CN108815532A - 一种抗肿瘤药物、抗肿瘤外敷药及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤药物、抗肿瘤外敷药及其制备方法。该抗肿瘤药物的原料包括含‑OH、‑COOH、‑NH2中至少一种基团的蛋白类抗肿瘤生物材料、光偶联剂和溶剂；光偶联剂包括芳香叠氮类化合物；其制备过程包括在避光条件下，将以上蛋白类抗肿瘤生物材料、光偶联剂和溶剂混合反应制得。其中，光偶联剂芳香叠氮类化合物作为修饰剂以修饰以上蛋白类抗肿瘤生物材料，成本低，修饰效果好，产率高，适用范围广；合成的抗肿瘤药物含有叠氮苯基，具有光敏活性，可通过光化固定于医用敷料上，形成抗肿瘤外敷药，药物连接紧密，不易脱落，可持续向肿瘤细胞发送死亡诱导信号，延长药物的作用时间，提升治疗效果。

Description

一种抗肿瘤药物、抗肿瘤外敷药及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种抗肿瘤药物、抗肿瘤外敷药及其制备方法。
背景技术
生物医用材料(又称生物材料)是一类用于诊断、治疗、修复或替换人体组织、器官或增进其功能的新型高技术材料，随着社会、经济的发展，新型技术的注入，使得生物医用材料产业以高于20％的年增长率持续发展。生物材料在临床上的成功应用，挽救了数以千万计危重病人的生命，已显著降低了心血管疾病、癌症、等重大疾病的死亡率，为提高患者生命质量、健康水平和降低医疗费用发挥了重要作用。生物材料的表面物理化学修饰在研发新型医用材料中起着重要的作用，因为生物材料和装置的生物学响应性能很大程度上取决于其表面化学组成和结构，对材料最外层进行修饰可使其只影响与生物体的相互作用，同时仍然保留生物材料的主要性能。用化学或物理的方法将生物分子，如酶、抗体、亲和性蛋白、细胞受体配体以及各种药物固定化到生物材料基质表面已广泛应用于医学治疗、诊断等方面。而现有的抗肿瘤生物材料修饰，所使用的修饰剂成本高，修饰效果不理想、适用面窄；且通常使用物理吸附修饰，修饰工艺复杂、产率低，难以实现大规模生产。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗肿瘤药物、抗肿瘤外敷药及其制备方法；该抗肿瘤药物所使用的修饰剂成本低，修饰效果好，适用范围广。
本发明所采用的技术方案是：一种抗肿瘤药物，其原料包括含-OH、-COOH、-NH2中至少一种基团的蛋白类抗肿瘤生物材料、光偶联剂和溶剂；所述光偶联剂包括芳香叠氮类化合物。其中，蛋白类抗肿瘤生物材料具有抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞死亡的特性。
优选地，所述蛋白类抗肿瘤生物材料选自肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、温敏聚合物、血小板生成素、肝磷脂、促红细胞生成素、明胶、β-半乳糖衍生物、藻蓝蛋白中的至少一种。进一步优选地，蛋白类抗肿瘤生物材料为TNF-α和INF-γ；TNF-α和INF-γ的质量配比通常为(1～3)：1，优选1:1。
优选地，所述蛋白类抗肿瘤生物材料的浓度为(1～5)μg/mL。
优选地，所述蛋白类抗肿瘤生物材料与所述光偶联剂的质量比为1：(3～6)；进一步优选地，所述蛋白类抗肿瘤生物材料与所述光偶联剂的质量比为1：5。
优选地，所述光偶联剂的结构式为：或者其中，R1、R2选自-OH、-NH2、-CONH2、-SH、-COOH中的任一种。
进一步优选地，所述光偶联剂的结构式为或者其中，R1、R2选自-OH、-NH2、-CONH2、-SH、-COOH中的任一种。如4-叠氮苯酚、4-叠氮苯胺、4-叠氮基苯甲酰胺、4-叠氮基苯硫酚、4-叠氮基苯甲酸、4-叠氮基-2-甲基苯甲酸、4-叠氮基-2-甲基苯硫酚、4-叠氮基-2-甲基苯甲酰胺、4-叠氮基-2-甲基苯胺、4-叠氮基-2-甲基苯酚、5-叠氮基-2-羟基苯甲酸、2-氨基-5-叠氮基苯甲酸、5-叠氮基-2-氨基甲酰基苯甲酸、5-叠氮基-2-巯基苯甲酸、4-叠氮邻苯二甲酸等。
