CN108815177A - P2y13激动剂在抗病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种P2Y13激动剂在抗病毒感染中的应用，具体地，本发明提供了一种p2y13蛋白的激动剂、或p2y13基因的激动剂的用途，用于制备一药物，所述药物用于抗病毒感染，本发明通过激活P2Y13受体来保护机体抵抗病毒感染。

Description

P2Y13激动剂在抗病毒感染中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及P2Y13激动剂在抗病毒感染中的应用。

背景技术

嘌呤信号和嘌呤受体在机体固有免疫和获得性免疫过程中都具有重要的调控作用。自1929年嘌呤信号首次被报道，随后人们揭示了ATP,UTP,ADP,UDP等嘌呤信号的多种生物学功能[1]。在组织损伤或病原体感染过程中，核苷酸可以被受刺激的细胞释放到细胞外部，它们可以作为一种危险信号通过自分泌或旁分泌的形式与其受体相互作用，从而提醒机体对外界刺激做出相应的反应[2]。目前为止，已经有19种嘌呤受体被发现，主要可以分为P1和P2两种亚型。其中P1型受体主要是腺苷受体，包括A1、A2A、A2B和A3四种，它们都是G蛋白偶联受体(GPCRs)，可以被腺苷所激活。而P2型受体可以根据其结构和信号转导机制进一步分为P2Y受体和P2X受体。P2Y受体主要包括P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13和P2Y14等8种，也是一类GPCRs，是ATP、ADP、UTP以及UDP等胞外核苷酸的受体。P2X受体是一类离子通道受体，包括P2X1-P2X7共7种，它们都是ATP的受体。P2受体在炎症和感染性疾病中扮演重要角色[3]。

然而关于胞外危险信号ADP及其受体在病毒感染过程中的作用目前仍然没有相关报道。

因此，本领域迫切需要开发一种新的抗病毒感染的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的抗病毒感染的药物，P2Y13的激动剂ADP具有明显的抗病毒功能，本发明另一目的在于揭示了ADP可以通过P2Y13受体抑制cAMP/EPAC1信号通路，从而抑制病毒的复制。

在本发明的第一方面，提供了一种p2y13蛋白的激动剂、或p2y13基因的激动剂的用途，用于制备一药物，所述药物用于抗病毒感染。

在另一优选例中，所述抗病毒感染包括：(i)抑制病毒的复制；和/或(ii)降低病毒引起的细胞病变和细胞存活。

在另一优选例中，所述药物还用于：(a)下调cAMP的表达；和/或(b)下调EPAC1的表达；

在另一优选例中，所述药物还用于抗cAMP-EPAC1通路诱导的病毒感染。

在另一优选例中，所述病毒选自下组：VSV、NDV、HSV-1、MLV、或其组合。

在另一优选例中，所述激动剂包括ATP类化合物。

在另一优选例中，所述激动剂选自下组：ATP、ADP、UDP、或其组合。

在另一优选例中，所述的p2y13蛋白是ADP的受体蛋白。

在另一优选例中，所述的p2y13蛋白选自下组：

(A)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的多肽：MTAAIRRQRELSILPKVTLEAMNTTVMQGFNRSERCPRDTRIVQLVFPALYTVVFLTGILLNTLALWVFVHIPSSSTFIIYLKNTLVADLIMTLMLPFKILSDSHLAPWQLRAFVCRFSSVIFYETMYVGIVLLGLIAFDRFLKIIRPLRNIFLKKPVFAKTVSIFIWFFLFFISLPNTILSNKEATPSSVKKCASLKGPLGLKWHQMVNNICQFIFWTVFILMLVFYVVIAKKVYDSYRKSKSKDRKNNKKLEGKVFVVVAVFFVCFAPFHFARVPYTHSQTNNKTDCRLQNQLFIAKETTLFLAATNICMDPLIYIFLCKKFTEKLPCMQGRKTTASSQENHSSQTDNITLG；

(B)将SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的p2y12蛋白衍生物，或其活性片段；

(C)序列与SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％的p2y13蛋白衍生物，或其活性片段。

在另一优选例中，所述的p2y13基因编码p2y13蛋白。

在另一优选例中，所述的p2y13基因为编码如SEQ ID NO.:1所示p2y13蛋白的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的p2y13基因为如SEQ ID NO.:2：ATGACTGCCGCCATAAGAAGACAGAGAGAACTGAGTATCCTCCCAAAGGTGACACTGGAAGCAATGAACACCACAGTGATGCAAGGCTTCAACAGATCTGAGCGGTGCCCCAGAGACACTCGGATAGTACAGCTGGTATTCCCAGCCCTCTACACAGTGGTTTTCTTGACCGGCATCCTGCTGAATACTTTGGCTCTGTGGGTGTTTGTTCACATCCCCAGCTCCTCCACCTTCATCATCTACCTCAAAAACACTTTGGTGGCCGACTTGATAATGACACTCATGCTTCCTTTCAAAATCCTCTCTGACTCACACCTGGCACCCTGGCAGCTCAGAGCTTTTGTGTGTCGTTTTTCTTCGGTGATATTTTATGAGACCATGTATGTGGGCATCGTGCTGTTAGGGCTCATAGCCTTTGACAGATTCCTCAAGATCATCAGACCTTTGAGAAATATTTTTCTAAAAAAACCTGTTTTTGCAAAAACGGTCTCAATCTTCATCTGGTTCTTTTTGTTCTTCATCTCCCTGCCAAATACGATCTTGAGCAACAAGGAAGCAACACCATCGTCTGTGAAAAAGTGTGCTTCCTTAAAGGGGCCTCTGGGGCTGAAATGGCATCAAATGGTAAATAACATATGCCAGTTTATTTTCTGGACTGTTTTTATCCTAATGCTTGTGTTTTATGTGGTTATTGCAAAAAAAGTATATGATTCTTATAGAAAGTCCAAAAGTAAGGACAGAAAAAACAACAAAAAGCTGGAAGGCAAAGTATTTGTTGTCGTGGCTGTCTTCTTTGTGTGTTTTGCTCCATTTCATTTTGCCAGAGTTCCATATACTCACAGTCAAACCAACAATAAGACTGACTGTAGACTGCAAAATCAACTGTTTATTGCTAAAGAAACAACTCTCTTTTTGGCAGCAACTAACATTTGTATGGATCCCTTAATATACATATTCTTATGTAAAAAATTCACAGAAAAGCTACCATGTATGCAAGGGAGAAAGACCACAGCATCAAGCCAAGAAAATCATAGCAGTCAGACAGACAACATAACCTTAGGCTGA所示的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的p2y13蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示)或p2y13基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示)来源于人。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，包括：

