CN108779084A - 结晶型(2s,4r)-5-(5′-氯-2′-氟-[1,1′-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸和其用途 - Google Patents

Abstract

在一个方面中，本发明涉及具有如下结构的结晶形式：

Description

结晶型(2S,4R)-5-(5′-氯-2′-氟-[1,1′-联苯]-4-基)-2-(乙 氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸和其 用途

相关申请的交叉参考

本申请要求分别在2016年3月8日和2016年6月6日提交的美国临时申请第62/305,393号和第62/346,336号的权益，其全部公开内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及具有脑啡肽酶抑制活性的新颖结晶形式。本发明还涉及包含化合物的医药组合物、制备化合物的方法和使用化合物治疗如高血压、心脏衰竭和肾病的疾病的方法。

背景技术

脑啡肽酶(中性内肽酶，EC 3.4.24.11)(NEP)为在多个器官和组织(包括脑、肾、肺、胃肠道、心脏和外周脉管系统)中发现的内皮膜结合Zn²⁺金属肽酶。NEP使多种内源性肽(如脑啡肽、循环缓激肽、血管紧张素肽和利钠肽)降解并且失活，其中后者具有数种作用，包括例如血管扩张和利钠/利尿以及抑制心脏肥大和心室纤维化。因此，NEP在血压内稳定和心血管健康方面发挥重要作用。

已研究NEP抑制剂(如塞奥芬(thiorphan)、坎沙曲(candoxatril)和坎沙曲拉(candoxatrilat))作为潜在治疗剂。还已知抑制NEP与血管紧张素-I转化酶(ACE)的化合物，并且其包括奥马曲拉(omapatrilat)、杰帕曲拉(gempatrilat)和山帕曲拉(sampatrilat)。称为血管肽酶抑制剂的这一后一种化合物描述于罗布尔(Robl)等人(1999)治疗术专利专家见解(Exp.Opin.Ther.Patents)9(12):1665-1677中。

诸多NEP抑制剂描述于弗罗莱(Fleury)等人的美国专利第9,126,956号中。诸多这些化合物具有一个或多个所要特性。然而，为了有效使用NEP抑制剂化合物作为治疗剂，其宜具有可容易制造并且具有可接受的化学和物理稳定性的固态形式。举例来说，其极宜具有在适当高温下热稳定的物理形式，从而有利于物质的加工和储存；并且极宜具有小晶体尺寸，所述特性增加溶解、生物可用性和吸收，从而允许有利的药物递送特征。结晶固体通常优于非晶形式以提高制品的纯度和稳定性。然而，有机化合物的结晶形式的形成极难预测。尚不存在可靠方法来预测有机化合物的何种形式(如果存在)将结晶。此外，尚不存在方法来预测何种结晶形式(如果存在)具有用作药剂所要的物理特性。因此，需要一种稳定结晶形式，其具有适当高的熔点和小晶体尺寸。

发明内容

本发明提供一种化合物I的新颖结晶形式，已发现其具有脑啡肽酶(NEP)酶抑制活性。因此，这一化合物预期适用作并且宜用作治疗如高血压、肺高血压、心脏衰竭和肾病的病状的治疗剂。化合物I的结构为：

本发明的一个方面涉及(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸的结晶游离酸形式(化合物I')。在一个实施例中，化合物I'为无水的、非吸湿性的或为无水并且非吸湿性的。化合物I'也可称为结晶形式I'。

本发明的另一方面涉及如下医药组合物，其包含一种或多种药学上可接受的载剂和化合物I'。此类组合物可任选地含有其它治疗剂，其包括(但不限于)AT₁受体拮抗剂、血管收缩素转化酶抑制剂、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂、肾素抑制剂、利尿剂或其组合。

本发明的化合物I'具有NEP酶抑制活性，因此预期适用作治疗罹患通过抑制NEP酶或通过提高其肽底物水平治疗的疾病或病症的患者的治疗剂。因此，本发明的一个方面涉及一种治疗通过抑制NEP酶治疗的疾病或病症的患者的方法，其包含向患者给予治疗有效量的化合物I'。本发明的另一方面涉及一种治疗高血压、心脏衰竭或肾病的方法，其包含给予受试者治疗有效量的化合物I'。本发明的另一方面涉及一种抑制受试者的NEP酶的方法，其包含给予受试者NEP酶抑制量的化合物I'。

本发明的另一方面涉及适用于制备化合物I和其结晶形式化合物I'的方法。

本发明的另一方面涉及化合物I和其结晶形式化合物I'的用途，其系用于制备药物，尤其用于制备适用于治疗高血压、心脏衰竭或肾病的药物。本发明的另一方面涉及化合物I或化合物I'用于抑制受试者的NEP酶的用途。本文中公开本发明的其它方面和实施例。

附图说明

本发明的各种方面通过参考附图说明。

图1展示结晶型(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(I')的粉末X射线衍射(PXRD)图案。

图2展示结晶形式(I')的差示扫描热量测定(DSC)热分析图。

图3展示结晶形式(I')的热重测定曲线。

图4展示结晶形式(I')的动态湿气吸附(DMS)等温线。

图5为结晶形式(I')的偏光显微镜(PLM)图像。

图6展示未接受剂量或接受50mg、100mg、200mg、400mg和600mg的单次剂量的健康受试者的平均血浆cGMP经24小时从基线起的变化(nM)。

图7说明cGMP从基线起的n倍变化相对于剂量(mg)的变化趋势以用于单次递增剂量研究中所产生的数据。

图8为化合物I的浓度(ng/mL)相对于时间(hr)的变化趋势以用于单次递增剂量研究中所产生的数据。

图9展示健康受试者中沙库必曲(sacubitril)相对于化合物I的肾消除％。

图10展示未接受剂量或接受10mg、50mg、100mg和200mg的单次剂量的健康成年和老年受试者第14天的平均血浆cGMP经24小时从基线起的变化(nM)。

具体实施方式

在一个方面中，本发明涉及(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(I')。

本发明的化合物I'含有两个手性中心，因此，具有此类结构的化合物可以各种立体异构形式存在。确切地说，碳原子可具有特定(R,R)、(S,S)、(S,R)或(R,S)构型或富含具有此类构型的立体异构形式。所示和命名的化合物I'为(2S,4R)构型。除非另外规定，否则所属领域的技术人员应了解少量其它立体异构体可存在于本发明的组合物中，前提是组合物整体效用不会因此类其它异构体的存在而去除。个别立体异构体可通过所属领域中熟知的大量方法获得，包括使用适合手性固定相或载体的手性色谱；或通过将其化学转化为非对映异构体，通过常规手段(如色谱或再结晶)分离所述非对映异构体，随后再生初始立体异构体来获得。

本发明的化合物I'具有脑啡肽酶(NEP)抑制活性，即所述化合物能够抑制酶催化活性。化合物抑制NEP活性的能力的一个度量为抑制常量(pK_i)pK_i值为解离常量(K_i)以10为底的负对数，其通常以摩尔为单位报告。本发明化合物对NEP的pK_i≥9.0。化合物I'的其它特性和效用可使用所属领域的技术人员熟知的活体外和活体内分析展现，尤其包括美国专利申请公开第9,126,956号中所述的分析。

化合物I'以及其合成中所用的那些化合物还可包括经同位素标记的化合物，即其中一个或多个原子富含原子质量不同于自然界中主要发现的原子质量的原子。可并入本发明中所述的化合物中的同位素的实例例如包括(但不限于)²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³⁵S、³⁶Cl和¹⁸F。尤其关注富含氚或碳-14的化合物I'，其可用于例如组织分布研究；尤其在代谢位点富含氘的化合物I'，例如得到具有较大代谢稳定性的化合物；和富含正电子发射同位素(如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O和¹³N)的化合物I'，其可用于例如正电子发射断层摄影术(PET)研究。

如ChemDraw软件(马萨诸塞州剑桥的珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Inc.,Cambridge,MA))中所实施，本文根据IUPAC公约命名本文化学结构。

定义

当描述本发明的化合物、组合物、方法和工艺时，除非另外指明，否则以下术语具有以下含义。另外，除非使用的情形下另外明确指示，否则如本文所使用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括相应复数形式。术语“包含”、“包括”和“具有”意图为包括性的并且意指可能存在除所列成分外的其它成分。除非另外指明，否则本文所使用的表示成分的量、特性(如分子量、反应条件等)的所有数值都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，本文中所阐述的数值为可取决于本发明设法获得的所需特性而变化的近似值。至少并且不试图将等效物原则的应用限于权利要求书的范围，各数值应至少根据所报告的有效数字并且通过应用一般舍入技术来理解。

当用于化合物I'的热性能的情形下时，术语“约”定义为±1-3℃。当用于尿中所分泌的化合物I'的剂量％的情形下时，术语“约”由通常为标准偏差约两倍或95％置信区间的半宽的误差限界定。本发明其它部分中的术语“约”可用于指示标准偏差或变化量或一组数值的离差。

如本文所用，术语“控制释放”与持续释放和延长释放同义并且关于经长时间段在受试者中递送的药物的量。一般来说，控制释放的片剂和胶囊经约8、12、16和24小时的时间段将活性物质释放至受试者。另一方面，术语“立即释放”是指活性物质在通常少于约30分钟的短时间段内释放于受试者中。术语“延迟释放”是针对片剂和胶囊在设定时间段后释放医药剂量。这些剂型通常包覆肠溶衣以防止在胃中释放但允许在肠道中释放。

如本文所使用，短语“式”或“具有式”或“具有结构”不欲具有限制性并且以与常用术语“包含”相同的方式使用。举例来说，如果描绘一种结构，那么应了解除非另外说明，否则包涵所有立体异构体和互变异构体形式。

