NHS溶液中0.5 h，随后，用超纯水冲洗过量的EDC/NHS溶液；将75 μL 1mMDNA1涂滴到上述活化电极的表面，在室温下储存12 h，随后加入20 μL浓度为1 mM MCH反应0.5 h，阻断非特异性结合位点，离心去除过量的MCH；当15 μM Hg²⁺存在时，将50 μLDNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs溶液滴涂于电极表面，在37 ℃下反应1.5 h，制得DNA2-GODbioconjugate NG-AuNPs/Hg²⁺/MCH/DNA1/UPCS/AuNPs生物阳极，在4 ℃条件下储存备用；

DNA1适配体序列：5’-NH₂-C₆-CTC TCT CTC TCT CTC TCT CTC-3’

DNA2适配体序列：5’-NH₂-C₆-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-3’

其余步骤同实施方案1。

本发明基于EBFC构建L-Cys自供能生物传感器。EBFC的组装是自供能生物传感器设计的核心，本发明的自供能设计主要集中EBFC的阳极。当Ag⁺存在时，适配体中的C-C碱基对能够选择性捕获Ag⁺形成稳定的DNA双链，将DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs固定在适配体修饰的阳极表面，由于葡萄糖的氧化，进而促进生物阳极的催化性能。当目标物L-Cys存在时，L-Cys与Ag⁺形成不溶性的硫醇盐，部分共轭体脱落，EBFC输出电压降低，用于定量检测L-Cys。本发明设计的基于EBFC的自供能L-Cys生物传感器，可实现目标物简单、快速、灵敏、高效检测。

Claims (5)

1.一种L-半胱氨酸自供能生物传感器的制备方法，其特征在于：基于超薄多孔碳壳/金纳米颗粒复合物（UPCS/AuNPs）和碳布构建自供能生物传感器的阴极和阳极。

2.根据权利要求1所述的一种L-半胱氨酸自供能生物传感器的制备方法，其特征在于：所述阳极的组装步骤如下：

步骤1.将30~50 μL UPCS/AuNPs滴涂在碳布电极表面（1×1 cm²），37 ℃干燥2~4 h后，将其浸在5~10 mg/mL EDC/NHS溶液中0.5~1 h，超纯水冲洗后涂滴上50~100 μL 1~5 mMDNA1，室温下放置12 h，加入20~50 μL浓度为1、5 mM的六巯基己醇（MCH）反应0.5~1 h，离心去除过量的MCH；

步骤2.当0.2 μM~20 μM Ag⁺存在时，将20~50 μL DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs溶液滴涂于步骤1制得的电极表面，在37 ℃反应1~2 h，适配体中的C-C碱基选择性捕获Ag⁺，将修饰葡萄糖氧化酶的共轭体固定在电极表面，制得生物阳极。

3.如权利要求2所述的DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1. DNA2-GOD的制备：将50~100 μL 1~5 mM DNA2与2~5 mL 5~10 mg/mL的EDC/NHS溶液在室温下混合1~2 h，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）纯化8~10次；将400~600 μL 5~10 mg/mLGOD与1~2 mg 4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC）混合1~2 h，纯化去除多余的sulfo-SMCC；将活化的GOD与DNA2混合24~48 h，用PBS纯化8~10次除去未结合的DNA2；

步骤2. DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs的制备：5~10 mL N-GR/AuNPs与2~5 mL 5~10 mg/mL的EDC/NHS溶液混合，然后加入300~500 μL步骤1中制得的DNA2-GOD，在4 ℃条件下放置12~24 h；随后，加入20~50 μL浓度为1.5 mM的六巯基己醇（MCH）反应0.5~1 h，阻断非特异性结合位点，离心去除过量的MCH，沉淀物重新分散在pH 7.4的PBS溶液中，得到DNA2-GOD共轭体N-GR/AuNPs。

4.根据权利要求1所述的一种L-半胱氨酸自供能生物传感器的制备方法，其特征在于：所述的阴极的组装步骤如下：

取30~50 μL UPCS/AuNPs滴涂在碳布电极表面，在37 ℃干燥2~4 h，将电极浸在3~6 mMpH 8.5的多巴胺溶液（DA）中，反应2~4 h，用超纯水冲洗；滴涂上20~50 μL 30~50 mg/mL的漆酶（laccase）孵育12~24 h，用超纯水洗涤后，在4 ℃条件下保存。

5.如权利要求1所述的L-半胱氨酸自供能生物传感器的制备方法制得的传感器的检测，其特征在于，包括如下步骤：

在不引入目标L-半胱氨酸（L-Cys）时，测量传感器的开路电压（E ^OCV ）；引入目标L-Cys时，不同浓度的L-Cys与生物阳极在37 ℃下孵育10~60 min后，测量传感器的开路电压E ^OCV ；

上述搭建的无膜葡萄糖/氧气传感器的支持电解液为含5 mM葡萄糖pH 7.4的0.1 MPBS缓冲体系。