CN108796101B - 一种鉴定细菌的探针及其鉴定方法和应用 - Google Patents
一种鉴定细菌的探针及其鉴定方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种鉴定细菌的探针及其鉴定方法和应用，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 1‑32所示；本发明巧妙地设计了32条特异性的DNA荧光探针，采用氧化石墨烯纳米片进行荧光淬灭反应，模式识别软件进行数据处理，优化反应条件及步骤，最终建立一套鉴定细菌的完整体系，各步骤各条件协同增效，所述方法操作简便快速，提高了鉴定效率和准确性，具有广阔的应用前景和市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及技术领域，尤其涉及一种鉴定细菌的探针及其鉴定方法和应用。
背景技术
细菌鉴定在医学和工业方面具有重要意义。在医学上，要治愈被细菌感染的病人，医生需要首先知道病人是被何种细菌感染以及该细菌对何种抗生素敏感，才能选择合适的药物将其杀死。在工业上，许多产品都必须经过细菌检测才能销售，这一点在食品工业上尤其严格。当前，常用的细菌鉴定方法有很多局限性，如需要较长的培养时间、专业的实验人员、昂贵的仪器等。
石墨烯纳米片是由单层原子平面结构石墨烯堆垛而成的物质，具有独特的量子效应，在各种溶剂中具备优异的分散性能，具有突出的环境友好性和生物相容性，易于进行表面功能修饰，成为近来研究热点。利用石墨烯进行生物及化学检测的报道屡见不鲜。
CN105460922A公开了一种部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针及其制备方法，通过氧化石墨烯在碱性溶液中的室温控制还原制备部分还原氧化石墨烯，绿色环保，重现性好，但过程复杂，耗时耗力。CN106086173A公开了一种基于上转换荧光共振能量转移的快速细菌检测方法，在纳米金颗粒表面修饰能特异性识别目标细菌的核酸适配子，在稀土上转换荧光颗粒表面修饰与适配子互补配对的cDNA，从而导致荧光淬灭，灵敏度高，特异性好，但操作过程需要专业人员的操作，检测菌种单一，适用范围窄。
因此，提供一种操作简便、快速，对实验人员的专业性要求低，鉴定效率高，成本低的细菌检测方法具有重要意义和广阔的市场前景。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种鉴定细菌的探针及其鉴定方法和应用，本发明巧妙地设计了八条特异性的DNA荧光探针，采用氧化石墨烯纳米片进行荧光淬灭反应，模式识别软件进行数据处理，优化反应条件及步骤，建立一套鉴定细菌的完整体系，各步骤条件协同增效，最终提高了鉴定效率和准确性，具有广阔的应用前景和市场价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种鉴定细菌的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.1-SEQ ID No.32所示。
本发明中，发明人为改进现有技术中鉴定细菌的复杂方法，巧妙地设计了三十二条特异性的DNA探针，所述探针与菌株DNA之间存在易识别和统计分析的差异性的匹配率，能够提高细菌鉴定的准确度和效率。
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.32所示，具体序列如下：
SEQ ID No.1为CCCCCCCCCCCCCCC，命名为P0；
SEQ ID No.2为CCCCCCCCCCCCTTT，命名为P1；
SEQ ID No.3为CCCCCCCCCTTTCCC，命名为P2；
SEQ ID No.4为CCCCCCCCCTTTTTT，命名为P3；
SEQ ID No.5为CCCCCCTTTCCCCCC，命名为P4；
SEQ ID No.6为CCCCCCTTTCCCTTT，命名为P5；
SEQ ID No.7为CCCCCCTTTTTTCCC，命名为P6；
SEQ ID No.8为CCCCCCTTTTTTTTT，命名为P7；
SEQ ID No.9为CCCTTTCCCCCCCCC，命名为P8；
SEQ ID No.10为CCCTTTCCCCCCTTT，命名为P9；
SEQ ID No.11为CCCTTTCCCTTTCCC，命名为P10；
SEQ ID No.12为CCCTTTCCCTTTTTT，命名为P11；
SEQ ID No.13为CCCTTTTTTCCCCCC，命名为P12；
SEQ ID No.14为CCCTTTTTTCCCTTT，命名为P13；