一般来说，在描述医药固体时，术语“非溶剂化”意指“无溶剂”。因此，当本发明的结晶形式描述为“非溶剂化”时，其意指结晶粒子基本上仅含有(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸分子；所述形式不含大量的包括晶格的其它溶剂分子，或换句话说，溶剂不会大量地并入晶格中。当水为溶剂时，术语“非溶剂化”与术语“非水合”同义。术语“无水”意指晶体含有可忽略的水乃至无水，尤其结晶水。可忽略量的水意指可测量水的检测极限。举例来说，在本申请中通过卡尔费歇尔法(Karl Fischer)测量水含量(w/w％)可具有0.20w/w％的定量极限(LOQ)。因此，化合物I'中发现的水的量报告为<LOQ或<0.20w/w％。此外，吸湿性物质为容易经由吸收或吸附从其环境吸引水的物质。术语“非吸湿性”用于描述如下晶体，其具有极少的将湿气吸附至其表面或将水吸收至其晶格中的趋势乃至无所述趋势。

如本文所用，术语“熔点”意指通过差示扫描热量测定对于对应于固液变化的热转化观察到最大吸热热流的温度。

术语“药学上可接受”是指当在本发明中使用时，物质不为生物学上不可接受或在其它方面不可接受。举例来说，术语“药学上可接受的载剂”是指可并入组合物中并且向患者给予而不会引起不可接受的生物作用或以不可接受的方式与组合物的其它组分相互作用的材料。此类药学上可接受的材料通常符合毒理学和制造测试的所需标准，并且包括由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug administration)鉴别为适合非活性成分的材料。

术语“药学上可接受的盐”意指由碱或酸制备的给予患者(如哺乳动物)可接受的盐(例如对给定剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。然而，应了解由本发明所涵盖的盐不必需为药学上可接受的盐，如不意图用于向患者给予的中间化合物的盐。药学上可接受的盐可衍生自药学上可接受的无机碱或有机碱和药学上可接受的无机酸或有机酸。另外，当化合物含有碱性部分(如胺、吡啶或咪唑)和酸性部分(如羧酸或四唑)时，可形成两性离子，并且包括在如本文所使用的术语“盐”内。衍生自药学上可接受的无机碱的盐包括铵盐、钙盐、铜盐、正铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、六价锰盐、二价锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等。衍生自药学上可接受的有机碱的盐包括伯、仲和叔胺的盐，包括经取代的胺、环状胺、天然产生的胺等，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N'-二苯甲基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、还原葡糖胺、葡糖胺、组氨酸、海卓胺、异丙胺、赖氨酸、甲基还原葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因(procaine)、嘌呤、可可豆碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、缓血酸胺等。衍生自药学上可接受的无机酸的盐包括以下的盐：硼酸、碳酸、氢卤酸(氢溴酸、盐酸、氢氟酸或氢碘酸)、硝酸、磷酸、氨基磺酸和硫酸。衍生自药学上可接受的有机酸的盐包括以下的盐：脂肪族羟基酸(例如柠檬酸、葡萄糖酸、乙醇酸、乳酸、乳糖酸、苹果酸和酒石酸)、脂肪族单羧酸(例如乙酸、丁酸、甲酸、丙酸和三氟乙酸)、氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、芳香族羧酸(例如苯甲酸、对氯苯甲酸、二苯基乙酸、龙胆酸、马尿酸和三苯基乙酸)、芳香族羟基酸(例如邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-甲酸和3-羟基萘-2-甲酸)、抗坏血酸、二羧酸(例如反丁烯二酸、顺丁烯二酸、草酸和丁二酸)、葡萄糖醛酸、扁桃酸、粘液酸、烟碱酸、乳清酸、双羟萘酸、泛酸、磺酸(例如苯磺酸、樟脑磺酸、乙二磺酸、乙磺酸、羟乙基磺酸、甲磺酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对甲苯磺酸)、辛那酸(xinafoic acid)等。

术语“治疗有效量”意指在向有需要的患者给予时足以实现治疗的量，即为获得所需治疗效果所需要的药物量。举例来说，用于治疗高血压的治疗有效量为例如减轻、抑制、消除或预防高血压的症状或治疗高血压的潜在原因所需要的化合物量。在一个实施例中，治疗有效量为降低血压所需的药物量或维持正常血压所需的药物量。另一方面，术语“有效量”意指足以获得所需结果(可不必为治疗结果)的量。举例来说，当研究包含NEP酶的系统时，“有效量”可为抑制所述酶所需的量。

如本文中用，术语“治疗(treating/treatment)”意指治疗患者(如哺乳动物，尤其人类)的疾病或医学病状(如高血压)，其包括以下中的一或多者：(a)预防疾病或医学病状出现，即预防疾病或医学病状复发或预防性处理易患所述疾病或医学病状的患者；(b)改善疾病或医学病状，即消除患者的疾病或医学病状或使所述疾病或医学病状消退；(c)抑制疾病或医学病状，即减缓或阻止患者的疾病或医学病状的发展；或(d)减轻患者的疾病或医学病状的症状。举例来说，术语“治疗高血压”包括预防高血压出现、改善高血压、抑制高血压和减轻高血压的症状(例如降低血压)。术语“受试者”或“患者”意图包括需要治疗或疾病预防，或目前正针对疾病预防进行治疗或治疗特定疾病或医学病状的那些哺乳动物(如人类)，以及其中对结晶化合物进行评估或用于分析的测试受试者(例如动物模型)。

本文中所使用的所有其它术语均意图具有一般熟习其相关技术者所理解的其普通含义。

通用合成程序

本发明的化合物I的结晶形式可从下文和实例中所述的容易获得的起始物质合成。应了解，在提供典型或优选方法条件(即反应温度、结晶温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)时，除非另外说明，否则其它方法条件也可使用。在一些情况下，在室温下进行反应或结晶，并且不进行实际温度测量。应了解，室温意指在通常与实验室环境中的环境温度相关的范围内的温度，并且通常在约15℃至约30℃(如约20℃至约25℃)范围内。在其它情况下，在室温下进行反应或结晶，并且实际上测量并且记录温度。

本发明方法中所述的任何摩尔比可通过可供所属领域的技术人员使用的各种方法容易地确定。举例来说，此类摩尔比可通过¹H NMR容易地确定。或者，可使用元素分析和HPLC方法测定摩尔比。

在一个实施例中，化合物I可通过如下方法制备：(a)在溶剂中使(2S,4R)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸苯甲酯盐酸盐与3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异恶唑-5-甲酸以约1:1摩尔比偶合，得到(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸苯甲酯；和(b)去除(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸苯甲酯的保护基，形成(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(I)。

在一个实施例中，步骤(a)进一步包括添加肽偶合剂和碱，其中偶合剂比碱比(2S,4R)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸苯甲酯盐酸盐比3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异恶唑-5-甲酸的摩尔比为约1:3:1:1。肽偶合剂的代表性实例包括(但不限于)O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TATU)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HCTU)和O-[(乙氧基羰基)氰基亚甲基氨基]-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TOTU)。在一优选实施例中，肽偶合剂为HATU、HBTU和HCTU，其中HCTU为最优选的。可用于反应中的碱的一实例为DIPEA。

在另一实施例中，去除保护基的步骤(b)用钯催化剂(例如钯/碳(5％或10％w/w))和氢气执行。在其它实施例中，可在步骤(b)后执行以下步骤。除去钯催化剂，继而添加氧化剂，如过氧化氢。可随后在约20℃至30℃的温度下搅拌反应物至少1小时或优选2小时。这一步骤后可蒸馏并且洗涤一或多次，并且任选地冷却并且老化，随后分离化合物I。

在一个实施例中，本发明涉及(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸的结晶形式(I')。在另一实施例中，结晶形式为无水的、非吸湿性的或为无水并且非吸湿性的。

结晶形式I'的制备一般在如下适合惰性稀释剂中进行，其实例包括(但不限于)丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、己烷等，和其混合物，其任选地含有水。惰性稀释剂的混合物(也称为溶剂系统)包括丙酮与水、乙腈与水、乙醇与乙酸乙酯、乙酸乙酯与己烷和低级醇(C_1-6烷基-OH)与水，例如甲醇与水和异丙醇与水。尤其适合的溶剂系统包括乙酸乙酯和水。完成结晶后，可通过任何常规方法使结晶化合物与反应混合物分离，如沉淀、过滤、浓缩、离心、在真空中干燥等。

在一个实施例中，结晶形式I'可通过如下方法制备：(a)在高温下形成包含(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(化合物I)以及溶剂并且任选地含有金属清除剂的溶液；(b)将溶液冷却至约-20℃至5℃的温度；和(c)分离所得固体，得到结晶形式I'。在另一实施例中，方法进一步包括在约-20℃至5℃的温度下搅拌或搅动溶液。

步骤(a)步骤(a)一般在室温下在极性溶剂中进行。极性溶剂可为质子性或非质子性的并且包括例如乙酸乙酯与水的混合物、乙酸乙酯或乙醇。步骤(a)中的高温通常为约60℃至95℃，并且优选为70℃至85℃、70℃至80℃或75℃至85℃。分离步骤(c)包括过滤，用一种或多种溶剂洗涤，在空气中或在真空下干燥，或这些步骤的组合。如果在真空下干燥化合物I'或结晶形式I'，那么这可在25℃至70℃、优选30℃至60℃、30℃至50℃、40℃至60℃或40℃至50℃的温度下进行。

在另一实施例中，在将温度升高至约60℃至95℃前，方法进一步包括在0℃至30℃的温度下搅拌混合物至少5分钟的步骤。或者，可在25℃至35℃的温度下执行搅拌至少1小时。

在另一实施例中，在升高温度前，使混合物进一步沉降并且分离上部非水相。或者，在升高温度前过滤混合物，冲洗并且减少体积。

在另一实施例中，以上方法的步骤(b)中的温度独立地为-15℃至-5℃，或者独立地为-5℃至5℃。

结晶特性

如粉末x射线衍射(PXRD)分析领域所熟知，PXRD图案的相对峰高取决于与样品制备和仪器几何模式有关的多个因素，而峰位置对实验细节相对不灵敏。如本文所述进行PXRD、差示扫描热量测定(DSC)、热重分析(TGA)和动态湿气吸附(DMS)评定(也称为湿气吸附-解吸附分析)。

在一个方面中，本发明涉及(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸的结晶形式(I')，所述结晶形式通过PXRD图案表征，其中峰位置大体上符合图1中所示。