优选地，所述溶剂为磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
本发明还提供了一种以上抗肿瘤药物的制备方法，包括以下步骤：在0～10℃、避光条件下，将所述蛋白类抗肿瘤生物材料、光偶联剂和溶剂混合，搅拌使其反应。具体可在0～10℃、避光条件下，磁力搅拌48～60h，使蛋白类抗肿瘤生物材料与光偶联剂进行反应。反应所得的样品需在低温(通常为0～10℃)环境下避光保存，使用时采用磷酸缓冲盐溶液进行稀释，通常稀释为1～5μg/mL，优选1μg/mL。
光偶联剂通常采用过量，以保证蛋白类抗肿瘤生物材料完全反应。而为了除去反应剩余的光偶联剂，在反应完成后，通常可进行进一步离心纯化处理；具体地，可将反应后的物料用超滤离心管(10KDa)，4000～5000rpm/min的转速下离心20～40min，而后冷冻干燥。
例如，若蛋白类抗肿瘤生物材料为TNF-α和IFN-γ，抗肿瘤药物的制备过程可包括：将光偶联剂与PBS溶液混合，再分别加入TNF-α和IFN-γ，在低温(0～10℃)、避光的条件下磁力搅拌反应48～60h，以合成光敏活性TNF-α和IFN-γ；反应结束后，分别用超滤离心管(ΜiliporeΜolecutⅡ,10KDa)，在4000～5000rpm/min的转速下，离心20～40min以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥后，低温(0～10℃)、避光保存，得纯化光敏活性TNF-α和IFN-γ。
本发明还提供了一种抗肿瘤外敷药，所述抗肿瘤外敷药包括医用敷料和以上抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物固定覆于所述医用敷料的表面。
其中，医用敷料可选用胶原敷料、天然纱布、合成纤维类敷料、多聚膜类敷料或高分子敷料等。
另外，本发明还提供了一种上述抗肿瘤外敷药的制备方法，包括以下步骤：在避光条件下，将以上抗肿瘤药物覆于所述医用敷料的表面，再避光冷冻干燥，而后采用紫外光照射处理使其固化。
例如，若蛋白类抗肿瘤生物材料为TNF-α和IFN-γ，医用敷料采用胶原敷料；具体可分别向以上所制得的纯化光敏活性TNF-α和IFN-γ中加入PBS溶液，稀释至浓度为1～5μg/mL，得光敏性活性的TNF-α和IFN-γ溶液；再在避光条件下将其加入胶原敷料中，优选每5×5cm2大小胶原敷料加入10～20mL光敏性活性的TNF-α和IFN-γ溶液；置于摇床上10～20min后避光冷冻干燥；干燥后的样品在低温(0～10℃)、避光环境下，使用紫外灯照射；优选使用瓦数为100W的紫外灯，每照射5s间隔5s，照射时长为10min。
本发明的有益技术效果是：本发明提供一种抗肿瘤药物、外用抗肿瘤药物及其制备方法，该抗肿瘤药物的原料包括含-OH、-COOH、-NH2中至少一种基团的蛋白类抗肿瘤生物材料、光偶联剂和溶剂；其中，光偶联剂包括芳香叠氮类化合物，可适用于含-OH、-COOH、-NH2中至少一种功能基团的多种生物材料的修饰，使用范围广；通过将含-OH、-COOH、-NH2中至少一种基团的蛋白类抗肿瘤生物材料与以上光偶联剂相作用，合成含芳香叠氮基的聚合物，赋予其光敏活性，修饰工艺简易，成本低、修饰效果好，产率高，重现性好、易于实现规模化生产。所得的抗肿瘤药物可通过光化固定于医用敷料上，形成抗肿瘤外敷药，药物连接紧密，不易脱落，可持续向肿瘤细胞发送死亡诱导信号，延长药物的作用时间，提升治疗效果。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图做简单说明。
图1为紫外光谱检测光敏活性TNF-α和IFN-γ的合成效果图；其中，a)图为TNF-α、光敏活性TNF-α和叠氮苯甲酸的紫外吸收光谱图；b)图为IFN-γ、光敏活性IFN-γ和叠氮苯甲酸的紫外吸收光谱图；