(a)p2y13蛋白的激动剂、或p2y13基因的激动剂；和

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(i)占所述药物组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

在另一优选例中，所述药物组合物还含有其它可(i)抗病毒感染；(ii)抑制病毒的复制；和/或(iii)降低病毒引起的细胞病变和细胞存活的药物。

在另一优选例中，所述其它可抗病毒感染的药物选自下组：IFN-α。

在本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性的抗病毒感染的方法，包括步骤：

在p2y13蛋白的激动剂、或p2y13基因的激动剂存在下，培养细胞，从而抗病毒感染。

在另一优选例中，所述激动剂包括ATP类化合物。

在另一优选例中，所述激动剂选自下组：ATP、ADP、UDP或其组合。

在另一优选例中，所述细胞选自下组：巨噬细胞、肾上皮细胞或其组合。

在另一优选例中，所述病毒选自下组：VSV、NDV、HSV-1、MLV、或其组合。

在另一优选例中，所述抗病毒感染包括：(i)抑制病毒的复制；和/或(ii)降低病毒引起的细胞病变和细胞存活。

在另一优选例中，所述p2y13蛋白的激动剂、或p2y13基因的激动剂的作用浓度为25-1000μM，较佳地，100-800μM，更佳地，300-500μM。

在本发明的第四方面，提供了一种筛选抗病毒感染的候选药物的方法，包括步骤：

(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达cAMP、EPAC1的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的cAMP、和/或EPAC1基因的表达量E1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中cAMP、和/或EPAC1基因的表达量E2；

(b)对E1和E2进行比较，如果E1显著低于E2，则表示所述测试化合物是抗病毒感染的候选药物。

在另一优选例中，所述“显著低于”指E1/E2≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(c)：将步骤(b)中确定的抗病毒感染的候选药物施用于哺乳动物的动物模型，测定其对所述动物模型中的抗病毒感染的影响。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了IFN信号促进P2Y13表达。(A)用IFN-α、IFN-β或IFN-γ(100ng/ml)刺激小鼠BMDM细胞2小时，Q-PCR检测P2Y13家族成员mRNA表达情况；(B)用IFN-β(100ng/ml)刺激小鼠PEM细胞4或8小时，用Western blotting检测P2Y13蛋白表达；(C)将小鼠BMDM细胞预先用干扰素受体的抗体处理4小时，然后用IFN-β(100ng/ml)刺激细胞4小时，Q-PCR检测P2Y13mRNA表达；(D)将小鼠PEM细胞预先用Ruxolitinib(10μg/ml)处理1小时，然后用IFN-β(100ng/ml)刺激细胞4小时，Q-PCR检测ISG15和P2Y13 mRNA表达；(E)将小鼠PEM细胞预先用fludarabine(100μg/ml)处理半小时，然后用IFN-β(100ng/ml)刺激细胞4小时，Q-PCR检测ISG15和P2Y13 mRNA表达；(F)将小鼠PEM细胞预先用fludarabine(100μg/ml)处理半小时，然后用VSV(MOI＝1)感染细胞12小时，Q-PCR检测P2Y13 mRNA表达；(G)TLR3+/+和TLR3-/-小鼠PEM细胞分别用poly(I:C)(20μg/ml)刺激4h,Q-PCR检测IFN-β,ISG15和P2Y13mRNA表达。

图2显示了ADP保护小鼠和人细胞系抵抗病毒感染。(A)将RAW264.7细胞感染VSV(MOI＝0.01),在图注的时间点检测ADP的释放量；(B)将小鼠BMDM细胞感染VSV(MOI＝1)在图注的时间点检测ADP的释放量；(C)将小鼠BMDM细胞感染NDV(MOI＝0.1)36小时然后检测ADP的释放量；(D)HEK293T细胞用HSV-1(MOI＝0.01)感染24h,检测ADP释放水平；(E)用ADP处理RAW264.7细胞不同时间段后，用VSV(MOI＝0.01)感染细胞12小时，Q-PCR检测VSV RNA复制；(F)用不同浓度的ADP处理RAW264.7细胞6小时，然后用用VSV(MOI＝0.01)感染细胞12小时，Q-PCR检测VSV RNA复制；(G)用ADP(100μM)处理RAW264.7细胞6小时，随后用VSV(MOI＝0.01),NDV(MOI＝0.01)和HSV-1(MOI＝0.01)感染细胞12小时,Q-PCR检测病毒RNA复制；(H)用不同浓度的ADP处理BMDM细胞6小时，然后用VSV(MOI＝1)感染细胞12小时，收集细胞上清并用空斑实验检测病毒滴度；(I和J)用ADP(100μM)处理BMDM细胞6小时然后用NDV(MOI＝0.1)和HSV-1(MOI＝0.1)病毒感染细胞24小时，Q-PCR检测病毒RNA复制。(K)用不同浓度的ADP处理RAW264.7细胞6小时，然后用VSV(MOI＝0.01)感染细胞24小时，用MTS检测细胞活性；(L)RAW264.7和HEK293T一系列浓度ADP处理24h，用MTS检测细胞活性；(M)HEK293T细胞用ADP(100μM)处理6小时后用VSV(MOI＝0.01)感染12h.将细胞固定并用结晶紫染色，拍照。Scale bars＝200μm；(N)HEK293T用ADP(100μM or 400μM)处理6h然后用HSV-1(MOI＝0.01)感染12h.将细胞固定并用结晶紫染色，拍照。Scale bars＝200μm；(O)HEK293T细胞；(P)HeLa细胞用ADP(100μM or 400μM)处理6小时后用VSV-GFP(MOI＝0.01)感染24h.流式分析GFP细胞比例；(Q)HEK293T细胞；(R)HeLa细胞按(O)处理后用MLV-GFP(as indicated MOI)感染24h。流式分析GFP细胞比例；(S)RAW264.7细胞用ADP或ADP-β-s(100μM)处理6h然后感染VSV(MOI＝0.01)12h,Q-PCR检测VSV RNA复制。