将相对强度大于1面积％的峰列于下表中。这一图案展示2θ在5-35°范围内的尖锐衍射峰。衍射图案中的这些和其它峰可用于鉴别这一形式。

*2θ值以值±0.20形式报告。

因此，在一个实施例中，结晶形式I'通过6.51±0.20、11.62±0.20、13.05±0.20、15.07±0.20和23.28±0.20的2θ值处包含衍射峰的PXRD图案表征。

在另一实施例中，结晶形式I'通过6.51±0.20、11.62±0.20、13.05±0.20、15.07±0.20、17.12±0.20、23.28±0.20和26.19±0.20的2θ值处包含衍射峰的PXRD图案表征。

在另一实施例中，结晶形式I'进一步通过选自6.51±0.20、11.62±0.20、13.05±0.20、15.07±0.20、15.72±0.20、17.12±0.20、20.79±0.20、21.10±0.20、23.28±0.20、24.48±0.20、25.81±0.20和26.19±0.20的2θ值处具有一个或多个其它衍射峰表征；并且在另一实施例中，结晶化合物进一步通过具有三个或更多个此类其它衍射峰表征。

在一个实施例中，结晶形式I'通过大体上符合图2中所示的DSC热分析图或差示扫描热量测定迹线表征。结晶形式I'通过以每分钟10℃的加热速率记录的差示扫描热量测定迹线表征，所述差示扫描热量测定迹线展示在约214℃至约218℃的温度下具有吸热热流的最大值。DSC热分析图或差示扫描热量测定迹线说明熔融吸热线，其中峰在约216.1℃处，在214.2℃下开始，并且吸热线下面积对应于107.2J/g。化合物在熔融同时分解，并且107.2J/g对熔融焓的贡献未确立。

在一个实施例中，结晶形式I'通过图3中的TGA曲线表征。这一曲线展示直到约240℃为止才发生质量损失；结晶化合物在熔融后分解，如在约242℃下开始发生的显著重量损失所见。直到分解温度，未发生额外质量损失，指示无吸附分子(如水)。

在一个实施例中，结晶形式I'通过图4中的DMS等温线表征。这一形式为非吸湿性固体。在暴露于5％-90％相对湿度时观察到的总湿气增加低于0.02重量％。两次连续吸附-解吸附循环之间未发现显著滞后。吸附-解吸附循环后获得的固体展示与起始物质相同的PXRD图案，指示此实验后无形式变化。这些数据指示结晶形式I'在水存在下未转化为水合形式。结晶形式I'保持非吸湿性，因此可表征为无水的、非吸湿性的或为无水并且非吸湿性的。

结晶形式I'可通过图5中的PLM图像表征，其展示这一形式为结晶双折射盘状粒子。

效用

持续进行受试者中药物性能的活体外至活体内外推以进行改进(参见例如千叶(Chiba)等人,AAPS期刊(AAPS J.),2009年6月；11(2):262-276)。在本发明中，评定活体外人类脑啡肽酶抑制剂活性以测定化合物I和结晶形式I'的脑啡肽酶抑制活性。符合阈值pK_i≥9.0。然而，进一步进行其它活体内实验以更精确地预测化合物I和结晶形式I'在受试者中的性能。

关于活体内性能，有数种特性适用于评估是否递送足量的药物至血浆以实现必要治疗益处，例如在所有测试物种中的低血浆清除率、高口服生物可用性、环单磷酸鸟苷(cGMP)反应的有利增效作用和对于具有受损的肾功能的受试者的低肾清除率。

对于本发明，在大鼠、狗和猴物种中进行口服和静脉内药物动力学研究以测定化合物I(即化合物I'的可溶形式)的口服生物可用性(分析1)。这一分析还用于测定这些化合物的血浆清除率；认为低清除率无需鉴别所涉及的个别消除过程即可预测化合物预期在循环中保持的时间，即其活体内稳定性和持久性。

在人类中进行药物动力学/药效动力学研究以测定用化合物I获得的脑啡肽酶抑制水平(分析3)。在这一分析中，测量环单磷酸鸟苷(cGMP)的含量。cGMP为利钠肽受体结合的下游效应分子，因此充当利钠肽活性的有效活体内生物标记物。当给予动物脑啡肽酶抑制剂时，cGMP的含量相较于安慰剂增加。本发明的一个实施例涉及一种增加患有高血压、心脏衰竭或肾病的受试者的心房利钠肽(ANP)或cGMP基本含量的方法，其包含给予受试者治疗有效量的化合物I或结晶形式I'。在受试者的尿或血浆或两者中测量ANP和cGMP的含量。在另一实施例中，当给予治疗有效量的化合物1或结晶形式I'时，经24小时的时间段，受试者的ANP或cGMP含量提高至少≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍或≥5倍。在另一方面中，本发明涉及一种增加人类血浆中环单磷酸鸟苷的量的方法，所述方法包含给予人类结晶游离酸形式。在一个方面中，本发明涉及降低人类的血压，所述方法包含给予人类降血压量的(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸的结晶游离酸形式。

结晶形式I'(其在受试者体内溶解得到其可溶形式化合物I)抑制NEP酶，因此预期适用于治疗和/或预防对NEP抑制起反应的医学病状。因此预期罹患通过抑制NEP酶或通过增加其肽底物的含量治疗的疾病或病症的患者可通过给予治疗有效量的化合物I或结晶形式I'治疗。举例来说，预期化合物I或结晶形式I'通过抑制NEP来增强由NEP代谢的内源性肽的生物学作用，所述内源性肽如利钠肽、铃蟾素、舒缓素、降钙素、内皮素(endothelin)、脑啡肽、神经调压素、P物质和血管活性肠肽。因此，预期这一化合物例如对肾系统、中枢神经系统、生殖系统和胃肠系统具有其它生理作用。

通过通常分类为分泌和生物转化的各种消除方法从受试者体内除去药物。分泌涉及主要通过肾(肾脏)至膀胱至尿除去完整非挥发性药物，而其它分泌路径包括胆汁(肝脏)、汗液、唾液、乳汁(经由泌乳)或其它体液。挥发性药物(如醇和气体麻醉剂)经由肺分泌至呼出的气体中。另一方面，生物转化或药物代谢涉及药物在体内化学转化为代谢物并且通常为酶促过程。除此以外，药物以非酶促方式发生化学变化，例如酯水解。参与药物的生物转化的酶主要位于肝脏中。其它组织(如肾脏、肺、小肠和皮肤)还含有代谢酶。

药物动力学研究还可用于研究受试者的消除路径，例如经由随时间在尿中分泌所给予的药物获得的肾清除率。进行化合物I在大鼠、犬和猴物种以及人类中的肾分泌以评定作为消除路径的肾脏分泌(分析2和4)。这一消除路径对于具有受损的肾功能并且需要最低限度地通过肾脏分泌清除的疗法的受试者很重要。在一个实施例中，受试者中化合物I或结晶形式I'经24小时的肾分泌为所给予剂量的约≤15％、≤10％、≤5％、≤3％、≤2％、≤1％或≤0.5％。

如以下分析部分中所述，在多种动物种属中进行血浆清除率、口服生物可用性和肾分泌的活体内测定。化合物I或结晶形式I'展现高的人类脑啡肽酶抑制活性、高口服生物可用性、低血浆清除率、增加的cGMP增效作用和低肾分泌，其预期会在治疗疾病时产生特定效用。

心血管疾病

预期化合物I和结晶形式I'通过增强血管活性肽(如利钠肽和缓激肽)的作用而适用于治疗和/或预防医学病状(如心血管疾病)。参见例如罗克斯(Roques)等人,(1993)药理学评论(Pharmacol.Rev.)45:87-146和邓普斯(Dempsey)等人,(2009)美国病理学杂志(Amer.J.of Pathology)174(3):782-796。备受关注的心血管疾病包括高血压和心脏衰竭。高血压包括(以说明而非限制的方式)：原发性高血压，也称为原发性高血压或特发性高血压；继发性高血压；伴随有肾病的高血压；伴随有或不伴随有肾病的重度高血压；肺高血压，包括肺动脉高血压；和顽固性高血压。心脏衰竭包括(以说明而非限制的方式))：充血性心脏衰竭；急性心脏衰竭；慢性心脏衰竭，例如伴随有左心室射血分数降低的心脏衰竭(也称为收缩性心脏衰竭)或伴随有左心室射血分数保持的心脏衰竭(也称为舒张性心脏衰竭)；和急性和慢性代偿失调性心脏衰竭。因此，本发明的一个实施例涉及一种治疗高血压、尤其原发性高血压、肺动脉高血压、慢性血栓栓塞性肺高血压(CTEPH)或具有肾动脉狭窄的高血压的方法，其包含给予患者治疗有效量的化合物I或结晶形式I'。

为治疗原发性高血压，治疗有效量通常为足以降低患者血压的量。在一个方面中，本发明涉及降低人类的血压，所述方法包含给予人类降血压量的(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸的结晶游离酸形式。其包括治疗轻度至中度高血压与重度高血压。当用于治疗高血压时，化合物I或结晶形式I'可与其它治疗剂组合给予，所述其它治疗剂如醛固酮拮抗剂、醛固酮合成酶抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂和双重作用血管紧张素转化酶/脑啡肽酶抑制剂、血管紧张素转化酶2(ACE2)活化剂和刺激剂、血管紧张素-II疫苗、抗糖尿病剂、抗脂质剂、抗血栓形成剂、AT₁受体拮抗剂和双重作用AT₁受体拮抗剂/脑啡肽酶抑制剂、β₁-肾上腺素激导性受体拮抗剂、双重作用β-肾上腺素激导性受体拮抗剂/α₁-受体拮抗剂、钙通道阻断剂、利尿剂、内皮素受体拮抗剂、内皮素转化酶抑制剂、脑啡肽酶抑制剂、利钠肽等、利钠肽清除受体拮抗剂、氧化氮供体、非甾族消炎剂、磷酸二酯酶抑制剂(尤其PDE-V抑制剂)、前列腺素受体促效剂、肾素抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂和活化剂和其组合。在本发明的一个特定实施例中，本发明化合物与AT₁受体拮抗剂、钙通道阻断剂、利尿剂或其组合组合，并且用于治疗原发性高血压。在本发明的另一特定实施例中，本发明化合物与AT₁受体拮抗剂组合，并且用于治疗伴随有肾病的高血压。当用于治疗顽固性高血压时，所述化合物可以与如醛固酮合成酶抑制剂的其它治疗剂组合给予。