图2为高效液相色谱检测光敏活性TNF-α与IFN-γ合成效果图；其中，a)图为TNF-α、光敏活性TNF-α和叠氮苯甲酸的出峰图谱；b)图为TNF-γ、光敏活性TNF-γ和叠氮苯甲酸的出峰图谱；
图3为光固化不同浓度光敏活性TNF-α和IFN-γ胶原敷料的载药效率对比图；
图4为光敏活性TNF-α和IFN-γ修饰胶原敷料对细胞活性抑制效果图；其中，a)图为光固化光敏活性TNF-α和IFN-γ胶原敷料对肿瘤细胞活性和正常细胞的抑制效果图；b)图为未经修饰的胶原敷料对肿瘤细胞活性和正常细胞的抑制效果图；
图5为光敏活性TNF-α与IFN-γ修饰胶原敷料对小鼠免疫调控影响效果图；其中，a)、b)、c)、d)图分别为小鼠血液中免疫因子肿瘤坏死细因子-α、干扰素-γ、白细胞介素-1、白细胞介素-2的表达浓度随时间的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
制备光固化抗肿瘤外用药物，具体包括：
(1)制备光敏活性TNF-α和光敏活性IFN-γ。
将100μg的TNF-α和IFN-γ分别加入50μL含1.5mg叠氮苯甲酸/PBS(pH7.4，叠氮苯甲酸和PBS的体积比为4:1)溶液10mL中，在冰浴(4℃)、避光的条件下磁力搅拌反应48h，以反应合成叠氮苯基衍生物，具有光敏活性的TNF-α和IFN-γ。合成结束后，分别用超滤离心管(ΜiliporeΜolecutⅡ,10KDa)，在4000rpm/min的转速下，离心30min以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥后，加入PBS溶液稀释光敏活性TNF-α和IFN-γ至浓度为1μg/mL，制得光敏活性TNF-α和IFN-γ溶液。
光敏活性TNF-α和IFN-γ的具体制备原理分别如下式(Ⅰ)、(Ⅱ)所示：
(2)利用紫外光照射将光敏活性TNF-α和IFN-γ固定到胶原敷料表面。
在4℃、避光条件下，将以上制得的光敏活性TNF-α和IFN-γ溶液覆于胶原敷料上，具体每5×5cm2大小胶原敷料加入10mL光敏性活性TNF-α溶液和10mL光敏性活性IFN-γ溶液，而后置于摇床上摇10min后，待TNF-α和IFN-γ与胶原敷料充分作用后避光冷冻干燥。再将干燥后的样品在冰浴(4℃)、避光条件下使用100W功率的紫外灯照射，照射时间为每照射5s间隔5s，持续时长为10min，制得光固化抗肿瘤外敷药。
以上将TNF-α与IFN-γ与叠氮苯甲酸相作用，赋予其光敏活性，可在紫外光的照射下将药物接枝固定到胶原敷料表面。具体地，由于叠氮基苯在紫外光的照射下可转化为高反应活性的氮烯，氮烯可与许多有机基团快速反应。因此，以上TNF-α与IFN-γ与叠氮苯甲酸反应合成的聚合物中含有叠氮苯侧基，具有光敏活性，当这种聚合物与其他聚合物的基质或医疗装置在紫外光的照射下，含叠氮苯侧基的聚合物可快速固定到基质上。以芳香叠氮类化合物(叠氮苯甲酸)作为修饰剂，化学修饰TNF-α与IFN-γ，修饰剂成本低，修饰效果好，连接紧密；与现有物理吸附表面修饰技术相比，生产工艺操作简易、产率高、重现性好，易于实现规模化生产。
TNF-ɑ和IFN-γ经以上反应修饰后所得产物含有叠氮苯基，具有光敏活性，进而可通过光化学固定法将其以化学键交联的方式牢固地固定于医用敷料的表面，药物连接紧密，不易脱落，有利于持续发挥功效，用于外敷，可避免直接注射药物造成局部药物浓度过高引起毒副作用。另一方面，由于药物被固定于医用敷料的表面，使得肿瘤细胞无法通过胞吞胞吐的方式来躲避药物的杀伤，因此可持续地与肿瘤细胞膜蛋白相作用，长时间向肿瘤细胞发送死亡诱导信号，从而延长药物的作用时间，提升治疗效果。