图3显示了ADP通过P2Y₁₃受体抵抗病毒感染。(A)用VSV(MOI＝0.01)感染RAW 264.7细胞2小时，Q-PCR P2Y1、P2Y12和P2Y13 mRNA的表达；(B)用Poly(I:C)(20μg/ml)刺激小鼠BMDM细胞不同时间段，Q-PCR P2Y1、P2Y12和P2Y13 mRNA的表达；(C)用MRS 2179(10μM)预先处理RAW264.7细胞30分钟，然后用ADP(100μM)处理细胞6小时。将细胞感染VSV(MOI＝0.01)12小时,Q-PCR检测VSV RNA复制；(D)用MRS 2211(图注浓度)预先处理RAW264.7细胞1小时，然后用ADP(100μM)处理细胞6小时。将细胞感染VSV(MOI＝0.01)12小时,Q-PCR检测VSV RNA复制，空斑实验检测病毒滴度；(E和F)用MRS 2211(图注浓度)预先处理RAW264.7细胞1小时，然后用ADP(100μM)处理细胞6小时。将细胞感染NDV(MOI＝0.01)和HSV-1(MOI＝0.01)16小时,Q-PCR检测病毒RNA复制；(G和H)RAW264.7细胞用一系列浓度的MRS 2179 or MRS2211处理24h,MTS检测细胞活性；(I)WT,P2Y1-/-,P2Y12-/-和P2Y13-/-小鼠BMDMs用ADP(100μM)处理6小时然后用VSV(MOI＝1)感染细胞12小时,Q-PCR检测VSV RNA复制；(J)P2Y13+/+和P2Y13-/-PEM细胞用ADP(100μM)处理6小时然后用VSV(MOI＝1)感染细胞12小时,Q-PCR检测VSV RNA复制；(K)P2Y13+/+和P2Y13-/-PEM用VSV(MOI＝1)感染一定时间，用Western blotting检测VSV-G表达水平；(L)HeLa细胞用Lipo2000转染pcDNA3.1或P2Y13质粒(1μg用于12孔板)48h,Western blotting检测P2Y13表达；(M)HeLa细胞用Lipo2000转染pcDNA3.1或P2Y13质粒(1μg用于12孔板)48h,将细胞感染VSV(NOI＝0.01)12h,Q-PCR检测VSV复制。

图4显示了ADP/P2Y₁₃保护小鼠抵抗病毒感染。(A)8周龄P2Y13+/+或P2Y13-/-mice小鼠腹腔注射50mg/kg ADP 6小时后再腹腔注射1×10⁸pfu/g VSV病毒，重复此操作5天，统计小鼠存活率；(B)6周龄小鼠腹腔注射50mg/kg ADP 6小时后再腹腔注射1×10⁸pfu/g VSV病毒，病毒感染24小时后处死小鼠，Q-PCR检测小鼠器官中VSV RNA复制；(C)6周龄小鼠腹腔注射50mg/kg ADP 6小时后再腹腔注射1×10⁷pfu/g HSV-1病毒，病毒感染36小时后处死小鼠，Q-PCR检测小鼠肝脏中HSV-1RNA复制；(D)8周龄P2Y13+/+或P2Y13-/-小鼠腹腔注射1×10⁸pfu/g VSV病毒，感染24小时后Q-PCR检测小鼠肝脏中VSV RNA复制；(E)6周龄小鼠同ADP(5mg/kg)滴鼻小鼠6小时，然后用VSV(1×10⁸pfu/g)滴鼻感染小鼠24小时。Q-PCR检测嗅球VSV RNA复制；(F)6周龄小鼠同ADP(5mg/kg)滴鼻小鼠6小时，然后用VSV(1×10⁸pfu/g)滴鼻感染小鼠24小时。免疫荧光检测小鼠嗅球VSV-G表达量。

图5显示了cAMP参与到ADP抗病毒感染过程。(A)小鼠BMDM细胞用ADP(100μM)刺激不同时间段，Q-PCR检测IFN-α和IFN-βmRNA表达水平；(B)小鼠BMDM细胞用不同浓度的ADP或用VSV(MOI＝1)处理6h,Q-PCR检测IFN-α和IFN-β mRNA表达水平；(C)用MRS 2211(50μM)预处理RAW264.7细胞1小时后用ADP(100μM)处理细胞2小时,ELISA检测胞内cAMP；(D)RAW264.7用VSV(MOI＝0.01)感染4h,ELISA检测胞内cAMP；(E)P2Y13+/+或P2Y13-/-小鼠PEM细胞用VSV(MOI＝1)感染4h,ELISA检测胞内cAMP；(F)RAW264.7细胞用forskolin(100μM)预处理1h随后用ADP(100μM)处理6小时。将细胞感染VSV(MOI＝0.01)12小时,Q-PCR检测VSVRNA复制；(G)Hela细胞用forskolin(50μM)预处理1h后用ADP(100μM)处理6小时。将细胞感染VSV(MOI＝0.01)12小时,Q-PCR检测VSV RNA复制；(H)RAW264.7细胞用cAMP(5 or 10μM)处理6h用VSV(MOI＝0.01)感染12h.Q-PCR检测VSV RNA复制，空斑实验检测病毒滴度；(I)RAW264.7细胞用cAMP(5μM)处理6h后用HSV-1(MOI＝0.01)感染细胞16h.Q-PCR检测HSV-1RNA复制；(J)HEK293T预先用cAMP(5 or 10μM)处理30min然后用ADP(100μM)处理6小时，用VSV(MOI＝0.01)感染细胞12h.Q-PCR检测VSV RNA复制；(K)HEK293T细胞用cAMP(10μM)处理30min然后用ADP(100μM)处理6小时，用VSV(MOI＝0.01)感染细胞12h.将细胞固定并用结晶紫染色，拍照。Scale bars＝200μm；(L)HEK293T细胞用KH7(5μM)处理30min然后用VSV(MOI＝0.01)感染细胞12h.将细胞固定并用结晶紫染色，拍照。Scale bars＝200μm；(M)HEK293T细胞用KH7(5 or 10μM)处理30min然后用VSV(MOI＝0.01)感染细胞12h.Q-PCR检测VSV RNA复制；(N和O)RAW264.7预先用KH7(10μM)处理1h然后用ADP(100μM)处理6h.将细胞感染VSV(MOI＝0.01)12小时,Q-PCR检测VSV RNA复制，空斑实验检测病毒滴度；(P)RAW264.7预先用KH7(10μM)处理1h然后用ADP(100μM)处理6h.将细胞感染HSV-1(MOI＝0.01)16小时,Q-PCR检测HSV-1RNA复制。(Q)RAW264.7用一系列浓度的forskolin处理24h,MTS检测细胞活性；(R和S)HEK293T用一系列浓度cAMP或者KH7 for 24h,处理24h,MTS检测细胞活性。

