CN108836994A - 一种人工林树皮皂苷类活性成分的提取方法 - Google Patents

一种人工林树皮皂苷类活性成分的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物提取技术领域，公开了一种人工林树皮皂苷类活性成分的提取方法，包括如下步骤：1)将纤维素复合酶溶解于乙醇水溶液中获得纤维素复合酶溶液；2)将人工林树皮粉末和纤维素复合酶溶液按照料液质量比为1:6～12的比例混合获得混合料液；3)将所述混合料液置于30～70℃，超声酶解30～80min后，进行固液分离，收集液相组分即为皂苷类活性成分。本发明的酶处理与超声辅助耦合提取，提取的活性成分得率最高，比传统有机溶剂提取方法高20％以上，比超声波提取方法高10％以上，是一种低温、绿色、高效的提取方法。

Description

一种人工林树皮皂苷类活性成分的提取方法
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种人工林树皮皂苷类活性成分的提取方法。
背景技术
人工林是采用人工播种、栽植或扦插等方法和技术措施营造培育而成的森林，由人工造林或人工重新造林建立[国家林业局森林清查工作对“人工林”的定义]。人工林可以是引进新品种或是对本土树种的加强管理，按树种分为人工马尾松林、人工杉木林、人工桉树林等。人工林与天然林相比，具有生长快、生长量高、利润多、便于加工利用等特点，同时兼有生态效益。
我国是世界上人工林保存面积最大的国家，人工林面积达6933万公顷[第八次全国森林清查报告]。人工林树皮、枝叶等非木质资源丰富，但对该非木质资源的利用率低，未得到很好的利用[陈幸良,巨茜,林昆仑.中国人工林发展现状、问题与对策[J].世界林业研究,2014,27(6):54-59.]。如黑荆树(Acacia mearnsii)是含羞草科金合欢属的常绿乔木，速生、优质栲胶树种，原产于澳大利亚，1950年后在中国广东、广西、福建、云南等地开始引种[梁仰贞.林业黑金子——黑荆树[J].植物杂志,1996(4):11-12.]。黑荆树树皮中除了富含多酚类化合物外，还含有低聚原花色素、黄酮、蒽醌、三萜皂苷、多糖，树胶和蛋白质等化学物质。黑荆树皮中的皂苷具有多种生理活性作用，如抗糖尿病、抗炎、抗氧化、抗癌、抑菌等生物活性等。桉树(Eucalyptus)作为世界三大速生树种之一在我国种植面积已达450万hm2，桉树皮是纸浆工业中的一种废料，占桉树原木产量的13％，年产桉树皮390多万m3。[彭科峰.我国桉树人工林年产木材超3000万立方米[N/OL].中国科学报(第四版),(2015-10-26)[2016-01-20].郑志方.树皮化学与利用[M].北京:中国林业出版社,1988.]目前，这些废弃物有一些用于能源生产，大部分直接扔掉，不仅造成资源浪费，同时也带来环境污染。桉树皮含有丰富的高附加值生物活性成分，如萜类、酚类化合物、单宁、以及黄酮类等，具有抗肿瘤、抗菌、降血糖、抗氧化等生物活性作用，具有广泛的应用前景。马占相思树(Acacicamangium)属含羞草科(Mimosaceae)金合欢属的一种常绿乔木。是一种适应性强、生长迅速的优良树种，且马占相思树木质坚硬、木材可作纸浆材、人造板、家具，树皮是优良的栲胶原料，树叶可制作饲料，经济效益和生态效益都十分显著。自上世纪七十年代在中国南方试种，目前在广西等地有较大商品林基地[赵绍文,粱伟克,秦武明,等.栲胶原料新品种--马占相思树皮利用研究[J].经济林研究,2001,19(4):38-40.]。马占相思树树皮中除了富含缩合类单宁外，还含有黄酮、蒽醌、三萜皂苷、多糖，树胶和蛋白质等化学物质。红豆杉(Taxusmairei)是古老树种，是重要的用材树种和药用植物，因含有抗肿瘤活性的紫杉醇及其衍生物而引起人们的极大兴趣[俞天骥.国外医学(药学分册)[J].1993,20(2):72-76.]。我国已开始大面积的人工栽培红豆杉，主要分布在我国东南部区域海拔1000～1500m以下的山地[汪智慧,李勇,黄建国.南方红豆杉营养特性的研究[J].植物营养与肥料学报,2004,10(1):47-50.]。红豆杉树皮中除了含有紫杉烷二萜类化合物外，还含有多酚类、黄酮、生物碱、三萜皂苷、多糖和甾醇类等化学物质[陈未名.红豆杉属(Taxus)植物的化学成分和生理活性[J].药学学报,1990(3):227-240.]。
目前对对人工林树皮活性成分的提取主要采用传统的溶剂提取法、超声波辅助提取法和超临界流体萃取法。超临界流体萃取法设备费用高，生产能力低。传统的溶剂提取法具有溶剂耗量大，提取温度高，提取时间长，提取率低，有效成分损失大以及生产成本高等缺点，在工业化生产中的可行性差。
发明内容