SEQ ID No.15为CCCTTTTTTTTTCCC，命名为P14；
SEQ ID No.16为CCCTTTTTTTTTTTT，命名为P15；
SEQ ID No.17为TTTCCCCCCCCCCCC，命名为P16；
SEQ ID No.18为TTTCCCCCCCCCTTT，命名为P17；
SEQ ID No.19为TTTCCCCCCTTTCCC，命名为P18；
SEQ ID No.20为TTTCCCCCCTTTTTT，命名为P19；
SEQ ID No.21为TTTCCCTTTCCCCCC，命名为P20；
SEQ ID No.22为TTTCCCTTTCCCTTT，命名为P21；
SEQ ID No.23为TTTCCCTTTTTTCCC，命名为P22；
SEQ ID No.24为TTTCCCTTTTTTTTT，命名为P23；
SEQ ID No.25为TTTTTTCCCCCCCCC，命名为P24；
SEQ ID No.26为TTTTTTCCCCCCTTT，命名为P25；
SEQ ID No.27为TTTTTTCCCTTTCCC，命名为P26；
SEQ ID No.28为TTTTTTCCCTTTTTT，命名为P27；
SEQ ID No.29为TTTTTTTTTCCCCCC，命名为P28；
SEQ ID No.30为TTTTTTTTTCCCTTT，命名为P29；
SEQ ID No.31为TTTTTTTTTTTTCCC，命名为P30；
SEQ ID No.32为TTTTTTTTTTTTTTT，命名为P31。
优选地，所述探针的5’末端标记有荧光基团。
优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为FAM。
第二方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的探针。
优选地，所述试剂盒还包括单层氧化石墨烯纳米片。
第三方面，本发明提供一种鉴定细菌的方法，包括如下步骤：
(1)将第一方面所述的探针与氧化石墨烯溶于磷酸盐缓冲液中进行反应；
(2)将细菌悬浊液加入步骤(1)得到的反应后溶液进行加热孵化，冷却至室温后测试荧光信号；
(3)将步骤(2)得到的荧光信号数据输入电脑软件中进行处理，得到结果。
优选地，步骤(1)所述探针的浓度为400-600nM，例如可以是400nM、450nM、500nM、550nM或600nM。
优选地，步骤(1)所述氧化石墨烯的浓度为80-120μg/mL，例如可以是80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL、95μg/mL、100μg/mL、105μg/mL、110μg/mL、115μg/mL或120μg/mL。
优选地，步骤(1)所述反应的温度为20-35℃，例如可以是20℃、23℃、25℃、27℃、30℃或35℃。
优选地，步骤(1)所述反应的时间为5-15min，例如可以是5min、8min、10min、12min或15min。
优选地，步骤(2)所述加热的温度为30-40℃，例如可以是30℃、33℃、35℃、37℃、39℃或40℃。
优选地，步骤(2)所述细菌浊液的麦氏浊度为3.5-4.5MCF，例如可以是3.5MCF、4MCF或4.5MCF。
优选地，步骤(2)所述加热的时间为20-40min，例如可以是20min、25min、30min、35min或40min。
优选地，步骤(3)所述软件包括模式识别软件，优选为SYSTAT 13.0；
优选地，步骤(3)所述处理的方法为：采用经典线性判别分析(classical lineardiscriminant analysis)进行处理，得到结果。
作为优选技术方案，一种鉴定细菌的方法，具体包括如下步骤：
(1)将第一方面所述的浓度为400-600nM探针与浓度为80-120μg/mL的氧化石墨烯溶于磷酸盐缓冲液中，20-35℃反应5-15min；
(2)将麦氏浊度为3.5-4.5MCF的细菌悬浊液加入步骤(1)得到的反应后溶液进行加热30-40℃孵化20-40min，冷却至室温后测试荧光信号；
(3)将步骤(2)得到的荧光信号数据输入电脑模式识别软件中进行处理，得到结果。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的探针和/或第二方面所述的试剂盒用于鉴定细菌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的特异性探针与单层氧化石墨烯相结合，建立了一套菌种鉴定的方法，所述方法操作简便、快速，对实验人员的专业性要求较低；使用模式识别软件对数据进行处理，大大提高鉴定效率，鉴定准确性达到100％；使用的实验试剂耗材价格便宜，鉴定成本低。
