CN108841757A - 一种乳酸细菌菌种保藏方法 - Google Patents

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刘彩云
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Abstract

本发明公开了一种乳酸细菌菌种保藏方法，属于菌种保藏领域，以解决现有方法存在的无法再次长期保藏的问题。包括（1）配制乳酸细菌菌种保藏培养基；（2）乳酸细菌保藏菌种培养物的制备；（3）乳酸细菌菌体收集；（4）乳酸细菌菌体添加冷冻保护剂；（5）乳酸细菌菌体包埋粒制备；（6)乳酸细菌菌体包埋粒低温保藏。本发明具有保藏乳酸细菌菌种适用范围广、存活率高、保藏期长、携带方便、复苏简便，保藏乳酸细菌菌种活化传代后，可继续保藏重复使用的优点。本发明有效保证了乳酸细菌菌种保藏时的存活数量，保藏方法简便易行，经济适用，也可供其它细菌保藏参考使用。

Description

一种乳酸细菌菌种保藏方法
技术领域
本发明属于菌种保藏领域，具体涉及一种乳酸细菌菌种保藏方法。
背景技术
乳酸细菌是能利用可发酵的碳水化合物产生大量乳酸的一类细菌。这类细菌在自然界分布广泛，种类繁多，它们是研究分类、生物化学、遗传学、分子生物学、基因工程的理想材料，在科研理论上具有重要意义，在工业、农牧业、食品和医药保健等与人类生活密切相关的重要领域中也具有极高的应用价。微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。乳酸细菌与其它微生物一样，菌种保藏就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌，能够长期在研究、生产上应用。为了能较长期地保持菌种的特性，防止菌种的衰退和死亡，人们创造了许多保藏菌种的方法，常用的菌种保藏方法有：定期移植保藏法，石蜡油封藏法，沙土保藏法，真空冷冻干燥保藏法和液氮低温保藏法等。
目前生产或研究日常使用中乳酸细菌菌种保藏方法主要采用试管定期移植保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，缺点是保藏时间较短，保藏的菌种稳定性不好，易发生变异和退化，携带不方便等；长期保存采用真空冷冻干燥保藏法、液氮低温保藏法，但液氮低温保藏法维护成本较高，真空冷冻干燥保藏法需要特殊设备，且菌种在活化过程中为一次性开启，使用完毕后，无法再次长期保藏。
发明内容
本发明的目的是提供一种一种乳酸细菌菌种保藏方法，以解决现有方法存在的无法再次长期保藏的问题。
本发明技术方案如下：一种乳酸细菌菌种保藏方法，包括下列步骤：
（1）乳酸细菌保藏菌种培养物的制备：
A、普通培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃，培养18 h—36h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于菌种保藏；
B、高密度培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃培养，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH至6.0—6.5之间，培养20—36 h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于乳酸细菌菌种保藏；
（2) 乳酸细菌菌体收集：乳酸细菌保藏菌种培养物进行离心，收集乳酸细菌菌体；设置离心机温度为0℃—8℃，离心转速为3000 r/min—9000 r/min、离心时间为10 分钟—30分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的乳酸细菌菌体备用；
（3）乳酸细菌菌体添加冷冻保护剂：将脱脂牛奶或脱脂奶粉、葡萄糖和蒸馏水在118℃—121℃加压蒸汽灭菌10—15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌；将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/100—1/10的冷冻保护剂混匀制备出活菌数量在109 CFU/mL—1011 CFU/mL乳酸细菌菌悬液；
（4）乳酸细菌菌体包埋粒制备：将添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液与灭菌包埋材料溶液混合，搅拌均匀后，挤入固化剂，慢速搅拌5 分钟—30 分钟，制备出乳酸细菌保藏菌种包埋粒，包埋粒直径为1 mm—3 mm，包埋材料溶液由2—10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90—98重量份的水配制而成，食用海藻酸钠与食用明胶的重量配比为1—5:1；包埋材料溶液占50—90份，添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液占10—50份，固化剂为0.1 mol/L—1 mol/L灭菌氯化钙溶液；
（5)乳酸细菌菌体包埋粒低温保藏：将乳酸细菌保藏菌种菌体包埋粒加入灭菌甘油进行混合，甘油体积比浓度为25%—45%，-70℃—4℃低温保存。
作为本发明的进一步改进，所述乳酸细菌为乳酸杆菌，其保藏培养基组成和重量配比为，蛋白胨5—10份、牛肉浸粉3—8份、酵母浸粉2—6份、葡萄糖5—20份、磷酸氢二钾1—2份、柠檬酸氢二铵1—2份、乙酸钠3—5份、硫酸镁0.1—0.2份、硫酸锰0.02—0.04份、碳酸钙10—20份、吐温-801—2份和水1000份，pH值6.0—7.5，118℃—121℃加压蒸汽灭菌15—20分钟，备用。
作为本发明的进一步改进，所述乳酸细菌为乳酸球菌，其保藏培养基组成和重量配比为，大豆胨3—5份、蛋白胨2.5—5份、酪蛋白胨2.5—5份、酵母浸粉2—3份、牛肉浸粉3—5份、乳糖3—10份、抗坏血酸钠0.3—0.5份、甘油磷酸钠15—20份、硫酸镁0.2—0.3份、碳酸钙10—20份和水1000份，pH 值6.0—7.5，118℃—121℃加压蒸汽灭菌 15—20分钟，备用。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（3）中冷冻保护剂的组成和重量配比为，脱脂牛奶或脱脂奶粉5—30份、葡萄糖0.5—5份、抗坏血酸0.1—1份和蒸馏水100份。
本发明根据乳酸细菌菌种的生理、生化特性，在人为创造的条件下尽量降低细胞的新陈代谢，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，并减低菌种的变异率，保证在贮藏期内有足够的活细菌数，创造有利于乳酸细菌保藏的一些方法措施，为乳酸细菌保藏提供一条新的途径，解决乳酸细菌在日常使用和长期保存保藏中存在的一些问题。