针对我国人工林非木质资源树皮利用率低，活性物提取率不高的问题，本发明提出了一种人工林树皮皂苷类活性成分的提取方法，操作简单，可行性好，并能够显著提高皂苷类活性物质的提取效率。
本发明的技术方案如下：一种人工林树皮皂苷类活性成分的提取方法，包括如下步骤：1)将纤维素复合酶溶解于乙醇水溶液中获得纤维素复合酶溶液；2)将人工林树皮粉末和纤维素复合酶溶液按照料液质量比为1:6～12的比例混合获得混合料液；3)将所述混合料液置于30～70℃，超声酶解30～80min后，进行固液分离，收集液相组分即为皂苷类活性成分。
优选的，所述纤维素复合酶溶液中纤维素复合酶质量浓度为0.003～0.05％。
优选的，步骤1)中所述乙醇水溶液的体积浓度为40％～60％。
优选的，所述纤维素复合酶的质量占所述人工林树皮粉末干重的0.04～0.3％。
优选的，所述纤维素复合酶包括纤维素酶和半纤维素酶。
优选的，所述纤维素复合酶的CMC酶活力为3000～4000U/g，木聚糖酶酶活力为4000～5000U/g。。
优选的，所述超声酶解的超声功率为100～180W。
优选的，所述超声酶解的超声频率为35～45KHz。
优选的，所述人工林树皮为马占相思树树皮、黑荆树树皮、红豆杉树皮或桉树树皮。
优选的，步骤3)中所述固液分离的方法为过滤。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种人工林树皮皂苷类活性成分的提取方法，包括如下步骤：1)将纤维素复合酶溶解于乙醇水溶液中获得纤维素复合酶溶液；2)将人工林树皮粉末和纤维素复合酶溶液按照料液质量比为1:6～12的比例混合获得混合液；3)将所述混合液置于30～70℃，超声酶解30～80min后，进行固液分离，收集液相组分即为皂苷类活性成分。本发明将酶处理与超声辅助耦合进行人工林树皮皂苷类活性成分的提取，提取的活性成分得率高，比传统的有机溶剂提取得率高70％以上，比超声波辅助提高15％以上。本发明提供的提取方法，利用超声辅助的机械作用、空化作用、热效应和化学效应，促进了固体原料的粉碎和乳化，利用酶的耦合处理进一步破坏了植物细胞壁，有效提高了总皂苷的提取率，本发明所述方法为一种低温、绿色、高效的提取方法，解决了有效成分的提取率受胞内外平衡浓度的限制、提取时间长、耗费溶剂多，提取效率低、有效成分易变性损失等缺点，在人工林树皮活性物质加工生产中具有广泛的应用前景。
具体实施方式
本发明提供了一种人工林树皮皂苷类活性成分的提取方法，包括如下步骤：1)将纤维素复合酶溶解于乙醇水溶液中获得纤维素复合酶溶液；2)将人工林树皮粉末和纤维素复合酶溶液按照料液质量比为1:6～12的比例混合获得混合料液；3)将所述混合料液置于30～70℃，超声酶解30～80min后，进行固液分离，收集液相组分即为皂苷类活性成分。
本发明具体实施例中，优选以人工林树皮总皂苷活性成分进行了酶处理与超声辅助耦合提取。在本发明具体实施例中，以总皂苷作为人工林树皮活性成分的标志，比较本发明的提取方法与常规提取方法的提取率优劣。需要说明的是，本发明的提取方法也可以用于自然条件下生长的林木树皮中皂苷活性成分的提取。
本发明将纤维素复合酶溶解于乙醇水溶液中获得纤维素复合酶溶液。在本发明中，所述纤维素复合酶优选的包括纤维素酶和半纤维素酶；所述纤维素复合酶的酶活力优选为CMC酶活力为3000～4000U/g，木聚糖酶酶活力为4000～5000U/g；更优选为CMC酶活力为3200～3800U/g，木聚糖酶酶活力为4300～4800U/g。本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度优选为40％～60％，更优选为45～55％。所述纤维素复合酶溶液中纤维素复合酶质量浓度优选为0.003～0.05％，更优选为0.01～0.04％。本发明纤维素复合酶对植物细胞的细胞壁结构中的纤维素和半纤维素成分进行酶解，进而减少传质阻力，使植物细胞中的活性物质充分释放，且活性物质的活性可以得到较好的保护，从而提高活性物质的提取效率和提取率。
本发明获得所述纤维素复合酶溶液后，将人工林树皮粉末和纤维素复合酶溶液按照料液质量比为1:6～12的比例混合获得混合料液。本发明对所述人工林树皮的种类没有特殊限定，采用本领域常规的人工林树皮种类即可，在本发明具体实施过程中，以马占相思树树皮、黑荆树树皮、红豆杉树皮或桉树树皮为例。本发明对人工林树皮粉末的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员的常规方法制备即可；优选将人工林树皮进行机械剥皮，树皮风干，用粉碎机粉碎，得到人工林树皮粉末。本发明对人工林树皮粉末的颗粒大小没有特殊限定，原则上粉末越细越有利于树皮中活性物质的溶出。本发明中，所述人工林树皮粉末优选为5～40目，更优选为10～30目。本发明中所述人工林树皮粉末和纤维素复合酶溶液的料液质量比优选为1:8～10。本发明中，所述纤维素复合酶的质量占所述树皮粉末干重的0.04～0.3％，更优选为0.1～0.2％。本发明优选所述混合料液的pH值为5～6。