另外，在临床治疗中发现，肿瘤治疗常用药物肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对人体肿瘤的生长具有明显的抑制作用，可用于多种类型的肿瘤治疗。但由于TNF-α是具有多种生物活性功能的细胞因子，在抑制肿瘤细胞生长的同时也容易引起严重的毒副作用，明显制约了TNF-α的临床使用。在本实施例中，采用干扰素-γ(IFN-γ)与TNF-α的联合用药能提高肿瘤细胞膜表面与TNF-α结合的受体数量，并且通过调节细胞的免疫应答作用诱导肿瘤细胞发生凋亡，以在一定程度上降低TNF-α临床用药剂量并减低TNF-α的毒副作用。
为了验证以上抗肿瘤药物光敏活性TNF-α和IFN-γ的性能，分别对其合成效果、光固化修饰医用敷料的效率、对细胞活性的影响、对小鼠免疫调控影响进行了检测，具体如下：
(一)紫外光谱检测光敏活性TNF-α和IFN-γ的合成效果
紫外吸收光谱是由分子中价电子能级跃迁所产生的。由于电子能级跃迁往往要引起分子中核的运动状态的变化，因此在电子跃迁的同时，总是伴随着分子的振动能级和转动能级的跃迁。考虑跃迁前的基态分子并不是全是处于最低振动和转动能级，而是分布在若干不同的振动和转动能级上；而且电子跃迁后的分子也不全处于激发态的最低振动和转动能级，而是可达到较高的振动和转动能级，因此电子能级跃迁所产生的吸收线由于附加上振动能级和转动能级的跃迁而变成宽的吸收带。在紫外光谱检测中，在220-280nm范围内若无明显吸收峰，可推断该化合物不含有苯环、共轭双键、醛基、酮基、溴。TNF-α与IFN-γ在避光条件下与叠氮苯甲酸充分反应后，使其接连上具有光敏活性的叠氮基团。因此具有光敏活性的TNF-α与IFN-γ的紫外吸收峰会向长波长移动。因此可利用紫外光谱法检测吸收峰验证光敏活性TNF-α与IFN-γ的合成是否成功。紫外光谱的吸收值因分子的结构中官能团组成、官能团位置及多级结构的区别而有相应的差别，利用紫外光谱方法可测定分子的键长、键角，并由此推测分子的立体构型，是研究表征分子结构的一种有效手段。
具体检测方法如下：光敏活性TNF-α与IFN-γ合成完成后，吸取3mL PBS(-)溶液(pH7.4)调零后，将3mL光敏活性TNF-α与IFN-γ溶液分别加入比色皿中测量190-300nm波长的紫外光吸收值。测量完成后取出比色皿，依次用70％的酒精清洗后，用去离子水清洗三遍，再吸取50μL叠氮苯甲酸加入3ml PBS(-)溶液(pH＝7.4)，继续测量相同波长下的紫外光吸收值。并且采用类似的方法检测TNF-α、IFN-γ和光偶联剂叠氮苯甲酸的紫外吸收光谱。
检测所得结果如图1所示，其中，a)图为TNF-α、光敏活性TNF-α和叠氮苯甲酸的紫外吸收光谱图；b)图为IFN-γ、光敏活性IFN-γ和叠氮苯甲酸的紫外吸收光谱图。
由于叠氮苯甲酸由于存在发色基团苯环结构，因此，如图1所示，在225nm波长出现明显的特征吸收峰。TNF-α与IFN-γ与叠氮苯甲酸反应后，具有光敏活性TNF-α在206nm处出现最大的吸收峰值，如图1中a)图所示；而光敏活性的IFN-γ在212nm处出现最大的吸收峰值，如1中b)图所示。这是由于反应后形成的酰胺键引入叠氮苯甲基的电子域，使叠氮苯甲酸225nm的强特征峰向短波谱位移。由此表明TNF-α与IFN-γ成功地与叠氮苯甲酸发生了反应，接上了具有光敏活性的叠氮基团。
(二)高效液相色谱检测光敏活性TNF-α与IFN-γ合成效果
高效液相色谱法以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
本研究通过高效液相色谱法对光敏活性TNF-α与IFN-γ的制备效果进行分析，利用PBS(-)溶液分别制备10μg/mL叠氮苯甲酸、TNF-α、IFN-γ和光敏活性TNF-α、光敏活性IFN-γ五种样品，分别吸取等量的上述溶液，通过液相色谱仪(Alliance 2695，美国Waters公司)进行分析，采用C-18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)，流动相是甲醇：磷酸水溶液(0.5％)＝90:10，柱温：室温，检测波长：UV254nm，流速：0.8mL/min，极性大的样品先出峰。