本发明通过对乳酸细菌普通培养或高密度培养后进行菌体收集，包埋，加入甘油进行低温保藏。本发明方法包埋粒中乳酸细菌总活菌数大于1×109 CFU/g，本发明的保藏方法具有保存期长，复苏简便，可重复多次使用优点。在4℃保藏期为1年，在-20℃保藏期为3年，在-70℃以下保藏期为5年。本发明的保藏方法乳酸细菌保藏菌种包埋粒复苏传代后，包埋粒可以继续低温保藏，乳酸细菌保藏菌种在保藏过程中使用方法简便，可反复活化保藏使用5代，适用范围广、存活率高、保藏期长、复苏简便、携带方便等优点，可适用于科研和生产的日常保存和长期保存。本发明有效保证了乳酸细菌菌种保藏时的存活数量，保藏方法简便易行，经济适用，也可供其它细菌保藏参考使用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但是这些实施例，不用来限制本发明的范围。实施例中的乳酸细菌是现有的。
实施例1：
配制保藏培养基，乳酸杆菌保藏培养基组成为，蛋白胨10 g、牛肉浸粉 8 g、酵母浸粉2 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸氢二铵2 g、乙酸钠5 g、硫酸镁 0.2 g、硫酸锰0.04 g、碳酸钙20 g、吐温-80 2 g和水1000 g，pH值7.0， 121℃加压蒸汽灭菌15分钟，备用。
德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）培养物的制备，将德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种接入乳酸杆菌保藏培养基，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH为6.5，37℃培养24 h后，终止培养。将德氏乳杆菌保加利亚亚种培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为4℃，离心转速为6000 r/min，离心时间为15 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/10保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂牛奶30 g、葡萄糖5 g、抗坏血酸0.5 g和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在118℃加压蒸汽灭菌15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。称取食用明胶，加入加热至75℃，包埋材料溶液总体积80%蒸馏水中，搅拌至完全溶解，再加入食用海藻酸钠，继续搅拌至成为透明溶液，121℃加压蒸汽灭菌20分钟，备用。包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按2:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中50 g。菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按1:1混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入0.5mol/L氯化钙溶液，形成3 mm直径的德氏乳杆菌保加利亚亚种包埋粒，慢速搅拌15分钟，过滤，用无菌水洗涤乳酸杆菌德氏乳杆菌保加利亚亚种包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为45%灭菌甘油中， -70℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为45%灭菌甘油中， -70℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例2：
配制保藏培养基，乳酸球菌保藏培养基组成为，大豆胨5 g、蛋白胨5 g、酪蛋白胨2.5g、酵母浸粉3 g、牛肉浸粉3 g、乳糖10 g、抗坏血酸钠0.5 g、甘油磷酸钠20 g、硫酸镁0.3g、碳酸钙20 g和水1000 g，pH 值7.0， 121℃加压蒸汽灭菌15分钟，备用。
嗜热链球菌培养物(Streptococcus thermophilus)的制备，将嗜热链球菌菌种接入乳酸球菌保藏培养基，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH为6.5，42℃培养20 h后，终止培养。将嗜热链球菌培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为4℃，离心转速为6000 r/min，离心时间为15 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的嗜热链球菌菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/100保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂牛奶30 g、葡萄糖3 g、抗坏血酸0.1 g和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在121℃加压蒸汽灭菌10分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。称取食用明胶，加入加热至75℃，包埋材料溶液总体积80%蒸馏水中，搅拌至完全溶解，再加入食用海藻酸钠，继续搅拌至成为透明溶液，121℃加压蒸汽灭菌20分钟，备用。包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按2:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中50 g，菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按1:1混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入1 mol/L氯化钙溶液，形成1 mm直径的嗜热链球菌包埋粒，慢速搅拌30 分钟，过滤，用无菌水洗涤嗜热链球菌包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为45%灭菌甘油中， -70℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为45%灭菌甘油中， -70℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例3：