图6显示了ADP抗病毒感染以来于EPAC1。(A-C)HeLa细胞用一系列浓度的ESI-09,HJC0350 or H89处理24h,MTS检测细胞活性；(D)HeLa细胞用ESI-09(10μM),HJC0350(10μM),H89(10μM)or ADP(100μM)处理6h后用VSV(MOI＝0.01)感染12h,Q-PCR检测VSV RNA复制；(E)HeLa细胞用H89(10μM)处理1h后用ADP(100μM)处理细胞6h，将细胞感染VSV(MOI＝0.01)12小时,Q-PCR检测VSV RNA复制；(F)HeLa细胞用H89(10μM)处理1h后用ADP(100μM)处理细胞6h，将细胞感染HSV-1(MOI＝0.01)16小时,Q-PCR检测HSV-1RNA复制；(G)HeLa细胞用ESI-09(10μM)处理1h后用ADP(100μM)处理细胞6h,将细胞感染VSV(MOI＝0.01)12小时,Q-PCR检测VSV RNA复制；(H和I)HeLa细胞用ESI-09(10μM)处理1h后用ADP(100μM)处理细胞6h,将细胞感染HSV-1(MOI＝0.01)或NDV(MOI＝0.01)16小时。用Q-PCR检测病毒RNA复制；(J)RAW264.6细胞用ESI-09(10μM)处理1h后用ADP(100μM)处理细胞6h,将细胞感染HSV-1(MOI＝0.01)16小时。用Q-PCR检测HSV-1RNA复制；(K)HeLa细胞用HJC0350(10μM)处理1h后用ADP(100μM)处理6h.将细胞用VSV(MOI＝0.01)感染12h,Q-PCR检测VSV RNA复制；(L)HeLa细胞用ESI-09(10μM)处理1h后用ADP(100μM)处理细胞6h,将细胞感染VSV(MOI＝0.01)12小时,用Western blotting检测VSV-G表达；(M)EPAC1+/+和EPAC1-/-HeLa细胞用VSV(MOI＝0.01)感染12h,用Western blotting检测EPAC1表达；(N)EPAC1+/+和EPAC1-/-HeLa细胞用ADP(100μM)处理6h后用VSV(MOI＝0.01)感染细胞12h,Q-PCR检测VSV RNA复制；(O)EPAC1+/+和EPAC1-/-HeLa细胞用ADP(100μM)处理6h后用VSV(MOI＝0.01)感染细胞12h,用Westernblotting检测VSV-G表达。(P)RAW264.7细胞用ESI-09(10μM)处理6h后用VSV(MOI＝0.01)感染12h,Q-PCR检测VSV RNA复制；(Q)RAW264.7用ESI-09(10μM)处理6h后用HSV-1(MOI＝0.01)感染16h,Q-PCR检测HSV-1复制；(R)EPAC1+/+和EPAC1-/-HeLa细胞用HSV-1(MOI＝0.01)感染16h,Q-PCR检测HSV-1复制。

图7显示了ADP抑制EPAC1表达。(A)RAW264.7用VSV(MOI＝0.01),NDV(MOI＝0.01)和HSV-1(MOI＝0.01)感染12h,Q-PCR检测EPAC1表达水平；(B)P2Y13+/+或P2Y13-/-小鼠PEM细胞用VSV(MOI＝1)感染2h,Q-PCR检测EPAC1表达水平；(C)小鼠PEM细胞用VSV(MOI＝1)感染不同时间,用Western blotting检测EPAC1表达；(D)HeLa细胞用NDV(MOI＝0.01)感染24h，Western blotting检测EPAC1表达；(E)RAW264.7细胞用ADP(200μM or 400μM)处理6h后用VSV(MOI＝1)感染细胞6h,Western blotting检测EPAC1表达；(F)HEK293T用一系列浓度的ADP处理1h然后以VSV(MOI＝0.01)感染细胞2h,Q-PCR分析EPAC1表达情况；(G)HeLa细胞用100μM或400μM ADP处理2h，Q-PCR检测EPAC1表达水平；(H和I)RAW264.7细胞和PEM细胞用ADP(200μM)处理2h,Q-PCR检测EPAC1表达水平；(J和K)HeLa细胞和PEM细胞用ADP(400μM)处理8h,用Western blotting检测EPAC1表达。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外的发现，IFN可以明显诱导P2Y13的表达，它的配体ADP在病毒感染过程中可以作为危险信号被释放到细胞外部。这些胞外ADP可以通过激活P2Y13受体来抑制cAMP、和/或EPAC1的表达，从而保护机体抵抗病毒感染。基于此，本发明证明了ADP/P2Y13在抗病毒感染过程中具有重要作用，可以作为治疗病毒感染的潜在靶点。在此基础上完成了本发明。

术语

p2y13蛋白、p2y13基因

p2y13蛋白是ADP的特异受体之一。

如本文所用，术语“p2y13蛋白”、“ADP受体p2y13”可以互换使用。本领域的普通技术人员可使用常规方法获得p2y13蛋白的序列，如从NCBI获取。

如本文所用，术语“p2y13基因”、“p2y13编码基因”、“p2y13蛋白的编码序列”可以互换使用，都是指编码p2y13蛋白的多核苷酸序列。本领域的普通技术人员可使用常规方法获得p2y13基因的序列，如从NCBI获取。