经检测，所得结果如图2所示，其中，a)图为TNF-α、光敏活性TNF-α和叠氮苯甲酸的出峰图谱；b)图为TNF-γ、光敏活性TNF-γ和叠氮苯甲酸的出峰图谱。
由图2中a)图可知：叠氮苯甲酸的最大吸收峰值出峰时间最早，为3.912min。TNF-α标准品的出峰时间最晚，为8.833min。当TNF-α与叠氮苯甲酸反应后，由于形成羰基并带上苯环与叠氮基后，样品的极性变大，使得样品的最大吸收峰发生左移，极性向叠氮苯甲酸靠近，因此合成成功的光敏活性TNF-α出峰时间向叠氮苯甲酸出峰时间靠近，为6.288min。
由图2中b)图可知：IFN-γ标准品的出峰时间为13.568min。当与叠氮苯甲酸反应后，样品的极性也变大，成功制备的光敏活性IFN-γ样品的最大吸收峰出峰时间也向叠氮苯甲酸出峰时间靠近，为6.284min，表明IFN-γ也与叠氮苯甲酸成功发生反应。
另外，由图2可知，所合成的光敏活性TNF-α与IFN-γ的高效液相色谱峰形良好，无其它杂质峰出现，证明合成产物纯度较高。
(三)紫外光固定光敏活性TNF-α与IFN-γ修饰胶原敷料效率的检测
将医用胶原敷料裁成5.0cm×5.0cm大小，分别加入10mL浓度为1μg/mL的光敏活性TNF-α与IFN-γ溶液，置于摇床上10min，而后避光冷冻干燥，避光条件下4℃环境于紫外灯下进行光固定，照射时间为每照射5s间隔5s，时长为10min。照射完毕后收集剩余液体，并使用10mL BPS溶液于摇床上洗涤材料，重复三次，将冲洗后的PBS与剩余液体合并，使用Bradford蛋白浓度检测试剂盒检测溶液中的蛋白浓度，并以相同条件下BPS溶液冲洗的胶原敷料溶液作为对照组。
检测所得结果如图3所示。从图3可以看到使用以上实施例中的修饰工艺可使大部分TNF-α和IFN-γ成功修饰到胶原敷料表面，装载效率高，随着药物浓度的增加，大量的TNF-α和IFN-γ均可修饰到胶原敷料的表面。
(四)光敏活性TNF-α和IFN-γ修饰胶原敷料对细胞活性影响检测
本实验采用CCK-8法检测材料对细胞活力的影响。CCK-8试剂中含有2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物。甲臜产量与活细胞的数量成正比。在450nm波长处测定甲臜的吸光值，可间接反映细胞的活力。
具体的实验方法如下：将以上修饰制备的胶原敷料进行裁剪并置于96孔板中，并在每孔加入约1.5×104个细胞(人皮肤基底癌细胞A431、人宫颈癌细胞HeLa、人皮肤黑色素瘤细胞A375、人皮肤成纤维细胞HFF-1、人胚肾细胞293T五种细胞均进行实验)，37℃培养箱中培养24h后弃除培养基，每孔加入150μL用培养基稀释的CCK-8溶液。只含CCK-8溶液不含细胞的孔作为空白组，加入CCK-8后置于37℃培养箱中孵育1h后，用移液器沿孔壁小心转移100μL溶液置新的96孔板，用酶标仪测定450nm处的吸光值。细胞活力的计算公式为：细胞活力(％)＝(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100％。并采用以上方法，以未经修饰的胶原敷料代替以上修饰制备的胶原敷料进行检测实验。
经检测所得结果如图4所示，其中，a)图为光固化光敏活性TNF-α和IFN-γ胶原敷料对肿瘤细胞活性和正常细胞的抑制效果图；b)图为未经修饰的胶原敷料对肿瘤细胞活性和正常细胞的抑制效果图。
由图4可知：通过细胞活力检测发现，未经修饰的胶原敷料对肿瘤细胞和正常细胞的细胞活性没有明显的影响，如图4中b)图所示；光敏活性TNF-α与IFN-γ修饰胶原敷料对人皮肤基底癌细胞A431、人皮肤黑色素瘤细胞A375、人宫颈癌细胞HeLa的细胞活力有明显的抑制作用，其中对A431细胞的细胞活力抑制效果最明显，通过抑制作用，A431细胞的细胞活率仅为23％；对HeLa细胞次之，细胞活率为28％，对A375细胞的细胞活力抑制效果虽然相对较低，但其细胞活率也只有36％，如图4中a)图所示。以上结果表明光化学固定法制备的TNF-α与IFN-γ修饰胶原敷料具有优异的肿瘤抑制功效，同时也具备良好的生物相容性，对正常的细胞生长，如正常人皮肤成纤维细胞HFF-1、人胚肾细胞293T的生长影响较小。