配制保藏培养基，乳酸杆菌保藏培养基组成为，蛋白胨5 g、牛肉浸粉 3 g、酵母浸粉 6g、葡萄糖5 g、磷酸氢二钾1 g、柠檬酸氢二铵 1 g、乙酸钠 3 g、硫酸镁0.1 g、硫酸锰0.02g、碳酸钙10 g、吐温-80 1 g和水1000 g，pH值6.0， 118℃加压蒸汽灭菌15分钟，备用。嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)培养物的制备，将嗜酸乳杆菌菌种接入乳酸杆菌保藏培养基，在30℃培养36 h后，终止培养。将嗜酸乳杆菌培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为0℃，离心转速为9000 r/min，离心时间为10 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的嗜酸乳杆菌菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/50保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂奶粉5 g、葡萄糖5 g、抗坏血酸1g份和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在118℃加压蒸汽灭菌20分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按1:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中100g，菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按9:1混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入1 mol/L氯化钙溶液，形成1 mm直径的嗜酸乳杆菌包埋粒，慢速搅拌5 分钟，过滤，用无菌水洗涤乳酸杆菌嗜酸乳杆菌包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为40%灭菌甘油中， -70℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为40%灭菌甘油中， -20℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例4：
配制保藏培养基，乳酸球菌保藏培养基组成和重量配比，大豆胨3 g、蛋白胨2.5 g、酪蛋白胨5 g、酵母浸粉2 g、牛肉浸粉5 g、乳糖3 g、抗坏血酸钠0.3 g、甘油磷酸钠15 g、硫酸镁0.2 g、碳酸钙10 g和水1000 g，pH 值6.0， 118℃加压蒸汽灭菌20分钟，备用。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)培养物的制备，将乳酸乳球菌菌种接入乳酸球菌保藏培养基，在37℃培养24 h后，终止培养。将乳酸乳球菌培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为8℃，离心转速为3000 r/min，离心时间为30 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的乳酸乳球菌菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/10保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂牛奶25 g、葡萄糖5 g、抗坏血酸1 g份和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在121℃加压蒸汽灭菌10分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按3:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中90 g，菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按4:1混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入0.1mol/L氯化钙溶液，形成2 mm直径的乳酸乳球菌包埋粒，慢速搅拌20 分钟，过滤，用无菌水洗涤乳酸乳球菌包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为40%灭菌甘油中， -20℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为40%灭菌甘油中， -20℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例5：
配制保藏培养基，乳酸杆菌保藏培养基组成为，蛋白胨8 g、牛肉浸粉6 g、酵母浸粉 5g、葡萄糖 15g、磷酸氢二钾1.5 g、柠檬酸氢二铵 1.5 g、乙酸钠 4 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.03份g、碳酸钙15 g、吐温-80 2 g和水1000 g，pH值7.5，118℃加压蒸汽灭菌20分钟，备用。瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)培养物的制备，将瑞士乳杆菌接入乳酸杆菌保藏培养基，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH为6.5，35℃培养20 h后，终止培养。将瑞士乳杆菌培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为5℃，离心转速为5000 r/min，离心时间为25 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的瑞士乳杆菌菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/20保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂奶粉5 g、葡萄糖5 g、抗坏血酸0.5 g份和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在118℃加压蒸汽灭菌15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。