为治疗肺动脉高血压，治疗有效量通常为足以降低肺血管阻力的量。疗法的其它目标为改进患者的运动能力。举例来说，在临床环境中，治疗有效量可为改进患者舒适步行6分钟的时间段(涵盖约20-40米的距离)的能力的量。当用于治疗肺动脉高血压时，化合物I或结晶形式I'可与其它治疗剂组合给予，所述其它治疗剂如α-肾上腺素激导性受体拮抗剂、β₁-肾上腺素激导性受体拮抗剂、β₂-肾上腺素激导性受体促效剂、血管紧张素转化酶抑制剂、抗凝剂、钙通道阻断剂、利尿剂、内皮素受体拮抗剂、PDE-V抑制剂、前列腺素类似物、选择性血清素再吸收抑制剂和其组合。在本发明的一个特定实施例中，化合物I或结晶形式I'与PDE-V抑制剂或选择性血清素再吸收抑制剂组合，并且用于治疗肺动脉高血压。

为治疗慢性血栓栓塞性肺高血压，治疗有效量通常为无论受试者中是否形成肺栓塞，足以降低肺动脉血压的量。

另外，为治疗具有肾动脉狭窄的高血压，治疗有效量通常为足以降低血压的量。对于患有肾动脉狭窄的受试者，动脉因为动脉粥样硬化而变窄。这又使身体指示较少血液到达肾而认为其为低血压，从而又发出释放激素的信号以提高血压。这随时间可引起肾衰竭。

本发明的另一实施例涉及一种用于治疗心脏衰竭、尤其充血性心脏衰竭(包括收缩性和舒张性充血性心脏衰竭)的方法，其包含向患者给予治疗有效量的化合物I或结晶形式I'。通常，治疗有效量为足以降低血压和/或改进肾功能的量。在临床环境中，治疗有效量可为足以改进心脏血流动力学，例如降低楔压、右心房压、填充压和血管阻力的量。在一个实施例中，化合物以静脉内剂型给予。当用于治疗心脏衰竭时，化合物I或结晶形式I'可与其它治疗剂组合给予，所述其它治疗剂如腺苷受体拮抗剂、晚期糖基化终点产物裂解剂、醛固酮拮抗剂、AT₁受体拮抗剂、β₁-肾上腺素激导性受体拮抗剂、双重作用β-肾上腺素激导性受体拮抗剂/α₁-受体拮抗剂、凝乳酶抑制剂、地高辛(digoxin)、利尿剂、内皮素转化酶(ECE)抑制剂、内皮素受体拮抗剂、利钠肽等、利钠肽清除受体拮抗剂、氧化氮供体、前列腺素类似物、PDE-V抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶活化剂和刺激剂和血管加压素受体拮抗剂。在本发明的一个特定实施例中，化合物I或结晶形式I'与醛固酮拮抗剂、β₁-肾上腺素激导性受体拮抗剂、AT₁受体拮抗剂或利尿剂组合，并且用于治疗充血性心脏衰竭。

腹泻

预期化合物I或结晶形式I'作为NEP抑制剂抑制内源性脑啡肽的降解，并且因此，此类化合物还可适用于治疗腹泻，包括传染性和分泌性/水性腹泻。参见例如鲍默(Baumer)等人,(1992)肠(Gut)33:753-758；法辛(Farthing)(2006)消化性疾病(DigestiveDiseases)24:47-58；和马尔赛-科利亚多(-Collado)(1987)欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol.)144(2):125-132。当用于治疗腹泻时，化合物I或结晶形式I'可与一种或多种其它止泻剂组合。

肾病

预期化合物I或结晶形式I'通过增强血管活性肽(如利尿钠肽和缓激肽)的作用来增强肾功能(参见陈(Chen)等人,(1999)循环(Circulation)100:2443-2448；利普金(Lipkin)等人,(1997)国际肾脏杂志(Kidney Int.)52:792-801；和迪索勒(Dussaule)等人,(1993)临床科学(Clin.Sci.)84:31-39)，并且适用于治疗和/或预防肾受损受试者的肾病。备受关注的肾病包括糖尿病性肾病、慢性肾病、蛋白尿，并且尤其包括急性肾脏损伤(例如由心血管手术、化学疗法或在医学成像中使用造影染料引起)或急性肾衰竭(参见沙尔科夫斯基(Sharkovska)等人,(2011)临床实验室(Clin.Lab.)57:507-515和内瓦兹(Newaz)等人,(2010)肾衰竭(Renal Failure)32:384-390)。其它备受关注的肾病包括肾病综合征、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)和多囊性肾病(PKD)。

患有慢性肾病(CKD)的肾受损受试者可根据国立肾脏基金会肾病预后质量倡议(National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative，NKFKDOQI)准则分级。确定慢性肾病后，即肾脏破坏或肾小球滤过率(GFR)<60mL/min/1.73m²≥3个月，疾病的阶段可根据KDOQI CKD分类指定。其包括第1阶段(GFR正常或增加的肾脏破坏)：GFR≥90；第2阶段(GFR轻度降低的肾脏破坏)：GFR 60-89；第3阶段(GFR中等降低)：GFR30-59；第4阶段(GFR严重降低)：GFR 15-29；和第5阶段(肾衰竭)：GFR<15(或透析)。GFR以单位mL/min/1.73m²定义。

一个实施例包括一种治疗肾受损受试者的方法，其包含给予治疗有效量的化合物I或结晶形式I'。这一方法进一步包括治疗患有高血压或心脏衰竭的肾受损受试者。在用于治疗肾病时，化合物I或结晶形式I'可与其它治疗剂(如血管收缩素转化酶抑制剂、AT₁受体拮抗剂和利尿剂)组合给予。

另一实施例包括一种治疗患有肾小球滤过率估算值(eGFR)在60mL/min/1.73m²至15mL/min/1.73m²之间的慢性肾病的肾受损受试者的方法，其包含给予患者治疗有效量的化合物I或结晶形式I'。另一实施例包括一种治疗患有肾小球滤过率估算值(eGFR)≥90mL/min/1.73m²(第1阶段)或eGFR<15mL/min/1.73m²(第5阶段)的慢性肾病的肾受损受试者的方法，其包含给予患者治疗有效量的化合物I或结晶形式I'。出于本发明的目的，严重肾病可归类为eGFR<30mL/min/1.73m²。在另一实施例中，包括一种用化合物I或结晶形式I'治疗患有归类为第1阶段、第2阶段、第3阶段、第4阶段、第5阶段或覆盖这些阶段中的一或多者的eGFR范围的慢性肾病的肾受损受试者的方法。

预防性疗法

还预期化合物1通过增强利钠肽的作用而适用于预防性疗法，由于所述利钠肽的抗肥厚性和抗纤维化性作用(参见波特(Potter)等人,(2009)实验药理学手册(Handbookof Experimental Pharmacology)191:341-366)，所述预防性疗法例如在心肌梗塞之后预防心机能不全的进展、在血管成形术之后预防动脉再狭窄、在血管手术之后预防血管壁变厚、预防动脉粥样硬化并且预防糖尿病性血管病。

青光眼

预期化合物I或结晶形式I'通过增强利钠肽的作用而适用于治疗青光眼。参见例如戴斯特霍斯特(Diestelhorst)等人,(1989)国际眼科学(InternationalOphthalmology)12:99-101。在用于治疗青光眼时，化合物1可与一种或多种其它抗青光眼剂组合。

疼痛缓解

预期化合物I或结晶形式I'作为NEP抑制剂抑制内源性脑啡肽的降解，并且因此，此类化合物还可适用作镇痛剂。参见例如罗克斯等人,(1980)自然(Nature)288:286-288和谭纳瓦拉(Thanawala)等人,(2008)当今药靶(Current Drug Targets)9:887-894。当用于治疗疼痛时，化合物I或结晶形式I'可与一种或多种其它止痛药物组合，所述止痛药物如氨基肽酶N或二肽基肽酶III抑制剂、非甾族消炎剂、单胺再吸收抑制剂、肌肉松弛剂、NMDA受体拮抗剂、类鸦片受体促效剂、5-HT_1D血清素受体促效剂和三环抗抑郁剂。

其它效用

还预期化合物I或结晶形式I'由于其NEP抑制特性而适用作止咳剂，以及适用于治疗伴随有肝硬化的门静脉血压过高(参见桑索(Sansoe)等人,(2005)肝病学杂志(J.Hepatol.)43:791-798)、癌症(参见维斯利(Vesely)(2005)研究医学杂志(J.Investigative Med.)53:360-365)、抑郁症(参见诺布尔(Noble)等人,(2007)关于治疗靶的专家意见(Exp.Opin.Ther.Targets)11:145-159)、月经异常、早产、子痫前症、子宫内膜异位症、生殖障碍(例如男性和女性不孕症、多囊性卵巢综合征、着床失败)和男性和女性性功能障碍，包括男性勃起功能障碍和女性性兴奋障碍。更确切地说，预期化合物I或结晶形式I'适用于治疗女性性功能障碍(参见普莱德(Pryde)等人,(2006)医药化学杂志(J.Med.Chem.)49:4409-4424)，其常被定义为女性患者对性表达很难或者不能满意。这涵盖各种不同女性性功能障碍，包括(以说明而非限制的方式)过低性欲障碍、性兴奋障碍、性高潮障碍和性疼痛障碍。当用于治疗此类病症、尤其女性性功能障碍时，本发明化合物可与一种或多种以下第二药剂组合：PDE-V抑制剂、多巴胺促效剂、雌激素受体促效剂和/或拮抗剂、雄激素和雌激素。还预期化合物I或结晶形式I'由于其NEP抑制特性而具有消炎特性，并且预期其具有如此效用，尤其在与他汀(statin)组合使用时。

近期研究表明，NEP在胰岛素缺乏性糖尿病和膳食诱导的肥胖中起调控神经功能的作用。科彼(Coppey)等人,(2011)神经药理学(Neuropharmacology)60:259-266。因此，还预期化合物I或结晶形式I'由于其NEP抑制特性而适用于防护由糖尿病或膳食诱导的肥胖造成的神经损伤。