(五)光敏活性TNF-α与IFN-γ修饰胶原敷料对小鼠免疫调控影响检测
1)皮肤癌小鼠动物模型构建与材料创面修复：体外培养A431细胞至对数生长期，收集细胞并稀释成适当浓度，吸取100μL约含有1×106个A431细胞的悬液接种到25g左右的BALB/c小鼠后腿左侧背部。当老鼠的肿瘤体积生长至100mm3并出现溃烂时，使用1％的戊巴比妥纳麻醉剂以45mg/kg剂量进行腹腔注射，约十分钟后达到最佳麻醉状态时固定住小鼠，用解剖剪去除溃烂部位并剪除2/3体积的肿瘤组织。随后，将光敏活性TNF-α与IFN-γ修饰的胶原敷料小心缝合至创面处，并用纱布擦去渗出的血水，直至小鼠创面无血水渗出。
2)小鼠免疫因子表达的检测：将所制备的胶原敷料缝合至小鼠创面后，选取24h、48h、72h、120h时间段的小鼠，采用摘眼球取血法采集血液，采集的全血使用肝素进行抗凝处理，4℃约1000-2000g离心10min，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。制备好的血浆需置于冰上分别使用TNF-αELISA Kit、IFN-γELISA Kit、IL-1ELISAKit、IL-2ELISA Kit检测试剂盒检测小鼠免疫因子表达的情况。
使用未经修饰的普通胶原敷料(即胶原材料)代替以上光敏活性TNF-α与IFN-γ修饰的胶原敷料，并注射TNF-α和IFN-γ，按同样的方法进行实验。另外，使用未经修饰的普通胶原敷料(即胶原材料)代替以上光敏活性TNF-α与IFN-γ修饰的胶原敷料，并按同样的方法进行实验。
检测所得结果如图5所示，其中，a)、b)、c)、d)图分别为小鼠血液中免疫因子肿瘤坏死细因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)的表达浓度随时间的变化曲线。
如图5所示，在使用光敏活性TNF-α与IFN-γ修饰胶原敷料修复荷瘤小鼠创面24h后，小鼠血液中免疫因子TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2的表达明显上调，并且能持续48h保持高表达水平，72h后免疫因子的表达量开始减少，但直至120h后仍保持较高的表达量。而使用普通的胶原敷料并不能引起机体产生免疫应答反应，TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2的表达并未出现明显的变化。同时，使用普通胶原敷料并注射TNF-α、IFN-γ后，在24h时间段能观察到小鼠血液TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2表达上调，但持续时间较短，48h后已恢复到正常水平。由此可证明光敏活性TNF-α与IFN-γ修饰胶原敷料能明显地诱发免疫应答效应发挥抗肿瘤功效，同时相比单纯使用TNF-α与IFN-γ，所制备的胶原敷料能维持更长的免疫激活时间。
综上，紫外光谱检测的实验结果表明TNF-α和IFN-γ与叠氮苯甲酸反应后具有光敏活性的TNF-α在206nm处出现最大的吸收峰值，而光敏活性IFN-γ在212nm处出现最大的吸收峰值。这是由于反应后形成的酰胺键引入叠氮苯甲基的电子域，使叠氮苯甲酸225nm的强特征峰向短波谱位移。由此表明TNF-α和IFN-γ成功地与叠氮苯甲酸发生了反应，接上了具有光敏活性的叠氮基团。高效液相的检测出峰图谱也表明TNF-α和IFN-γ成功地与叠氮苯甲酸发生了反应，样品的最大吸收峰发生左移，极性向叠氮苯甲酸靠近，表明TNF-α和IFN-γ接上了具有光敏活性的叠氮基团。装载效率的检测则表明本修饰方法具有很高的修饰效率，能将药物高效地修饰到胶原敷料的表面。通过细胞活力检测发现，光敏活性TNF-α和IFN-γ修饰的胶原敷料对人皮肤癌细胞A431、人皮肤黑色素瘤细胞A375、人宫颈癌细胞HeLa的细胞活力有明显的抑制作用，同时也具备良好的生物相容性，对正常的细胞生长，如正常人皮肤成纤维细胞HFF-1、人胚肾细胞293T的生长影响较小。此外，对小鼠免疫调控影响检测结果表明，光敏活性TNF-α和IFN-γ修饰胶原敷料能明显地诱发免疫应答效应发挥抗肿瘤功效，同时相比单纯使用TNF-α与IFN-γ，所制备的胶原敷料能维持更长的免疫激活时间。