本发明在获得所述混合料液后，将所述混合料液置于30～70℃，超声酶解30～80min。本发明中所述超声酶解的温度优选为50～70℃，更优选为55～65℃，本发明中，所述超声酶解的温度优选的通过水浴实现。本发明所述超声酶解的时间优选为40～77min，更优选为65～75min。所述超声酶解的超声功率为100～180W，更优选为120～160W；所述超声酶解的超声频率优选为35～45KHz，更优选为40KHz。本发明利用超声波空化作用以及机械震动等次级效应来改善目标成分在溶剂中的扩散与混合，提高萃取效率，缩短提取时间，同时皂苷类活性物质的物质结构和生物活性不受影响。
本发明在所述超声酶解后，对超声酶解后的料液进行固液分离，收集液相组分即为皂苷类活性成分。本发明中，所述固液分离优选为过滤，本发明对所述过滤的方法没有特殊限定，采用本领域中的常规过滤方式即可。本发明中，所述液相组分优选的还进行减压浓缩，液-液萃取后，再经大孔吸附树脂分离，得活性成分总皂苷纯品。
检测收集到的液相组分中活性成分含量，计算提取率。本发明优选的采用香草醛-冰醋酸比色法测定人工林树皮提取液中总皂苷含量。结果表明：本发明人工林树皮皂苷活性成分提取得率高，比传统的有机溶剂提取得率高20％以上，比超声波辅助提取高10％以上，是一种低温、绿色高效提取人工林树皮活性成分的方法。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明以下实施例中，纤维素复合酶为纤维素酶和半纤维素酶(复合酶CMC酶活为3093U/g，木聚糖酶活为4596U/g)，购自淮安市百麦绿色生物能源有限公司。
实施例1
黑荆树树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)黑荆树树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，以料液比1:10加入0.5mg/mL纤维素复合酶50％乙醇溶液，在50℃下超声处理40min(超声频率40KHz，超声功率120W)，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
对比例1-1
黑荆树树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)黑荆树树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，以料液比1:10加入50％乙醇溶液，在50℃下超声处理50min(超声频率40KHz，，超声功率120W)，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
对比例1-2
黑荆树树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)黑荆树树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，按料液比1:10加入50％乙醇溶液，在60℃的条件下浸泡处理45min，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
实施例2
马占相思树树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)马占相思树树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，以料液比1:10加入0.5mg/mL纤维素复合酶50％乙醇溶液，在50℃下超声处理40min(超声频率40KHz，，超声功率140W)，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
对比例2-1
马占相思树树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)马占相思树树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，以料液比1:10加入60％乙醇溶液，在50℃下超声处理50min(超声频率40KHz，，超声功率140W)，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
对比例2-2