称取食用明胶，加入加热至75℃，包埋材料溶液总体积80%蒸馏水中，搅拌至完全溶解，包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按4:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中80 g，菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按7:3混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入0.3mol/L氯化钙溶液，形成3 mm直径的瑞士乳杆菌包埋粒，慢速搅拌25 分钟，过滤，用无菌水洗涤乳酸杆菌瑞士乳杆菌包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为30%灭菌甘油中， -20℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为30%灭菌甘油中，-20℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例6：
配制保藏培养基，乳酸球菌保藏培养基组成和重量配比，大豆胨4 g、蛋白胨4 g、酪蛋白胨4 g、酵母浸粉2.5 g、牛肉浸粉4 g、乳糖8 g、抗坏血酸钠0.4 g、甘油磷酸钠18 g、硫酸镁0.2 g、碳酸钙15 g和水1000 g，pH 值7.5， 121℃加压蒸汽灭菌15分钟，备用。乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)培养物的制备，将乳明串珠菌菌种接入乳酸球菌保藏培养基，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH为6.5，40℃培养36 h后，终止培养。将乳明串珠菌培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为5℃，离心转速为4000 r/min，离心时间为20 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的乳明串珠菌菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/30保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂牛奶20 g、葡萄糖3 g、抗坏血酸0.1 g份和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在118℃加压蒸汽灭菌15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按5:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中70 g，菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按5:1混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入1 mol/L氯化钙溶液，形成1mm直径的乳明串珠菌包埋粒，慢速搅拌5 分钟，过滤，用无菌水洗涤乳明串珠菌包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为30%灭菌甘油中， 4℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为30%灭菌甘油中， 4℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例7：
配制保藏培养基，乳酸杆菌保藏培养基组成为，蛋白胨6 g、牛肉浸粉 6 g、酵母浸粉 3g、葡萄糖10 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸氢二铵 2 g、乙酸钠 4 g、硫酸镁 0.1 g、硫酸锰0.04份g、碳酸钙10 g、吐温-80 2 g和水1000 g，pH值6.5， 121℃加压蒸汽灭菌15分钟，备用。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)培养物的制备，将干酪乳杆菌接入乳酸杆菌保藏培养基，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH为6.5，37℃培养36 h后，终止培养。将干酪乳杆菌培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为4℃，离心转速为6000 r/min，离心时间为15 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的干酪乳杆菌菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/40保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂牛奶25 g、葡萄糖2 g、抗坏血酸1 g份和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在121℃加压蒸汽灭菌10分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按2:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中60 g，菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按1:1混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入0.5mol/L氯化钙溶液，形成3 mm直径的干酪乳杆菌包埋粒，慢速搅拌30 分钟，过滤，用无菌水洗涤干酪乳杆菌乳杆菌包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为25%灭菌甘油中， 4℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为25%灭菌甘油中， 4℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例8：