以上实施例通过采用叠氮苯甲酸作为修饰剂，分别与TNF-α、IFN-γ反应，反应合成的聚合物由于含叠氮苯基，使其具有光敏活性，在该过程中，叠氮苯甲酸也作为光偶联剂；所合成的聚合物可紫外光的照射下将其牢固地接枝固定到胶原敷料等医用敷料表面。根据光敏活性TNF-α、IFN-γ的制备原理，可以理解地，可将含叠氮苯基的芳香叠氮类化合物作为修饰剂和光偶联剂，以用于修饰含-OH、-COOH、-NH2中至少一种基团的蛋白类抗肿瘤生物材料，以使这些蛋白类抗肿瘤生物材料含叠氮苯基，具有光敏活性，进而可通过光化固定于医用敷料上，制成抗肿瘤外敷药。以芳香叠氮类化合物作为修饰剂，成本低，可适用于含-OH、-COOH、-NH2中至少一种功能基团的多种生物因子的修饰，使用范围广，修饰工艺简易，修饰效果好，产率高，重现性好、易于实现规模化生产。
尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所述权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的原料包括含-OH、-COOH、-NH2中至少一种基团的蛋白类抗肿瘤生物材料、光偶联剂和溶剂；所述光偶联剂包括芳香叠氮类化合物。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述蛋白类抗肿瘤生物材料选自肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、温敏聚合物、血小板生成素、肝磷脂、促红细胞生成素、明胶、β-半乳糖衍生物、藻蓝蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述蛋白类抗肿瘤生物材料的浓度为(1～5)μg/mL。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述蛋白类抗肿瘤生物材料与所述光偶联剂的质量比为1：(3～6)。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述光偶联剂的结构式为：其中，R1、R2选自-OH、-NH2、-CONH2、-SH、-COOH中的任一种。
6.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述溶剂为磷酸缓冲盐溶液。
7.权利要求1-6中任一项所述的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在0～10℃、避光条件下，将所述蛋白类抗肿瘤生物材料、光偶联剂和溶剂混合，搅拌使其反应。
8.根据权利要求7所述抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，所述反应完成之后还包括离心纯化处理。
9.一种抗肿瘤外敷药，其特征在于，所述抗肿瘤外敷药包括医用敷料和权利要求1-6中任一项所述的抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物固定覆于所述医用敷料的表面。
10.权利要求9所述的抗肿瘤外敷药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在避光条件下，将权利要求1-6中任一项所述的抗肿瘤药物覆于所述医用敷料的表面，避光冷冻干燥，而后采用紫外光照射处理使其固化。
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