化合物I或结晶形式I'每剂给予量或每天给予总量可预先确定，或其可以基于个别患者，通过考虑诸多因素而确定，所述因素包括患者病状的性质和严重程度；所治疗病状；患者的年龄、重量和一般健康状况；患者对活性剂的耐受性；给予途径；药理学考虑因素，如所给予的化合物和任何第二药剂的活性、功效、药代动力学和毒理学概况等。治疗患有疾病或医学病状(如高血压)的患者可以预先确定的剂量或由治疗医师确定的剂量开始，并且持续预防、改善、抑制或缓解疾病或医学病状的症状所必需的时间段。经历此类治疗的患者通常进行常规监测以确定疗法的有效性。举例来说，在治疗高血压中，血压测量值可以用于确定治疗的有效性。本文述的其它疾病和病状的类似指征为大家所熟知，并且容易由治疗医师获得。由医师连续监测保证在任何给定时间给予最适量的化合物I或结晶形式I'，以及促进确定治疗的持续时间。当也给予第二药剂时，这一监测尤其有价值，因为第二药剂的选择、剂量和疗法持续时间也可能需要调节。以这一方式，可在治疗过程中调节治疗方案和给药时程，以给予展现所需有效性的最低量的活性剂，并且此外，给予仅持续到成功治疗疾病或医学病状即可。

化合物I还适用作用于制备化合物I的结晶形式(包括例如结晶形式I')的中间物。

研究工具

因为化合物I或结晶形式I'具有NEP酶抑制活性，故其也适用作用于调查或研究具有NEP酶的生物系统或样品的研究工具，例如以研究NEP酶或其肽底物在其中发挥作用的疾病。具有NEP酶的任何适合生物系统或样品均可以用于此类研究中，此类研究可在活体外或活体内进行。适用于此类研究的代表性生物系统或样品包括(但不限于)细胞、细胞提取物、质膜、组织样品、分离器官、哺乳动物(如小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、犬、猪、人类等)等，其中哺乳动物备受关注。在本发明的一个特定实施例中，哺乳动物中的NEP酶活性通过给予NEP抑制量的化合物I或结晶形式I'而受抑制。

当用作研究工具时，通常使包含NEP酶的生物系统或样品与NEP酶抑制量的化合物I或结晶形式I'接触。在将生物系统或样品暴露于化合物之后，使用常规程序和设备(如通过在结合分析中测量受体结合或在功能性分析中测量配体介导的变化)来测定抑制NEP酶的作用。暴露包涵使细胞或组织与化合物接触，例如通过腹膜内、口服、静脉内、皮下或吸入给予等向哺乳动物给予化合物。这一测定步骤可涉及测量响应(定量分析)或可涉及进行观察(定性分析)。测量响应涉及例如使用常规程序和设备(如酶活性分析)和在功能性分析中测量酶底物或产物介导的变化来测定化合物对生物系统或样品的作用。分析结果可用于确定得到所需结果所必要的化合物的活性程度以及量，即NEP酶抑制量。所述确定步骤通常涉及测定抑制NEP酶的作用。

另外，化合物I或结晶形式I'可用作用于评估其它化合物的研究工具，并且因此还适用于筛选分析以发现例如具有NEP抑制活性的新颖化合物。以这一方式，化合物I或结晶形式I'在分析中用作标准样品，以比较用测试化合物和化合物I或结晶形式I'所获得的结果以鉴别具有大致相等或优越活性的测试化合物(如果存在)。举例来说，将一种测试化合物或一组测试化合物的pK_i数据与化合物I或结晶形式I'的pK_i数据进行比较，以鉴别具有所需特性的测试化合物，例如pK_i值约等于或优于本发明化合物的测试化合物。本发明的此方面包括产生比较数据(使用适当分析)与分析测试数据作为独立实施例以鉴别所关注的测试化合物。因此，可在生物分析中通过包含以下步骤的方法评估测试化合物：(a)用测试化合物进行生物分析，得到第一分析值；(b)用化合物I或结晶形式I'进行生物分析，得到第二分析值；其中步骤(a)在步骤(b)之前、之后或与步骤(b)同时进行；和(c)比较来自步骤(a)的第一分析值与来自步骤(b)的第二分析值。示范性生物分析包括NEP酶抑制分析。

本发明的再另一方面涉及一种研究包含NEP酶的生物系统或样品的方法，所述方法包含(a)使生物系统或样品与化合物I或结晶形式I'接触；和(b)测定由所述化合物对所述生物系统或样品所引起的作用。

医药组合物和调配物

化合物I或结晶形式I'通常以医药组合物或调配物形式向患者给予。此类医药组合物可通过任何可接受给予途径向患者给予，包括(但不限于)口服、经直肠、经阴道、经鼻、吸入、表面(包括经皮)、经眼和非经肠给予模式。此外，化合物I或结晶形式I'可以每天多次剂量(例如每天两次、三次或四次)，以单次日剂量或以单次周剂量(例如口服)给予。应了解，适用于特定给予模式的化合物I或结晶形式I'的任何形式(即，游离碱、游离酸、药学上可接受的盐、溶剂合物等)均可用于本文所述的医药组合物中。

因此，在一个实施例中，本发明涉及一种包含药学上可接受的载剂和化合物1的医药组合物。必要时，组合物可含有其它治疗剂和/或调配剂。当论述组合物时，“化合物I或结晶形式I'”在本文中也可称为“活性剂”，以将其与调配物的其它组分(如载剂)进行区分。因此，应了解术语“活性剂”包括化合物I或结晶形式I'以及其药学上可接受的盐。

本发明的医药组合物通常含有治疗有效量的化合物I或结晶形式I'。然而，所属领域的技术人员应认识到，医药组合物可含有大于治疗有效量(如呈大剂量组合物形式)或小于治疗有效量(即，经设计用于多次给予以实现治疗有效量的个别单位剂量)。通常，组合物含有约0.01wt％-99wt％活性剂，其中实际量取决于调配物本身、给予途径、给药频率等。在一个实施例中，适用于口服剂型的组合物例如可含有约10wt％-99wt％或约50wt％-99wt％活性剂。

任何常规载剂或赋形剂可用于本发明的医药组合物中。特定载剂或赋形剂或载剂或赋形剂的组合的选择取决于用于治疗特定患者的给药模式，或医学病状或疾病病况的类型。就此来说，针对特定给药模式制备适合组合物完全处于医药领域的技术人员的范围内。另外，此类组合物中所用的载剂或赋形剂可购得。以进一步说明的方式，常规调配技术描述于雷明顿：药学科学和实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy),第20版,马里兰巴尔的摩的利平科特威廉姆斯和怀特公司(Lippincott Williams&White,Baltimore,Maryland)(2000)；和H.C.安塞尔(H.C.Ansel)等人,医药剂型与药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems),第7版,马里兰巴尔的摩的利平科特威廉姆斯和怀特公司(1999)中。

可用作药学上可接受的载剂的材料的代表性实例包括(但不限于)以下：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，如微晶纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；脂肪酸盐，如硬脂酸镁；粉末状黄芪；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原质水；等张生理食盐水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；压缩推进剂气体，如氯氟碳化物和氢氟碳化物；和医药组合物中所采用的其它无毒相容物质。

在本发明的一个实施例中，药学上可接受的载剂为硬脂酸镁。举例来说，医药组合物可包含化合物I或结晶形式I'和硬脂酸镁，化合物I或结晶形式I'与硬脂酸镁的比率为约3:1至约10:1。化合物I或结晶形式I'与硬脂酸镁的其它比率包括(但不限于)1:1、5:1、15:1、20:1、25:1、30:1和50:1。在另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与硬脂酸镁的量可表示为重量％。举例来说，医药组合物可包含99wt％化合物I或结晶形式I'和1wt％硬脂酸镁。在另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与硬脂酸镁的重量比分别为85:15至99:1。在一优选实施例中，化合物I或结晶形式I'与硬脂酸镁的重量比为95:5至99:1，优选99:1。

通常通过将活性剂与药学上可接受的载剂和一种或多种任选的成分充分并且紧密地混合或掺合来制备医药组合物。所得均匀掺合混合物可接着使用常规程序和设备来成形或装入片剂、胶囊、丸剂、罐、筒、分配器等中。

在一个实施例中，医药组合物适用于口服给予。适合用于口服给予的组合物可呈以下形式：胶囊、片剂、丸剂、锭剂、扁囊剂、糖衣药丸、粉末、颗粒；在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；水包油或油包水液体乳剂；酏剂或糖浆；等；各含有预定量的活性剂。

当意图以固体剂型(胶囊、片剂、丸剂等)用于口服给予时，组合物将通常包含活性剂和一种或多种药学上可接受的载剂，如柠檬酸钠或磷酸二钙或硬脂酸镁。固体剂型也可包含：填充剂或增量剂，如淀粉、微晶纤维素、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；粘合剂，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；保湿剂，如甘油；崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和/或碳酸钠；溶解延迟剂，如石蜡；吸收促进剂，如季铵化合物；湿润剂，如鲸蜡醇和/或单硬脂酸甘油酯；吸附剂，如高岭土和/或膨润土；润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和/或其混合物；着色剂；和缓冲剂。出于本发明的目的，术语“药学上可接受的载剂”包括如上述载剂、填充剂或增量剂、粘合剂、保湿剂、溶解延迟剂、湿润剂、吸收剂、润滑剂、着色剂和缓冲剂的所有术语。

释放剂、湿润剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于医药组合物中。用于片剂、胶囊、丸剂等的示范性包衣剂包括用于肠溶衣的那些包衣剂，如邻苯二甲酸乙酸纤维素、聚邻苯二甲酸乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、偏苯三甲酸乙酸纤维素、羧甲基乙基纤维素、丁二酸乙酸羟丙基甲基纤维素等。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基大茴香醚、丁基化羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

组合物也可使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素或其它聚合物基质、脂质体和/或微球体来加以调配，以提供活性剂的缓慢或控制释放。另外，本发明的医药组合物可含有乳浊剂，并且可经调配以使得其仅在或优先在胃肠道的某些部分中释放活性剂，任选地以延迟方式释放。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性剂也可呈微囊封形式，任选地与一种或多种上文所描述的赋形剂一起。