配制保藏培养基，乳酸球菌保藏培养基组成和重量配比，大豆胨3g、蛋白胨3 g、酪蛋白胨2.5 g、酵母浸粉3 g、牛肉浸粉5 g、乳糖6 g、抗坏血酸钠0.5 g、甘油磷酸钠20 g、硫酸镁0.3 g、碳酸钙10 g和水1000 g，pH 值6.5， 118℃加压蒸汽灭菌20分钟，备用。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)培养物的制备，将粪肠球菌菌种接入乳酸球菌保藏培养基，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH为6.5，35℃培养30 h后，终止培养。将粪肠球菌培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为4℃，离心转速为6000 r/min，离心时间为15 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的粪肠球菌菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/60保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂牛奶5 g、葡萄糖5 g、抗坏血酸1 g份和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在118℃加压蒸汽灭菌15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按2:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中40 g，菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按1:1混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入0.5mol/L氯化钙溶液，形成3 mm直径的粪肠球菌包埋粒，慢速搅拌30 分钟，过滤，用无菌水洗涤粪肠球菌包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为30%灭菌甘油中， -20℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为30%灭菌甘油中， -20℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例9：
配制保藏培养基，乳酸杆菌保藏培养基组成为，蛋白胨10 g、牛肉浸粉 8 g、酵母浸粉2 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸氢二铵 2 g、乙酸钠 5 g、硫酸镁 0.2 g、硫酸锰0.04份g、碳酸钙20 g、吐温-80 2 g和水1000 g，pH值7.5， 121℃加压蒸汽灭菌20分钟，备用。发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)培养物的制备，将发酵乳杆菌接入乳酸杆菌保藏培养基，在30℃培养36 h后，终止培养。将发酵乳杆菌培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为4℃，离心转速为6000 r/min，离心时间为15 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的发酵乳杆菌菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/60保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂牛奶10 g、葡萄糖4 g、抗坏血酸2 g份和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在121℃加压蒸汽灭菌10分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按2:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中30g，菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按1:1混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入0.5mol/L氯化钙溶液，形成1 mm直径的发酵乳杆菌包埋粒，慢速搅拌30 分钟，过滤，用无菌水洗涤发酵乳杆菌包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为45%灭菌甘油中， -70℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为45%灭菌甘油中， -70℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例10：
配制保藏培养基，乳酸球菌保藏培养基组成和重量配比，大豆胨g、蛋白胨5 g、酪蛋白胨2.5 g、酵母浸粉3 g、牛肉浸粉3 g、乳糖10 g、抗坏血酸钠0.5 g、甘油磷酸钠20 g、硫酸镁0.3 g、碳酸钙20 g和水1000 g，pH 值7.5， 121℃加压蒸汽灭菌20分钟，备用。乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)培养物的制备，将乳酸乳球菌乳亚种菌种接入乳酸球菌保藏培养基，在40℃培养30 h后，终止培养。将乳酸乳球菌乳亚种培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为4℃，离心转速为6000 r/min，离心时间为15 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的乳酸乳球菌乳亚种菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/70保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂牛奶25 g、葡萄糖0.5 g、抗坏血酸0.1 g份和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在118℃加压蒸汽灭菌15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按2:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中20 g，菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按1:1混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入0.5mol/L氯化钙溶液，形成1 mm直径的乳酸乳球菌乳亚种包埋粒，慢速搅拌30 分钟，过滤，用无菌水洗涤乳酸乳球菌乳亚种包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为45%灭菌甘油中， -70℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为45%灭菌甘油中， -70℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例11：