本发明的p2y13蛋白可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。本发明的p2y13蛋白可以是天然纯化的产物或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的p2y13蛋白可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的p2y13蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括具有p2y13蛋白或p2y13蛋白活性的p2y13蛋白多肽片段和类似物。

如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持天然p2y13蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明还包括与本发明的天然p2y13蛋白具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明包括天然p2y13蛋白类似物与天然p2y13蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

在本发明的一个优选例中，p2y13蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示(来源于人)。

本发明还提供了编码p2y13蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：p2y13蛋白或p2y13基因的激动剂。

活性成分为p2y13蛋白或p2y13基因的激动剂的药物组合物用于抵抗病毒感染。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

ADP/P2Y13

ADP是嘌呤信号的一种，在机体中，其主要来源于ATP代谢产物。ADP的受体有3个，即P2Y1、P2Y12和P2Y13，它们都是P2Y受体，都属于GPCRs。其中P2Y1是与Gαq偶联，激活后可以激活PLCβ及其下游的钙流信号通路。P2Y12和P2Y13与Gαi偶联，激活后可以抑制腺苷酸环化酶的活性，从而抑制环化腺苷酸即cAMP的合成[4,5]。本发明发现P2Y13是一个典型的干扰素诱导基因(ISG)，它的配体ADP在病毒感染过程中会被明显的释放到细胞外部，这些ADP可以抵抗多种病毒感染包括RNA和DNA病毒。ADP/P2Y13可以通过抑制cAMP的合成并抑制EPAC1的表达，从而起到抗病毒的作用。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明所述的激活P2Y13受体或抑制cAMP/EPAC1信号通路对于治疗病毒感染具有重要的研究价值。

(b)本发明首次发现，胞外ADP可以通过激活P2Y13受体来抑制cAMP、和/或EPAC1的表达，从而保护机体抵抗病毒感染。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

1.实验动物

本发明所使用的小鼠皆为C57BL/6背景小鼠。其中本发明利用常规的CRISPR/Cas9系统敲除P2Y1和P2Y13基因。P2Y12基因敲除小鼠为交通大学刘俊岭教授馈赠。野生型小鼠从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买。所有实验小鼠均饲养于华东师范大学SPF级实验动物中心，所有动物实验均遵守华东师范大学动物伦理委员会要求。

2.实验试剂

ADP、ADP-β-s、MRS 2179、Forskolin、cAMP、KH7、ESI-09、H89、β-肌动蛋白和VSV-G抗体购买自Sigma-Aldrich公司、Ruxolitinib买自TargetMol公司、Fludarabine买自Calbiochem公司、Polyinosinic-polycytidylic acid[Poly(I:C)]买自Invivogen公司、ADP检测试剂盒买自Promega公司、MRS 2211和P2Y13抗体买自Abcam公司、HJC0350买自Selleck公司、EPAC1抗体买自北京博奥森生物技术有限公司、反转录试剂盒和SYBR试剂买自Takara公司、干扰素-α、干扰素-β、和干扰素-γ买自北京义翘科技有限公司、cAMP检测试剂盒、小鼠干扰素受体的抗体(AF1083)和和对照免疫球蛋白买自R&D公司、P2Y13质粒买自巴傲德生物科技有限公司。

3.细胞培养

小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)制备方式如下:用DMEM培养基冲出小鼠股骨和胫骨中的骨髓，吹打混匀后用40-μm细胞筛网过滤以除去细胞团块。将细胞悬液离心并用以下培养基(DMEM基础培养基，10％胎牛血清FBS，100μg/ml链霉素，100U/ml青霉素以及20％L929细胞培养基上清。)诱导为成熟BMDM细胞。

小鼠腹腔巨噬细胞(PEM)制备方式如下:小鼠注射4％巯基乙酸盐肉汤培养基3mL，诱导3天。用10mLPBS冲洗小鼠腹腔得到PEM细胞悬液。70-μm cell筛网过滤后离心，重悬。其培养条件为：DMEM基础培养基，10％胎牛血清FBS，100μg/ml链霉素，100U/ml青霉素。

RAW264.7，HeLa和HEK-293T细胞，从American Type Culture Collection(ATCC)购买而来。其培养条件为：DMEM基础培养基，10％胎牛血清FBS，100μg/ml链霉素，100U/ml青霉素。

4.RNA提取及Q-PCR检测

细胞刺激后用RNAiso plus(Takara)裂解细胞，提取RNA并用PrimeScript RTMaster Mix Perfect Real Time Kit(TaKaRa)合成cDNA,以500ng cDNA为模板进行Q-PCR检测。

5.ADP释放检测

RAW264.7细胞，小鼠BMDM细胞和HEK293T细胞以2×10⁵每孔接种24孔板，细胞贴壁过夜后用病毒刺激细胞。收集细胞培养基上清并用ADP-Glo^TMKinase Assay Kit检测病毒感染后细胞释放ADP的量。

6.MTS检测细胞活性或存活

RAW 264.7细胞以2×10⁴个每孔，HeLa和HEK-293T细胞1×10⁴个每孔接种96孔板，经过相应的刺激后每孔加20μL MTS并在37℃反应1小时，在490nm处测吸光值，未处理组细胞作为100％进行数据分析。

7.流式检测病毒感染

HeLa和HEK293T细胞以1.5×10⁵密度接种24孔板.细胞经ADP处理6小时后感染VSV-GFP或MLV-GFP病毒24小时。通过流式分析含GFP阳性细胞分析病毒的感染情况。

8.结晶紫染色实验

HEK293T细胞以8×10³个细胞每孔接种96孔板。贴壁过夜后处理细胞，细胞经12小时VSV(MOI＝0.01)或HSV-1(MOI＝0.01)感染后用4％多聚甲醛固定细胞20分钟，随后用结晶紫染色30分钟，用PBS清洗细胞5次后拍照。

9.Immunoblot实验

细胞接种6孔板，经过刺激后用RIPA裂解液裂解细胞。蛋白经10％SDS-PAGE跑胶,转移到NC膜，5％BSA封闭.孵育相应的一抗过夜，用相应的荧光二抗染色，在Odyssey laserdigital imaging system(Gene Company)扫膜。