本发明的一个实施例包括一种口服剂型，其包含胶囊、片剂、液体或悬浮液形式的化合物I或结晶形式I'。本发明的另一实施例涉及一种口服剂型，其中受试者中化合物I或结晶形式I'的释放为立即、受控或延迟释放。如果使用胶囊作为口服剂型，那么另一实施例包括包含明胶、多醣或合成聚合物的胶囊。在一特定实施例中，胶囊包含羟丙基甲基纤维素。

本发明的适合胶囊材料系选自明胶、纤维素衍生物、淀粉、淀粉衍生物、聚葡萄胺糖和合成塑料。如果明胶用作胶囊材料，那么其可与选自聚乙二醇(PEG)、甘油、山梨糖醇、聚丙二醇、PEO-PPO嵌段共聚物和其它多元醇和聚醚的其它添加剂混合使用。在纤维素衍生物用作胶囊材料时，羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素和羟乙基纤维素为优选聚合物。如果合成塑料用作胶囊材料，那么聚乙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二酯为优选材料。尤其优选为聚乙烯、聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二酯。

适合用于口服给予的液体剂型(以说明的方式)包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。液体剂型通常包含活性剂和惰性稀释剂(如水)或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(例如棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇、和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯和其混合物。悬浮液可含有悬浮剂，如乙氧基化异硬脂基醇、聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪和其混合物。

当意图用于口服给药时，本发明的医药组合物可以单位剂型包装。术语“单位剂型”是指适合于向患者给药的物理离散单位，即各单元单独含有或与一个或多个其它单元组合含有经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性剂。举例来说，所述单位剂型可为胶囊、片剂、丸剂等。

在另一实施例中，本发明的组合物适合于吸入给予，并且通常呈喷雾剂或粉末形式。一般使用熟知的递送装置(如喷雾器、干粉或定量剂量吸入器)给予此类组合物。喷雾器装置产生高速气流，以使组合物以薄雾形式喷出而携加载患者的呼吸道中。一种示范性喷雾器调配物包含溶解于载剂中以形成溶液的活性剂，或包含经微米化并且与载剂组合以形成含有可吸入尺寸的微米化粒子的悬浮液的活性剂。干粉吸入器给予呈自由流动粉末形式的活性剂，所述活性剂在吸气期间分散在患者的气流中。示范性干粉调配物包含与赋形剂(如乳糖、淀粉、甘露糖醇、右旋糖、聚乳酸、聚乳酸交酯-共-乙交酯和其组合)干式掺合的活性剂。定量剂量吸入器使用压缩推进剂气体排出所测量的量的活性剂。示范性定量剂量调配物包含活性剂于液化推进剂(如氯氟碳化物或氢氟烷烃)中的溶液或悬浮液。此类调配物的任选组分包括共溶剂，如乙醇或戊烷；和表面活性剂，如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂、甘油和月桂基硫酸钠。此类组合物通常通过向含有活性剂、乙醇(如果存在)和表面活性剂(如果存在)的适合容器中添加经冷却或经加压的氢氟烷烃来制备。为制备悬浮液，将活性剂微米化，随后与推进剂组合。或者，悬浮液调配物可通过喷雾干燥活性剂的微米化粒子上的表面活性剂包衣来制备。随后将调配物装入气雾剂罐中，所述气雾剂罐形成吸入器的一部分。

化合物I或结晶形式I'和其组合物也可非经肠(例如通过皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内注射)给予。为进行此类给予，活性剂以无菌溶液、悬浮液或乳液形式提供。用于制备此类调配物的示范性溶剂包括水、生理食盐水、电解质、低分子量醇(如丙二醇)和聚乙二醇、油、氨基酸、明胶、糖、脂肪酸酯(如油酸乙酯)等。非经肠调配物也可含有一种或多种抗氧化剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。表面活性剂、其它稳定剂或pH调节剂(酸、碱或缓冲剂)和抗氧化剂尤其适用于为调配物提供稳定性以例如使化合物中可能存在的酯和酰胺键的水解减至最少或避免水解。可通过使用无菌可注射介质、灭菌剂、过滤、照射或加热使这些调配物无菌。

代表性生理学上可接受的水性载剂包括(例如)注射用无菌水，USP；右旋糖注射，USP(例如2.5、5.0、10、20％右旋糖，包括5％右旋糖注射液(D5/W))；右旋糖和氯化钠注射液，USP(例如2.5至10％变化的右旋糖和0.12(19mEq钠)至0.9％(154mEq钠)变化的氯化钠)；甘露糖醇注射液，USP(例如5、10、15、20和25％甘露糖醇)；林格氏注射液，USP(例如每升147mEq钠、4mEq钾、4.5mEq钙和156mEq氯)；乳酸化林格氏注射液，USP(例如每升2.7mEq钙、4mEq钾、130mEq钠和28mEq乳酸根)；氯化钠注射液，USP(例如0.9％氯化钠)等。

在给予患者时，化合物I或结晶形式I'通常以每毫克化合物I或结晶形式I'约0.5mL至约10mL水性载剂稀释，如每毫克约0.6至约8mL。

在一个特定实施例中，非经肠调配物包含环糊精水溶液作为药学上可接受的载剂。适合环糊精包括含有在1,4位置处通过如在淀粉酶、β-环糊精或环庚淀粉中的键连接的六个或更多个α-D-吡喃葡萄糖单元的环状分子。示范性环糊精包括环糊精衍生物，如羟丙基环糊精和磺酸基丁醚环糊精，如羟丙基-β-环糊精和磺酸基丁醚β-环糊精。用于此类调配物的示范性缓冲剂包括基于羧酸的缓冲剂，如柠檬酸盐、乳酸盐和顺丁烯二酸盐缓冲溶液。在本发明的一个实施例中，静脉内剂型包含缓冲溶液中的化合物I或结晶形式I'或结晶形式1'。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'或其医药组合物为冻干粉末。通常，冻干粉末为无菌的并且包装在密封小瓶或安瓿或类似容器中。

化合物I或结晶形式I'也可使用已知经皮递送系统和赋形剂来经皮给予。举例来说，化合物I或结晶形式I'可与渗透增强剂(如丙二醇、聚乙二醇单月桂酸酯、氮杂环-2-酮等)混合，并且并入贴片或类似递送系统中。必要时，可在此类经皮组合物中使用其它赋形剂，包括胶凝剂、乳化剂和缓冲剂。

第二药剂

化合物I或结晶形式I'可适用于单独治疗疾病，或可与一种或多种其它治疗剂组合以获得所需治疗效果。因此，在一个实施例中，本发明的医药组合物含有与化合物I或结晶形式I'共同给予的其它药物。举例来说，组合物可进一步包含一种或多种药物(也称为“第二药剂”)。此类治疗剂为所属领域所熟知，并且包括腺苷受体拮抗剂、α-肾上腺素激导性受体拮抗剂、β₁-肾上腺素激导性受体拮抗剂、β₂-肾上腺素激导性受体促效剂、双重作用β-肾上腺素激导性受体拮抗剂/α₁-受体拮抗剂、晚期糖基化终点产物裂解剂、醛固酮拮抗剂、醛固酮合成酶抑制剂、氨基肽酶N抑制剂、雄激素、血管紧张素转化酶抑制剂和双重作用血管紧张素转化酶/脑啡肽酶抑制剂、血管紧张素转化酶2活化剂和刺激剂、血管紧张素-II疫苗、抗凝剂、抗糖尿病剂、止泻剂、抗青光眼剂、抗脂质剂、止痛剂、抗血栓形成剂、AT₁受体拮抗剂和双重作用AT₁受体拮抗剂/脑啡肽酶抑制剂和多功能血管紧张素受体阻断剂、缓激肽受体拮抗剂、钙通道阻断剂、凝乳酶抑制剂、地高辛、利尿剂、多巴胺促效剂、内皮素转化酶抑制剂、内皮素受体拮抗剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、雌激素、雌激素受体促效剂和/或拮抗剂、盐皮质素受体拮抗剂、单胺再吸收抑制剂、肌肉松弛剂、利钠肽等、利钠肽清除受体拮抗剂、脑啡肽酶抑制剂、氧化氮供体、非甾族消炎剂、N-甲基d-天冬氨酸受体拮抗剂、类鸦片受体促效剂、磷酸二酯酶抑制剂(例如PDE5和PDE9)、前列腺素类似物、前列腺素受体促效剂、肾素抑制剂、选择性血清素再吸收抑制剂、钠通道阻断剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂和活化剂、三环抗抑郁剂、血管加压素受体拮抗剂和其组合。这些药剂的特定实例详述于本文中。

特定实施例包括医药组合物，其包含化合物I或结晶形式I'或其结晶形式和AT₁受体拮抗剂、血管收缩素转化酶抑制剂、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂、肾素抑制剂、利尿剂或其组合和任选的一种或多种药学上可接受的载剂。

因此，在本发明的另一方面中，医药组合物包含化合物I或结晶形式I'、第二活性剂和药学上可接受的载剂。第三、第四等活性剂也可包括在组合物中。在组合疗法中，化合物I或结晶形式I'的给予量以及第二药剂的量可小于单药疗法中通常给予的量。

化合物I或结晶形式I'可与第二活性剂物理混合以形成含有两种药剂的组合物；或各药剂可存在于独立并且不同的组合物中，所述组合物同时或在独立时间向患者给予。举例来说，可使用常规程序和设备将化合物I或结晶形式I'与第二活性剂组合，以形成包含化合物I或结晶形式I'和第二活性剂的活性剂的组合。另外，活性剂可与药学上可接受的载剂组合，以形成包含化合物I或结晶形式I'、第二活性剂和药学上可接受的载剂的医药组合物。在这一实施例中，通常混合或掺合组合物的组分以产生物理混合物。接着使用本文所述的任何途径以治疗有效量给予所述物理混合物。