附图说明
图1为本发明的氧化石墨烯淬灭荧光探针折线图；
图2为本发明的荧光探针鉴定九种细菌的荧光柱状图；
图3为本发明的九种细菌分类图；
图4为本发明的九种细菌的分类树。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1试剂盒的组装
将三十二条荧光基团标记的DNA探针与浓度为1mg/mL的单层氧化石墨烯纳米片溶液、磷酸盐缓冲液、TE缓冲溶液和常规试剂组装成试剂盒；
所述DNA探针的序列如下：
SEQ ID No.1为CCCCCCCCCCCCCCC，命名为P0；
SEQ ID No.2为CCCCCCCCCCCCTTT，命名为P1；
SEQ ID No.3为CCCCCCCCCTTTCCC，命名为P2；
SEQ ID No.4为CCCCCCCCCTTTTTT，命名为P3；
SEQ ID No.5为CCCCCCTTTCCCCCC，命名为P4；
SEQ ID No.6为CCCCCCTTTCCCTTT，命名为P5；
SEQ ID No.7为CCCCCCTTTTTTCCC，命名为P6；
SEQ ID No.8为CCCCCCTTTTTTTTT，命名为P7；
SEQ ID No.9为CCCTTTCCCCCCCCC，命名为P8；
SEQ ID No.10为CCCTTTCCCCCCTTT，命名为P9；
SEQ ID No.11为CCCTTTCCCTTTCCC，命名为P10；
SEQ ID No.12为CCCTTTCCCTTTTTT，命名为P11；
SEQ ID No.13为CCCTTTTTTCCCCCC，命名为P12；
SEQ ID No.14为CCCTTTTTTCCCTTT，命名为P13；
SEQ ID No.15为CCCTTTTTTTTTCCC，命名为P14；
SEQ ID No.16为CCCTTTTTTTTTTTT，命名为P15；
SEQ ID No.17为TTTCCCCCCCCCCCC，命名为P16；
SEQ ID No.18为TTTCCCCCCCCCTTT，命名为P17；
SEQ ID No.19为TTTCCCCCCTTTCCC，命名为P18；
SEQ ID No.20为TTTCCCCCCTTTTTT，命名为P19；
SEQ ID No.21为TTTCCCTTTCCCCCC，命名为P20；
SEQ ID No.22为TTTCCCTTTCCCTTT，命名为P21；
SEQ ID No.23为TTTCCCTTTTTTCCC，命名为P22；
SEQ ID No.24为TTTCCCTTTTTTTTT，命名为P23；
SEQ ID No.25为TTTTTTCCCCCCCCC，命名为P24；
SEQ ID No.26为TTTTTTCCCCCCTTT，命名为P25；
SEQ ID No.27为TTTTTTCCCTTTCCC，命名为P26；
SEQ ID No.28为TTTTTTCCCTTTTTT，命名为P27；
SEQ ID No.29为TTTTTTTTTCCCCCC，命名为P28；
SEQ ID No.30为TTTTTTTTTCCCTTT，命名为P29；
SEQ ID No.31为TTTTTTTTTTTTCCC，命名为P30；
SEQ ID No.32为TTTTTTTTTTTTTTT，命名为P31。
实施例2
1、随机从三十二条探针中挑选八条荧光基团标记的DNA探针，荧光基团标记位置在5’末端，序列如下：
所述SEQ ID No.1:FAM-CCCCCCCCCCCCCCC，命名为P0。
所述SEQ ID No.5:FAM-CCCCCCTTTCCCCCC，命名为P4。
所述SEQ ID No.11:FAM-CCCTTTCCCTTTCCC，命名为P10。
所述SEQ ID No.15:FAM-CCCTTTTTTTTTCCC，命名为P14。
所述SEQ ID No.18:FAM-TTTCCCCCCCCCTTT，命名为P17。
所述SEQ ID No.22:FAM-TTTCCCTTTCCCTTT，命名为P21。
所述SEQ ID No.28:FAM-TTTTTTCCCTTTTTT，命名为P27。
所述SEQ ID No.32:FAM-TTTTTTTTTTTTTTT，命名为P31。
2、浓度为1mg/mL的单层氧化石墨烯纳米片水溶液；
3、麦氏浊度为4的九种细菌悬浊液，如下：
1.金黄色葡萄球菌ATCC 25923；2.粪链球菌ATCC 29212；
3.铜绿假单胞菌ATCC 9027；4.鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028；