10.病毒感染

细胞感染病毒的时间和剂量根据各实验标记。对于小鼠存活实验，8周龄小鼠腹腔注射50mg/kg ADP 6小时后再腹腔注射1×10⁸pfu/g VSV病毒，重复此操作5天，统计小鼠存活率。对于检查小鼠体内病毒复制情况，6-8周龄小鼠腹腔注射50mg/kg ADP 6小时后再腹腔注射1×10⁸pfu/g VSV病毒或1×10⁷pfu/g HSV-1病毒，感染相应时间后分离小鼠内脏器官并提取RNA用Q-PCR方法检测病毒RNA的复制。

11.病毒空斑实验

将Vero细胞以2×10⁵个每孔接种12孔板，贴壁过夜后进行病毒感染。将病毒感染细胞后的上清进行梯度稀释并感染Vero细胞1小时,随后将细胞上清移除并用含低熔点琼脂的DMEM培养基覆盖培养细胞。20小时后显微镜下统计病毒空斑的形成数量。

12.免疫荧光实验

将6周的小鼠麻醉后用5mg/kg ADP滴鼻处理小鼠6小时，随后滴鼻1×10⁸pfu/gVSV病毒。感染24小时后处死小鼠并分离小鼠嗅球，4％多聚甲醛固定过夜，随后包埋进行冰冻切片，8-μm厚度，切片经0.1％Triton X-100通透和5％BSA封闭后用VSV-G抗体孵育组织切片过夜，用Alexa-Fluor-488-conjugated荧光二抗孵育组织切片2小时。DAPI染色后拍照。

13.ELISA实验

将1×10⁶或2×10⁶个RAW264.7细胞或PEM细胞接种6孔板，贴壁过夜后刺激细胞，刺激过后用200μl裂解液裂解细胞，通过R&D Systems的cAMP检测试剂盒检测cAMP的量。

14.构建EPAC1基因敲除细胞系

利用CRISPR/Cas9系统构建EPAC1敲除细胞系。敲除靶点为5′-AAATGCACTCCGGACCACG-3′.将含有靶点序列的Lenticrisprv2质粒转染至HeLa细胞，3天后用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞，挑选单个克隆细胞并培养，通过Western blotting实验鉴定EPAC1表达以此得到成功敲除EPAC1的细胞系。

15.数据分析

所有数据通过GraphPad Prism软件进行分析，以mean±SD形式体现。Student t-test(two-tailed)方法分析数据统计学差异，p值<0.05被认为具有显著差异。

实施例1.

IFN通过JAK/STAT通路促进P2Y13表达

为探究P2Y家族成员在抗病毒感染过程中的潜在作用，本发明人将小鼠BMDM细胞用IFN-α、IFN-β和IFN-γ刺激，通过Q-PCR检测P2Y家族成员在干扰素刺激后表达的变化。如图1A所示,几种IFN都可以明显上调P2Y13的表达。IFN-β刺激后P2Y13蛋白表达也发生明显上调(图1B)。此外，当用抗干扰素受体的抗体封闭干扰素受体后，由IFN-β促进的P2Y13表达又被明显的抑制(图1C)。说明P2Y13的表达受到IFN下游信号的调控。JAK/STAT通路是IFN下游经典的信号通路，对IFN介导的抗病毒作用至关重要。为探究IFN促进P2Y13是否通过JAK/STAT1通路，用ruxolitinib(JAK1抑制剂)和fludarabine(STAT1抑制剂)分别抑制JAK和STAT1的活性，发现它们可以明显地抑制由IFN引起的P2Y13表达上调(图1D和E)。抑制STAT1也可以明显抑制VSV诱导P2Y13表达上调(图1F)。此外，敲除TLR3后也可以明显阻断TLR3介导的IFN所促进的P2Y13表达上调(图1G)。以上结果表明P2Y13具有典型的干扰素诱导基因的特征。

实施例2.

胞外ADP可以保护细胞抵抗病毒感染

作为嘌呤受体的内源性配体，ADP可以被损伤的细胞释放到细胞外并激活细胞表面P2Y1、P2Y12和P2Y13受体。为探究ADP在病毒感染过程中的潜在功能，首先检测在病毒感染过程中ADP的释放量。如图2A、B、C和D所示，病毒感染可以明显促进细胞释放大量ADP。揭示病毒感染过程中ADP可以作为一个危险信号被释放到细胞外部。为探究这些ADP的生物学意义，本发明人用ADP处理细胞后再用不同病毒感染细胞，发现ADP处理后的细胞，其病毒的复制明显降低，如可以明显降低VSV、HSV-1、NDV的复制(图2E-J)。而且，ADP处理后也可以明显提高由VSV病毒降低的细胞活性(图2K)(ADP本身对细胞增殖并无太大影响图2L)。此外，ADP也可以明显降低由VSV或HSV引起的细胞病变情况(图2M、N)。对VSV-GFP、MLV-GFP病毒也具有明显的抑制作用(图2O-R)。为排除是ADP的降解产物引起的抗病毒功能，本发明人用非降解的ADP类似物ADP-β-s处理细胞，发现ADP-β-s同样具有良好的抗病毒功能(图2S)。

实施例3.

胞外ADP主要通过P2Y13受体抵抗病毒感染

为探究ADP是通过那个受体起到抗病毒感染作用，本发明人首先检测了病毒感染后ADP受体P2Y1、P2Y12和P2Y13的表达情况，如图3A所示，VSV感染后只有P2Y13的表达出现了明显的上调，而P2Y1和P2Y12没有明显的变化。用Poly(I:C)刺激BMDM细胞也发现P2Y13表达明显上调(图3B)。随后本发明人用MRS 2179和MRS 2211分别抑制P2Y1和P2Y13受体，发现ADP介导的抗病毒活性可以被MRS2211明显抑制，而不被MRS21799影响。且MRS2179和MRS2211对细胞活性并无影响(图3C-H)。与此相似，只有敲除P2Y13受体才能降低ADP的抗病毒功能，且P2Y13敲除后可以明显促进病毒复制，过表达P2Y13可以抑制病毒复制(图3I-M)。因此通过以上实验发现，P2Y13缺失可以促进VSV复制且ADP介导的抗病毒功能主要是通过P2Y13受体实现的。

实施例4.