或者，活性剂可在向患者给予之前保持为独立并且不同的。在这一实施例中，药剂在给予之前不以物理方式混合在一起，而以独立组合物形式同时或在独立时间给予。此类组合物可分开包装或可一起包装在试剂盒中。当在独立时间给予时，第二药剂将通常在给予化合物I或结晶形式I'之后24小时以内给予，在与给予本发明化合物同时至给药后约24小时的范围内的任何时间给予。这也称为依次给予。因此，化合物I或结晶形式I'与另一活性剂可使用两种片剂同时或依次口服给予，各活性剂对应于一种片剂，其中依次可意指在给予化合物I或结晶形式I'后立即给予，或在某一预定时间后(例如一小时后或三小时后)给予。还预期第二药剂可在给予化合物I或结晶形式I'之后超过24小时给予。或者，可通过不同给予途径给予组合，即，一种口服给予而另一种通过吸入给予。

在一个实施例中，试剂盒包含第一剂型，其包含化合物I或结晶形式I'；和至少一种其它剂型，其包含本文所阐述的第二药剂中的一或多者，其量足以进行本发明的方法。第一剂型和第二(或第三等)剂型一起包含用于治疗或预防患者的疾病或医学病状的治疗有效量的活性剂。

当包括第二药剂时，其以治疗有效量存在以使得当与化合物I或结晶形式I'共同给予时，其通常给予的量产生治疗学上有益的效果。第二药剂可呈药学上可接受的盐、溶剂合物、光学纯立体异构体等的形式。第二药剂还可呈前药形式，例如具有已酯化的羧酸基的化合物。因此，本文中所列的第二药剂意图包括所有此类形式，并且可购得或可使用常规程序和试剂制备。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与腺苷受体拮抗剂组合给予，所述腺苷受体拮抗剂的实例包括那昔茶碱(naxifylline)、罗咯茶碱(rolofylline)、SLV-320、茶碱(theophylline)和托纳普茶碱(tonapofylline)。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与α-肾上腺素激导性受体拮抗剂组合给予，所述α-肾上腺素激导性受体拮抗剂的实例包括多沙唑嗪(doxazosin)、哌唑嗪(prazosin)、坦索洛新(tamsulosin)和特拉唑嗪(terazosin)。

化合物I或结晶形式I'还可与如下β₁-肾上腺素激导性受体拮抗剂(“β₁-阻断剂”)组合给予，其实例包括醋丁洛尔(acebutolol)、阿普洛尔(alprenolol)、胺磺洛尔(amosulalol)、阿罗洛尔(arotinolol)、阿替洛尔(atenolol)、苯呋洛尔(befunolol)、倍他洛尔(betaxolol)、贝凡洛尔(bevantolol)、比绍洛尔(bisoprolol)、波吲洛尔(bopindolol)、布新洛尔(bucindolol)、布库洛尔(bucumolol)、布非洛尔(bufetolol)、丁呋洛尔(bufuralol)、布尼洛尔(bunitrolol)、布拉洛尔(bupranolol)、巴布里丁(bubridine)、丁非洛尔(butofilolol)、卡拉洛尔(carazolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、塞他洛尔(cetamolol)、氯拉洛尔(cloranolol)、地来洛尔(dilevalol)、依泮洛尔(epanolol)、艾司洛尔(esmolol)、茚诺洛尔(indenolol)、拉贝洛尔(labetolol)、左布诺洛尔(levobunolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、美替洛尔(metipranolol)、美托洛尔(metoprolol)(如丁二酸美托洛尔和酒石酸美托洛尔)、莫普洛尔(moprolol)、纳多洛尔(nadolol)、萘肟洛尔(nadoxolol)、奈必洛尔(nebivalol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、培布洛尔(perbutolol)、品多洛尔(pindolol)、普拉洛尔(practolol)、丙萘洛尔(pronethalol)、普萘洛尔(propranolol)、索他洛尔(sotalol)、硫氧洛尔(sufinalol)、塔林多尔(talindol)、特他洛尔(tertatolol)、替利洛尔(tilisolol)、噻吗洛尔(timolol)、托利洛尔(toliprolol)、希苯洛尔(xibenolol)和其组合。在一个特定实施例中，β₁-拮抗剂选自阿替洛尔、比绍洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和其组合。通常，β₁-阻断剂的给予量应足以每剂提供约2-900mg。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下β₂-肾上腺素激导性受体促效剂组合给予，其实例包括沙丁胺醇(albuterol)、比托特罗(bitolterol)、非诺特罗(fenoterol)、福莫特罗(formoterol)、茚达特罗(indacaterol)、异他林(isoetharine)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、间羟异丙肾上腺素(metaproterenol)、吡布特罗(pirbuterol)、羟甲叔丁肾上腺素(salbutamol)、沙甲胺醇(salmefamol)、沙美特罗(salmeterol)、特布他林(terbutaline)、维兰特罗(vilanterol)等。通常，β₂-肾上腺素激导性受体促效剂的给予量应足以每剂量提供约0.05-500μg。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下晚期糖基化终点产物(AGE)裂解剂组合给予，其实例包括阿拉格布(alagebrium)(或ALT-711)和TRC4149。

在另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下醛固酮拮抗剂组合给予，其实例包括依普利酮(eplerenone)、螺内酯(spironolactone)和其组合。通常，醛固酮拮抗剂的给予量应足以提供每天约5-300mg。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下氨基肽酶N或二肽基肽酶III抑制剂组合给予，其实例包括苯丁抑制素(bestatin)和PC18(2-氨基-4-甲磺酰基丁硫醇、甲硫氨酸硫醇)。

化合物I或结晶形式I'也可与如下血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂组合给予，其实例包括阿克普利(accupril)、阿拉普利(alacepril)、贝那普利(benazepril)、贝那普利拉(benazeprilat)、卡托普利(captopril)、西那普利(ceranapril)、西拉普利(cilazapril)、地拉普利(delapril)、依那普利(enalapril)、依那普利拉(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、福辛普利拉(fosinoprilat)、咪达普利(imidapril)、赖诺普利(lisinopril)、莫西普利(moexipril)、蒙诺普利(monopril)、莫维普利(moveltipril)、喷托普利(pentopril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、喹那普利拉(quinaprilat)、雷米普利(ramipril)、雷米普利拉(ramiprilat)、乙酸色拉新(saralasinacetate)、螺普利(spirapril)、替莫普利(temocapril)、群多普利(trandolapril)、佐芬普利(zofenopril)和其组合。在一个特定实施例中，ACE抑制剂选自：贝那普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利、雷米普利以及其组合。通常，ACE抑制剂的给予量将足以提供每天约1-150mg。

在另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下双重作用血管紧张素转化酶/脑啡肽酶(ACE/NEP)抑制剂组合给予，其实例包括：AVE-0848((4S,7S,12bR)-7-[3-甲基-2(S)-磺酰基丁酰氨基]-6-氧代-1,2,3,4,6,7,8,12b-八氢吡啶并[2,1-a][2]-苯并氮呯-4-甲酸)；AVE-7688(艾尔帕曲(ilepatril))和其母化合物；BMS-182657(2-[2-氧代-3(S)-[3-苯基-2(S)-磺酰基丙酰氨基]-2,3,4,5-四氢-1H-1-苯并氮呯-1-基]乙酸)；CGS-35601(N-[1-[4-甲基-2(S)-磺酰基戊酰氨基]环戊基-羰基]-L-色氨酸)；法西多曲(fasidotril)；法西多利拉(fasidotrilate)；依那普利拉；ER-32935((3R,6S,9aR)-6-[3(S)-甲基-2(S)-磺酰基戊酰氨基]-5-氧代全氢噻唑并[3,2-a]氮呯-3-甲酸)；杰帕曲拉；MDL-101264((4S,7S,12bR)-7-[2(S)-(2-吗啉基乙酰基硫基)-3-苯基丙酰氨基]-6-氧代-1,2,3,4,6,7,8,12b-八氢吡啶并[2,1-a][2]苯并氮呯-4-甲酸)；MDL-101287([4S-[4α,7α(R*),12bβ]]-7-[2-(羧甲基)-3-苯基丙酰氨基]-6-氧代-1,2,3,4,6,7,8,12b-八氢吡啶并[2,1-a][2]苯并氮呯-4-甲酸)；奥马曲拉；RB-105(N-[2(S)-(巯基甲基)-3(R)-苯基丁基]-L-丙氨酸)；山帕曲拉；SA-898((2R,4R)-N-[2-(2-羟基苯基)-3-(3-巯基丙酰基)噻唑啶-4-基羰基]-L-苯丙氨酸)；Sch-50690(N-[1(S)-羧基-2-[N2-(甲烷磺酰基)-L-赖氨酰基氨基]乙基]]-L-缬氨酰基-L-酪氨酸)；并且也可包括其组合。在一个特定实施例中，ACE/NEP抑制剂选自：AVE-7688、依那普利拉、法西多曲、法西多利拉、奥马曲拉、山帕曲拉和其组合。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与血管紧张素转化酶2(ACE2)活化剂或刺激剂组合给予。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下血管紧张素-II疫苗组合给予，其实例包括ATR12181和CYT006-AngQb。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下抗凝剂组合给予，其实例包括：香豆素，如华法林(warfarin)；肝素；和直接凝血酶抑制剂，如阿加曲班(argatroban)、比伐卢定(bivalirudin)、达比加群(dabigatran)和来匹卢定(lepirudin)。

在又另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下抗糖尿病剂组合给予，其实例包括可注射药物以及口服有效药物和其组合。可注射药物的实例包括胰岛素和胰岛素衍生物。口服有效药物的实例包括(但不限于)：双胍，如二甲双胍；升糖素拮抗剂；α-葡糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖(acarbose)和米格列醇(miglitol)；二肽基肽酶IV抑制剂(DPP-IV抑制剂)，如阿格列汀(alogliptin)、地那列汀(denagliptin)、利拉利汀(linagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、西他列汀(sitagliptin)和维格列汀(vildagliptin)；美格替奈(meglitinide)，如瑞格列奈(repaglinide)；恶二唑啶二酮；磺酰脲，如氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)和妥拉磺脲(tolazamide)；噻唑啶二酮，如吡格列酮(pioglitazone)和罗格列酮(rosiglitazone)；和其组合。

在另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与止泻治疗组合给予。代表性治疗选项包括口服复水溶液(ORS)、洛哌丁胺(loperamide)、苯乙哌啶(diphenoxylate)和次水杨酸铋。