5.宋内氏志贺氏菌CICC21535；6.阪崎肠杆菌CICC 21544；
7.副溶血弧菌CICC 21617；8.蜡样芽孢杆菌CICC 21261；
9.福氏志贺氏菌CICC 21534；
具体的鉴定步骤如下：
(1)分别将20μL浓度为500nM的八条DNA荧光探针(P0、P4、P10、P14、P17、P21、P27和P31)与20μL不同浓度的氧化石墨烯溶于磷酸盐缓冲溶液中，使得氧化石墨烯的终浓度为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL和25μg/mL，室温反应10min，结果见图1所示；
由图1可知，随着氧化石墨烯浓度的增加，荧光基团标记的八条DNA探针的荧光强度逐渐被淬灭；其中，P0探针最易被淬灭，P31最难被淬灭；此外，当浓度超过10μg/mL时，P0探针的荧光强度变化不大，所以，选择10μg/mL的氧化石墨烯浓度作为后续应用的条件。
(2)根据步骤(1)优化后的最佳氧化石墨烯反应浓度，向含有探针和氧化石墨烯的反应体系中加入20μL麦氏浊度为4.0MCF的细菌悬浊液(空白试验加入等体积的磷酸缓冲溶液)，37℃反应30min；
(3)冷却至室温，对反应液的荧光信号进行测试，结果见图2所示；
(4)将测试的数据采用线性判别分析方法进行处理，得到不同细菌的分类图。
由图2可知，同一条荧光探针检测不同种细菌的荧光强度不同，不同的荧光探针检测同一种细菌的荧光强度也不同。
(5)将八条探针检测细菌的荧光数据输入电脑，采用SYSTAT 13.0软件中的经典线性判别分析(classical linear discriminant analysis)对数据进行处理，直接得到分类图如图3和图4所示；
线性判别分析(LDA)是统计学上一种经典的分析方法，它可以实现数据的分类。LDA的基本思想是投影，将n维数据投影到低维空间，使得投影后组与组之间尽可能分开，即组与组之间有最大的类间距离，而每个组内的个体与个体之间有最小的类内距离；systat13.0软件含有线性判别分析方法，可以直接用于数据分类，它的处理结果就是呈现直观的分类图。
由图3可知，八种荧光探针可以将九种细菌分成九组，正确率为100％。
由图4可知，九个菌株的分类树清晰明确，证明该方法具有优异的区分细菌的能力。
综上所述，本发明巧妙地设计了32条特异性的DNA荧光探针，采用氧化石墨烯纳米片进行荧光淬灭反应，模式识别软件进行数据处理，优化反应条件及步骤，最终建立一套鉴定细菌的完整体系，各步骤条件协同增效，所述方法操作简便快速，提高了鉴定效率和准确性，具有广阔的应用前景和市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市计量测试技术研究院
<120> 一种鉴定细菌的探针及其鉴定方法和应用
<130> 2018年
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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<210> 2
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<211> 15
<212> DNA
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<400> 32
tttttttttt ttttt 15
Claims (1)
1.一种鉴定细菌的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）将核苷酸序列如SEQ ID No.1-32所示的浓度为400-600nM探针与浓度为80-120μg/mL的氧化石墨烯溶于磷酸盐缓冲液中，20-35℃反应5-15min；
（2）将麦氏浊度为3.5-4.5MCF的细菌悬浊液加入步骤（1）得到的反应后溶液进行加热30-40℃孵化20-40min，冷却至室温后测试荧光信号；
（3）将步骤（2）得到的荧光信号数据输入电脑模式识别软件中进行处理，得到结果；
所述细菌包括金黄色葡萄球菌ATCC 25923、粪链球菌ATCC 29212、铜绿假单胞菌ATCC9027、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、宋内氏志贺氏菌CICC21535、阪崎肠杆菌CICC 21544、副溶血弧菌CICC 21617、蜡样芽孢杆菌CICC 21261和福氏志贺氏菌CICC 21534的组合。
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