ADP/P2Y13可以保护小鼠抵抗病毒感染

为探究ADP/P2Y13在体内抗病毒功能，本发明人将野生型和P2Y13敲除型小鼠用致死剂量的VSV病毒感染。如图4A所示，ADP可以明显降低WT小鼠的死亡率，而不能降低P2Y13敲除小鼠的死亡率，与野生型小鼠相比，P2Y13敲除小鼠的死亡率也更高。小鼠腹腔注射ADP后可以明显降低器官中病毒的复制(图4B、C)。此外,P2Y13敲除后病毒的复制也增强(图4D)。作为噬神经病毒，VSV可以通过皮肤或黏液入侵机体神经系统。为了模仿VSV的天然感染过程，本发明人将ADP滴鼻处理后的小鼠用VSV进行滴鼻感染。如图4E和F所示,ADP处理后，小鼠嗅球中VSVRNA复制和VSV-G表达都被明显的抑制。以上实验结果说明ADP/P2Y13可以保护小鼠抵抗病毒感染，ADP/P2Y13具有作为抗病毒药物靶点的潜能。

实施例5.

ADP/P2Y13通过抑制cAMP信号从而抑制病毒复制

I型干扰素在抗病毒过程中具有重要的作用。因此本发明人想确定干扰素是否参与到ADP/P2Y13介导的抗病毒感染过程中。用ADP处理小鼠BMDM细胞，发现ADP处理后只能微弱影响IFN的表达(图5A和B)。鉴于ADP良好的抗病毒效果，本发明人猜想是否还有其他因素参与到ADP/P2Y13抗病毒过程中。P2Y13激活后可以抑制腺苷酸环化酶(adenylatecyclase,ADCY)的活性从而抑制cAMP的合成，为了确定这个结果，本发明人用ADP处理了RAW264.7细胞，如图5C所示，发现ADP可以明显降低cAMP的产生，而P2Y13的拮抗剂MRS2211可以明显回复这个过程。然而，让人惊讶的是本发明人发现VSV感染可以明显促进cAMP的产生(图5D)。而且P2Y13敲除细胞在病毒感染后也会产生更多的cAMP(图5E)。因此本发明人检测cAMP是否参与到ADP/P2Y13介导的抗病毒过程中，首先发现ADCY的激动剂forskolin可以明显阻断ADP介导的抗病毒活性(图5F和G)。而且用cAMP处理细胞可已明显促进病毒感染并且降低ADP的抗病毒活性(图5H-K)。与此类似，用ADCY的选择性抑制剂KH7处理细胞可以明显抑制病毒引起的细胞病变和病毒的复制，ADP介导的抗病毒活性可以被KH7明显阻断，且以上结果并不是因为化学试剂的毒性所引起(图5L-S)。因此，通过以上实验证明cAMP信号在ADP/P2Y13抗病毒过程中起重要作用。

实施例6.

ADP/P2Y13抵抗病毒感染依赖于EPAC1

EPAC和PKA是cAMP经典的感应器。因此，本发明人想探究这两个蛋白是否参与到ADP/P2Y13介导的抗病毒感染过程中。首先用安全剂量的ESI-09(EPAC1/2抑制剂)、HJC0350(EPAC2选择性抑制剂)和H89(PKA抑制剂)分别处理HeLa细胞(图6A-C)。如图6D所示,ESI-09和H89都可以明显抑制VSV复制，而HJC0350却不影响。说明EPAC1和PKA可能参与到ADP/P2Y13介导的抗病毒感染过程中。然而当用H89抑制PKA后，并不能阻断ADP的抗病毒活性，而抑制EPAC却可以明显阻断这个过程。用EPAC2选择性抑制剂也不能阻断ADP抗病毒活性(图6E-L)。说明ADP/P2Y13的抗病毒功能主要依赖于EPAC1来实现。为了确定这一结果，本发明人利用CRISPR/Cas9系统构建了EPAC1基因敲除细胞系图6M)。如图6N和O所示,当EPAC1敲除后，ADP引起的VSV RNA复制和VSV-G表达将被明显消除。即ADP/P2Y13的抗病毒功能确实主要依赖于EPAC1来实现的。在RAW264.7细胞抑制EPAC1可以明显抑制VSV和HSV-1的复制，EPAC1敲除后也可以抑制HSV-1复制，说明EPAC1缺失或抑制后也具有广谱的抗病毒作用(图6P-R)。

实施例7.

ADP通过抑制EPAC1表达从而抵抗病毒感染

为了确定EPAC1在病毒感染过程中的重要性，本发明人检测病毒感染后EPAC1的表达情况。如图7A所示，当RAW264.7细胞被VSV、NDV和HSV-1等病毒感染后，EPAC1的RNA表达明显升高。P2Y13缺失PEM细胞在VSV病毒感染后也会表达更多的EPAC1(图7B)。此外，在蛋白水平也发现病毒可以明显上调EPAC1的表达(图7C和D)。然而值得关注的是VSV引起的EPAC1表达上调可以被ADP明显地抑制(图7E和F)。为了排除这种抑制是由于ADP降低了病毒复制而引起，用ADP直接处理细胞，发现ADP处理后EPAC1的RNA水平和蛋白水平都出现了明显的下调，这些结果说明ADP主要通过抑制EPAC1的表达从而抵抗病毒感染(图7G-K)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献：

1.Eltzschig,H.K.,M.V.Sitkovsky,and S.C.Robson,Purinergic signalingduring inflammation.N Engl J Med,2012.367(24):p.2322-33.

2.Cho,J.,et al.,Purinergic P2Y(1)(4)receptor modulates stress-inducedhematopoietic stem/progenitor cell senescence.J Clin Invest,2014.124(7):p.3159-71.

3.Ralevic,V.and G.Burnstock,Receptors for purines andpyrimidines.Pharmacol Rev,1998.50(3):p.413-92.

4.Zhang,D.,et al.,Two disparate ligand-binding sites in the humanP2Y1 receptor.Nature,2015.520(7547):p.317-21.