马占相思树树皮中总皂苷的提取分别取3份3g(精确到0.001)马占相思树树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，按料液比1:10加入60％乙醇溶液，在60℃的条件下浸泡处理45min，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
实施例3
红豆杉树皮树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)红豆杉树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，以料液比1:10加入0.5mg/mL纤维素复合酶50％乙醇溶液，在50℃下超声处理40min(超声频率40KHz，，超声功率160W)，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
对比例3-1
红豆杉树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)红豆杉树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，以料液比1:10加入60％乙醇溶液，在50℃下超声处理50min(超声频率40KHz，，超声功率160W)，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
对比例3-2
红豆杉树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)红豆杉树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，按料液比1:10加入60％乙醇溶液，在60℃的条件下浸泡处理45min，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
实施例4
巨尾桉(Eucalyptus grandisⅹE.urophylla)树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)巨桉树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，以料液比1:10加入0.5mg/mL纤维素复合酶50％乙醇溶液，在50℃下超声处理40min(超声频率40KHz，，超声功率180W)，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
对比例4-1
巨尾桉树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)巨桉树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，以料液比1:10加入60％乙醇溶液，在50℃下超声处理50min(超声频率40KHz，，超声功率180W)，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
对比例4-2
巨尾桉树皮中总皂苷的提取
分别取3份3g(精确到0.001)巨桉树皮粉末原料于100mL锥形瓶中，按料液比1:10加入60％乙醇溶液，在60℃的条件下浸泡处理45min，过滤，将滤液转移到100mL容量瓶中，定容至100mL。
以齐墩果酸为标准品，采用香草醛-冰醋酸法测定实施例1～4及对比例得到滤液中的皂苷含量，计算皂苷的提取得率。具体测定方法如下：
本发明采用香草醛-冰醋酸比色法测定人工林树皮提取液中总皂苷含量的方法如下：
称取105℃干燥至质量恒定的5mg齐墩果酸标准品，置于50mL容量瓶中，用60％乙醇溶液溶解并定容，配制成质量浓度为0.1g.L-1齐墩果酸标准溶液。准确移取芦丁标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8mL，置于10mL容量瓶中，分别加入0.2mL 5％香草醛-冰醋酸溶液，加入0.8mL高氯酸溶液，摇匀，放入70℃水浴保温15min，流水冷却，加入乙酸乙酯4.0mL，摇匀。以相应试剂为空白对照，在550nm波长处测定其吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，以齐墩果酸质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得到总皂苷标准曲线回归方程为A＝0.0378X-0.0099，相关系数R2＝0.9993,线性范围为0～0.08g.L-1。
得率的计算：将提取得到的提取液稀释一定倍数，取稀释液1mL，按采用香草醛-冰醋酸比色法测定吸光度，根据标准曲线计算总皂苷得率，按式计算总皂苷得率。