配制保藏培养基，乳酸杆菌保藏培养基组成为，蛋白胨10 g、牛肉浸粉 8 g、酵母浸粉2 g、葡萄糖 20 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸氢二铵 2 g、乙酸钠 5 g、硫酸镁 0.2 g、硫酸锰0.04份g、碳酸钙20 g、吐温-80 2 g和水1000 g，pH值7.5， 121℃加压蒸汽灭菌20分钟，备用。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)培养物的制备，将植物乳杆菌接入乳酸杆菌保藏培养基，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH为6.5，4℃培养20 h后，终止培养。将植物乳杆菌培养菌液进行离心收集菌体，设置离心机温度为4℃，离心转速为6000 r/min，离心时间为15 分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的植物乳杆菌菌体。将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/80保护剂混合制成均匀的菌悬液，冷冻保护剂的组成为脱脂牛奶20 g、葡萄糖1 g、抗坏血酸0.5 g份和蒸馏水100 g， 将脱脂牛奶、葡萄糖和蒸馏水在118℃加压蒸汽灭菌15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌。包埋材料由食用海藻酸钠和明胶按2:1比例配制，二者之和在每升包埋材料溶液中50 g，菌体包埋，灭菌包埋材料溶液与菌悬液按1:1混合，搅拌均匀后，通过挤压机挤入0.5mol/L氯化钙溶液，形成3 mm直径的植物乳杆菌包埋粒，慢速搅拌30 分钟，过滤，用无菌水洗涤植物乳杆菌包埋粒5分钟，最后加入到的体积比为40%灭菌甘油中， -20℃贮存。保藏菌种复苏，保藏菌种包埋粒放于室温下融化，用灭菌的接种环挑取若干包埋粒，加入液体培养基中，置于适宜的温度下进行培养，培养结束后回收包埋粒，继续加入到的体积比为40%灭菌甘油中，-20℃贮存，可重复复苏5次。以上所有步骤必需严格的遵守无菌操作。
实施例12：重复实施例1，有以下不同点，保藏菌种为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
实施例13：重复实施例3，有以下不同点，保藏菌种为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)。

Claims (4)

1.一种乳酸细菌菌种保藏方法，其特征在于包括下列步骤：
（1）乳酸细菌保藏菌种培养物的制备：
A、普通培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃，培养18 h—36h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于菌种保藏；
B、高密度培养，将乳酸细菌菌种接入保藏培养基，30℃—42℃培养，在培养液pH值低于5.0时，用氢氧化钠溶液调节pH至6.0—6.5之间，培养20—36 h后，以菌龄为对数期末期，细胞形态整齐，活菌数量最高时终止培养，用于乳酸细菌菌种保藏；
（2) 乳酸细菌菌体收集：乳酸细菌保藏菌种培养物进行离心，收集乳酸细菌菌体；设置离心机温度为0℃—8℃，离心转速为3000 r/min—9000 r/min、离心时间为10 分钟—30分钟，离心结束后除去上清液，收集沉淀的乳酸细菌菌体备用；
（3）乳酸细菌菌体添加冷冻保护剂：将脱脂牛奶或脱脂奶粉、葡萄糖和蒸馏水在118℃—121℃加压蒸汽灭菌10—15分钟，抗坏血酸采用过滤除菌；将离心收集的菌体与离心前培养液原体积1/100—1/10的冷冻保护剂混匀制备出活菌数量在109 CFU/mL—1011 CFU/mL乳酸细菌菌悬液；
（4）乳酸细菌菌体包埋粒制备：将添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液与灭菌包埋材料溶液混合，搅拌均匀后，挤入固化剂，慢速搅拌5 分钟—30 分钟，制备出乳酸细菌保藏菌种包埋粒，包埋粒直径为1 mm—3 mm，包埋材料溶液由2—10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90—98重量份的水配制而成，食用海藻酸钠与食用明胶的重量配比为1—5:1；包埋材料溶液占50—90份，添加了冷冻保护剂的乳酸细菌保藏菌种菌悬液占10—50份，固化剂为0.1 mol/L—1 mol/L灭菌氯化钙溶液；
（5)乳酸细菌菌体包埋粒低温保藏：将乳酸细菌保藏菌种菌体包埋粒加入灭菌甘油进行混合，甘油体积比浓度为25%—45%，-70℃—4℃低温保存。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸细菌菌种保藏方法，其特征在于：所述乳酸细菌为乳酸杆菌，其保藏培养基组成和重量配比为，蛋白胨5—10份、牛肉浸粉3—8份、酵母浸粉2—6份、葡萄糖5—20份、磷酸氢二钾1—2份、柠檬酸氢二铵1—2份、乙酸钠3—5份、硫酸镁0.1—0.2份、硫酸锰0.02—0.04份、碳酸钙10—20份、吐温-801—2份和水1000份，pH值6.0—7.5，118℃—121℃加压蒸汽灭菌15—20分钟，备用。
3.根据权利要求1所述的一种乳酸细菌菌种保藏方法，其特征在于：所述乳酸细菌为乳酸球菌，其保藏培养基组成和重量配比为，大豆胨3—5份、蛋白胨2.5—5份、酪蛋白胨2.5—5份、酵母浸粉2—3份、牛肉浸粉3—5份、乳糖3—10份、抗坏血酸钠0.3—0.5份、甘油磷酸钠15—20份、硫酸镁0.2—0.3份、碳酸钙10—20份和水1000份，pH 值6.0—7.5，118℃—121℃加压蒸汽灭菌 15—20分钟，备用。
4.根据权利要求2或3所述的一种乳酸细菌菌种保藏方法，其特征在于：所述步骤（3）中冷冻保护剂的组成和重量配比为，脱脂牛奶或脱脂奶粉5—30份、葡萄糖0.5—5份、抗坏血酸0.1—1份和蒸馏水100份。
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