5.Shinozaki,Y.,et al.,Transformation of Astrocytes to aNeuroprotective Phenotype by Microglia via P2Y1 Receptor Downregulation.CellRep,2017.19(6):p.1151-1164。

序列表

<110> 华东师范大学

上海邦耀生物科技有限公司

<120> P2Y13激动剂在抗病毒感染中的应用

<130> P2018-0862

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Ala Ala Ile Arg Arg Gln Arg Glu Leu Ser Ile Leu Pro Lys

1 5 10 15

Val Thr Leu Glu Ala Met Asn Thr Thr Val Met Gln Gly Phe Asn Arg

20 25 30

Ser Glu Arg Cys Pro Arg Asp Thr Arg Ile Val Gln Leu Val Phe Pro

35 40 45

Ala Leu Tyr Thr Val Val Phe Leu Thr Gly Ile Leu Leu Asn Thr Leu

50 55 60

Ala Leu Trp Val Phe Val His Ile Pro Ser Ser Ser Thr Phe Ile Ile

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Asn Thr Leu Val Ala Asp Leu Ile Met Thr Leu Met Leu

85 90 95

Pro Phe Lys Ile Leu Ser Asp Ser His Leu Ala Pro Trp Gln Leu Arg

100 105 110

Ala Phe Val Cys Arg Phe Ser Ser Val Ile Phe Tyr Glu Thr Met Tyr

115 120 125

Val Gly Ile Val Leu Leu Gly Leu Ile Ala Phe Asp Arg Phe Leu Lys

130 135 140

Ile Ile Arg Pro Leu Arg Asn Ile Phe Leu Lys Lys Pro Val Phe Ala

145 150 155 160

Lys Thr Val Ser Ile Phe Ile Trp Phe Phe Leu Phe Phe Ile Ser Leu

165 170 175

Pro Asn Thr Ile Leu Ser Asn Lys Glu Ala Thr Pro Ser Ser Val Lys

180 185 190

Lys Cys Ala Ser Leu Lys Gly Pro Leu Gly Leu Lys Trp His Gln Met

195 200 205

Val Asn Asn Ile Cys Gln Phe Ile Phe Trp Thr Val Phe Ile Leu Met

210 215 220

Leu Val Phe Tyr Val Val Ile Ala Lys Lys Val Tyr Asp Ser Tyr Arg

225 230 235 240

Lys Ser Lys Ser Lys Asp Arg Lys Asn Asn Lys Lys Leu Glu Gly Lys

245 250 255

Val Phe Val Val Val Ala Val Phe Phe Val Cys Phe Ala Pro Phe His

260 265 270

Phe Ala Arg Val Pro Tyr Thr His Ser Gln Thr Asn Asn Lys Thr Asp

275 280 285

Cys Arg Leu Gln Asn Gln Leu Phe Ile Ala Lys Glu Thr Thr Leu Phe

290 295 300

Leu Ala Ala Thr Asn Ile Cys Met Asp Pro Leu Ile Tyr Ile Phe Leu

305 310 315 320

Cys Lys Lys Phe Thr Glu Lys Leu Pro Cys Met Gln Gly Arg Lys Thr

325 330 335

Thr Ala Ser Ser Gln Glu Asn His Ser Ser Gln Thr Asp Asn Ile Thr

340 345 350

Leu Gly

<210> 2

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgactgccg ccataagaag acagagagaa ctgagtatcc tcccaaaggt gacactggaa 60

gcaatgaaca ccacagtgat gcaaggcttc aacagatctg agcggtgccc cagagacact 120

cggatagtac agctggtatt cccagccctc tacacagtgg ttttcttgac cggcatcctg 180

ctgaatactt tggctctgtg ggtgtttgtt cacatcccca gctcctccac cttcatcatc 240

tacctcaaaa acactttggt ggccgacttg ataatgacac tcatgcttcc tttcaaaatc 300

ctctctgact cacacctggc accctggcag ctcagagctt ttgtgtgtcg tttttcttcg 360

gtgatatttt atgagaccat gtatgtgggc atcgtgctgt tagggctcat agcctttgac 420

agattcctca agatcatcag acctttgaga aatatttttc taaaaaaacc tgtttttgca 480

aaaacggtct caatcttcat ctggttcttt ttgttcttca tctccctgcc aaatacgatc 540

ttgagcaaca aggaagcaac accatcgtct gtgaaaaagt gtgcttcctt aaaggggcct 600

ctggggctga aatggcatca aatggtaaat aacatatgcc agtttatttt ctggactgtt 660

tttatcctaa tgcttgtgtt ttatgtggtt attgcaaaaa aagtatatga ttcttataga 720

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caagaaaatc atagcagtca gacagacaac ataaccttag gctga 1065

Claims (10)

1.一种p2y13蛋白的激动剂、或p2y13基因的激动剂的用途，其特征在于，用于制备一药物，所述药物用于抗病毒感染。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗病毒感染包括：(i)抑制病毒的复制；和/或(ii)降低病毒引起的细胞病变和细胞存活。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还用于：(a)下调cAMP因子的表达；和/或(b)下调EPAC1因子的表达。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的p2y13蛋白选自下组：

(A)氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示的多肽；

(B)将SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列经过一个或几个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的p2y12蛋白衍生物，或其活性片段；

(C)序列与SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥98％，最佳地≥99％的p2y13蛋白衍生物，或其活性片段。

5.一种药物组合物，其特征在于，包括：

(a)p2y13蛋白的激动剂、或p2y13基因的激动剂；和

(b)药学上可接受的载体。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，所述组分(i)占所述药物组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

7.一种体外非治疗性的抗病毒感染的方法，其特征在于，包括步骤：

在p2y13蛋白的激动剂、或p2y13基因的激动剂存在下，培养细胞，从而抗病毒感染。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述p2y13蛋白的激动剂、或p2y13基因的激动剂的作用浓度为25-1000μM，较佳地，100-800μM，更佳地，300-500μM。

9.一种筛选抗病毒感染的候选药物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达cAMP、EPAC1的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的cAMP、和/或EPAC1基因的表达量E1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中cAMP、和/或EPAC1基因的表达量E2；

(b)对E1和E2进行比较，如果E1显著低于E2，则表示所述测试化合物是抗病毒感染的候选药物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述“显著低于”指E1/E2≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。