根据标准曲线计算总皂苷得率，按式(1)计算总皂苷得率。
式中：Y―总皂苷得率，％；C1―总皂苷质量浓度，mg/L；V―待测提取溶液的总体积，mL；G0―人工林树皮的质量，g；w―人工林树皮含水率，％；n―稀释倍数。
总皂苷得率的结果见表1至表4。
表1黑荆树树皮中总皂苷酶处理/超声波辅助耦合提取方法比较
由表1可以看出：实施例1(50％乙醇溶液超声酶耦合提取)从黑荆树树皮中提取总皂苷的得率最高，为1.54％，比对比例1-2超声辅助提取提高了14.9％，比对比例1-3传统的水域浸提的提取方法提高了32.7％，所以实施例1酶处理/超声波辅助耦合提取方法为黑荆树树皮中总皂苷的最佳提取方法。
表2马占相思树树皮中总皂苷酶处理/超声波辅助耦合提取方法比较
由表2可以看出：实施例2(50％乙醇溶液超声酶耦合提取)从马占相思树树皮中提取总皂苷的得率最高，为0.67％，比对比例2-1超声辅助提取提高了19.7％，比对比例2-2传统的水域浸提的提取方法提高了41.8％，所以实施例1酶处理/超声波辅助耦合提取方法为马占相思树树皮中总皂苷的最佳提取方法。
表3红豆杉枝叶中总皂苷酶处理/超声波辅助耦合提取方法比较
由表3可以看出：实施例3(50％乙醇溶液超声酶耦合提取)从红豆杉枝叶中提取总皂苷的得率最高，为0.23％，比对比例3-1超声辅助提取提高了11.5％，比对比例3-2传统的水域浸提的提取方法提高了24.6％，所以实施例1酶处理/超声波辅助耦合提取方法为红豆杉枝叶中总皂苷的最佳提取方法。
表4巨尾桉树皮中总皂苷酶处理/超声波辅助耦合提取方法比较
由表3可以看出：实施例4(50％乙醇溶液超声酶耦合提取)从巨桉树皮中提取总皂苷的得率最高，为0.11％，比对比例4-1超声辅助提取提高了10％，比对比例4-2传统的水域浸提的提取方法提高了22.2％，所以实施例1酶处理/超声波辅助耦合提取方法为桉树树皮中总皂苷的最佳提取方法。
用本发明对人工林树皮皂苷成分进行了酶处理与超声辅助耦合提取，结果表明：本发明提取方法对人工林树皮总皂苷的提取得率最高，比传统的有机溶剂提取得率高20％以上，比超声波辅助提取高于10％以上。本发明的技术是一种低温、绿色高效提取方法。解决了有效成分的提取率受胞内外平衡浓度的限制、提取时间长、耗费溶剂多，提取效率低、有效成分易变性损失等缺点，且具有原料普适性强等特点，在人工林非木质资源树皮活性物质加工生产中具有广泛的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人工林树皮皂苷类活性成分的提取方法，包括如下步骤：
1)将纤维素复合酶溶解于乙醇水溶液中，获得纤维素复合酶溶液；
2)将人工林树皮粉末和所述纤维素复合酶溶液按照料液质量比为1:6～12的比例混合获得混合料液；
3)将所述混合料液置于30～70℃，超声酶解30～80min后，进行固液分离，收集液相组分为皂苷类活性成分。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述纤维素复合酶溶液的质量浓度为0.003～0.05％。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述乙醇水溶液的体积浓度为40％～60％。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述纤维素复合酶的质量占所述人工林树皮粉末干重的0.04～0.3％。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的提取方法，其特征在于，所述纤维素复合酶包括纤维素酶和半纤维素酶。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述纤维素复合酶的CMC酶活力为3000～4000U/g，木聚糖酶酶活力为4000～5000U/g。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述超声酶解的超声功率为100～180W。
8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述超声酶解的超声频率为35～45KHz。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工林树皮为马占相思树树皮、黑荆树树皮、红豆杉树皮或桉树树皮。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述固液分离的方法为过滤。
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