在又另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下抗青光眼剂组合给予，其实例包括：α-肾上腺素促效剂，如溴莫尼定(brimonidine)；β₁-肾上腺素激导性受体拮抗剂；局部β₁-阻断剂，如倍他洛尔、左布诺洛尔和噻吗洛尔；碳酸酐酶抑制剂，如乙酰唑胺(acetazolamide)、布尔佐胺(brinzolamide)或多佐胺(dorzolamide)；胆碱能促效剂，如西维美林(cevimeline)和DMXB-假木贼碱(DMXB-anabaseine)；肾上腺素化合物；缩瞳剂，如匹鲁卡品(pilocarpine)；和前列腺素类似物。

在又一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下抗脂质剂组合给予，其实例包括：胆固醇酯转移蛋白抑制剂(CETP)，如安塞曲匹(anacetrapib)、达塞曲匹(dalcetrapib)和托塞曲匹(torcetrapib)；他汀，如阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、罗素他汀(rosuvastatin)和辛伐他汀(simvastatin)；和其组合。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下抗血栓形成剂组合给予，其实例包括：阿司匹林(aspirin)；抗血小板剂，如氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)和噻氯匹定(ticlopidine)；肝素和其组合。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与AT₁受体拮抗剂(也称为血管紧张素II1型受体阻断剂(ARB))组合。代表性ARB包括阿比沙坦(abitesartan)、阿齐沙坦(azilsartan)(例如阿齐沙坦酯(azilsartan medoxomil))、本洛沙坦(benzyllosartan)、坎地沙坦(candesartan)、坎地沙坦西酯(candesartan cilexetil)、依利沙坦(elisartan)、恩布沙坦(embusartan)、依诺他索沙坦(enoltasosartan)、依普罗沙坦(eprosartan)、EXP3174、范沙坦(fonsartan)、福拉沙坦(forasartan)、格洛沙坦(glycyllosartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、伊索特林(isoteoline)、洛沙坦(losartan)、美度米(medoxomil)、米法沙坦(milfasartan)、奥美沙坦(olmesartan)(例如奥美沙坦美度米(olmesartan medoxomil))、奥普米沙坦(opomisartan)、普拉沙坦(pratosartan)、利匹沙坦(ripisartan)、沙普立沙坦(saprisartan)、色拉新(saralasin)、萨美新(sarmesin)、TAK-591、他索沙坦(tasosartan)、替米沙坦(telmisartan)、缬沙坦(valsartan)、佐拉沙坦(zolasartan)和其组合。在一个特定实施例中，ARB选自阿齐沙坦酯、坎地沙坦西酯、依普罗沙坦、厄贝沙坦、洛沙坦、奥美沙坦美度米、沙普立沙坦、他索沙坦、替米沙坦、缬沙坦和其组合。示范性盐和/或前药包括坎地沙坦西酯、甲磺酸依普罗沙坦、洛沙坦钾盐和奥美沙坦美度米。通常，ARB以足以提供每剂量约4-600mg的量给予，其中示范性日剂量在每天20-320mg范围内。

化合物I或结晶形式I'也可与如下双重作用药剂(如AT₁受体拮抗剂/脑啡肽酶抑制剂(ARB/NEP)抑制剂)组合给予，其实例包括均来自阿莱格雷蒂(Allegretti)等人的美国专利第7,879,896号和第8,013,005号中所描述的化合物，如化合物4'-{2-乙氧基-4-乙基-5-[((S)-2-巯基-4-甲基戊酰基氨基)-甲基]咪唑-1-基甲基}-3'-氟联苯-2-甲酸。

化合物I或结晶形式I'也可与如库尔兹(Kurtz)和克莱恩(Klein)(2009)高血压研究(Hypertension Research)32:826-834中所述的多功能血管紧张素受体阻断剂组合给予。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与缓激肽受体拮抗剂(例如艾替班特(icatibant)(HOE-140))组合给予。预期这一组合疗法可提供预防血管性水肿或较高缓激肽水平的其它非所需后果的优点。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下钙通道阻断剂组合给予，其实例包括胺氯地平(amlodipine)、阿尼帕米(anipamil)、阿拉尼平(aranipine)、巴尼地平(barnidipine)、苄环烷(bencyclane)、贝尼地平(benidipine)、苄普地尔(bepridil)、克仑硫卓(clentiazem)、西尼地平(cilnidipine)、桂利嗪(cinnarizine)、地尔硫卓(diltiazem)、依福地平(efonidipine)、依高地平(elgodipine)、依他苯酮(etafenone)、非洛地平(felodipine)、芬地林(fendiline)、氟桂利嗪(flunarizine)、加洛帕米(gallopamil)、伊拉地平(isradipine)、拉西地平(lacidipine)、乐卡地平(lercanidipine)、利多氟嗪(lidoflazine)、洛美利嗪(lomerizine)、马尼地平(manidipine)、米贝地尔(mibefradil)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼古地平(niguldipine)、尼鲁地平(niludipine)、尼伐地平(nilvadipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)、尼伐尔地平(nivaldipine)、哌克昔林(perhexiline)、普尼拉明(prenylamine)、里奥斯定(ryosidine)、司莫地尔(semotiadil)、特罗地林(terodiline)、泰尔帕米(tiapamil)、维拉帕米(verapamil)和其组合。在一个特定实施例中，钙通道阻断剂选自胺氯地平、苄普地尔、地尔硫卓、非洛地平、伊拉地平、拉西地平、尼卡地平、硝苯地平、尼古地平、尼鲁地平、尼莫地平、尼索地平、里奥斯定、维拉帕米和其组合。通常，钙通道阻断剂以足以提供每剂量约2-500mg的量给予。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下凝乳酶抑制剂组合给予，如TPC-806和2-(5-甲酰氨基-6-氧代-2-苯基-1,6-二氢嘧啶-1-基)-N-[{3,4-二氧代-1-苯基-7-(2-吡啶氧基)}-2-庚基]乙酰胺(NK3201)。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下利尿剂组合给予，其实例包括：碳酸酐酶抑制剂，如乙酰唑胺(acetazolamide)和双氯非那胺(dichlorphenamide)；环利尿剂，其包括磺酰胺衍生物(如乙酰唑胺、安布赛特(ambuside)、阿佐塞米(azosernide)、布美他尼(bumetanide)、布他唑胺(butazolamide)、氯米非那胺(chloraminophenamide)、氯非那胺(clofenamide)、氯帕胺(clopamide)、氯索隆(clorexolone)、二磺法胺(disulfamide)、依索唑胺(ethoxolamide)、呋塞米(furosemide)、美夫西特(mefruside)、醋甲唑胺(methazolamide)、吡咯他尼(piretanide)、托拉塞米(torsemide)、曲帕胺(tripamide)和希帕胺(xipamide))以及非磺酰胺利尿剂(如依他尼酸(ethacrynic acid))和其它苯氧基乙酸化合物(如替尼酸(tienilic acid)、茚达立酮(indacrinone)和喹卡酯(quincarbate))；渗透性利尿剂，如甘露糖醇；留钾利尿剂(potassium-sparingdiuretics)，其包括醛固酮拮抗剂(如螺内酯)和Na⁺通道抑制剂(如胺氯吡脒(amiloride)和胺苯喋啶(triamterene))；噻嗪和类噻嗪利尿剂，如阿尔噻嗪(althiazide)、苄氟甲噻嗪(bendroflumethiazide)、苄氢氯噻嗪(benzylhydrochlorothiazide)、苄噻嗪(benzthiazide)、布噻嗪(buthiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、氯噻嗪(chlorothiazide)、环戊噻嗪(cyclopenthiazide)、环噻嗪(cyclothiazide)、依匹噻嗪(epithiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、芬喹唑(fenquizone)、氟甲噻嗪(flumethiazide)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、氢氟噻嗪(hydroflumethiazide)、吲达帕胺(indapamide)、甲氯噻嗪(methylclothiazide)、美替克仑(meticrane)、美托拉宗(metolazone)、对氟噻嗪(paraflutizide)、多噻嗪(polythiazide)、喹乙唑酮(quinethazone)、四氯噻嗪(teclothiazide)和三氯噻嗪(trichloromethiazide)；和其组合。在一个特定实施例中，利尿剂选自胺氯吡脒、布美他尼、氯噻嗪、氯噻酮、双氯非那胺、依他尼酸、呋塞米、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、吲达帕胺、甲氯噻嗪、美托拉宗、托拉塞米、胺苯喋啶和其组合。利尿剂以足以提供每天约5-50mg(更通常每天6-25mg)的量给予，其中常见剂量为每天6.25mg、12.5mg或25mg。

化合物I或结晶形式I'也可与如下内皮素转化酶(ECE)抑制剂组合给予，其实例包括膦酰二肽、CGS 26303和其组合。

在一个特定实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下内皮素受体拮抗剂组合给予，其实例包括：影响内皮素A受体的选择性内皮素受体拮抗剂，如阿伏生坦(avosentan)、安立生坦(ambrisentan)、阿曲生坦(atrasentan)、BQ-123、克拉生坦(clazosentan)、达卢生坦(darusentan)、西他塞坦(sitaxentan)和齐泊替坦(zibotentan)；和影响内皮素A与B受体的双重内皮素受体拮抗剂，如波生坦(bosentan)、马西替坦(macitentan)和替唑生坦(tezosentan)。

在又另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与一种或多种HMG-CoA还原酶抑制剂(也称为他汀)组合给予。代表性他汀包括(但不限于)阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀、罗素他汀和辛伐他汀。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下单胺再吸收抑制剂组合给予，其实例包括去甲肾上腺素再吸收抑制剂，如阿托莫西汀(atomoxetine)、丁胺苯丙酮(buproprion)和丁胺苯丙酮代谢物羟基丁胺苯丙酮、麦普替林(maprotiline)、瑞波西汀(reboxetine)和维洛沙嗪(viloxazine)；选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)，如西酞普兰(citalopram)和西酞普兰代谢物去甲西酞普兰(desmethylcitalopram)、达泊西汀(dapoxetine)、依地普兰(escitalopram)(例如草酸依地普兰)、氟西汀(fluoxetine)和氟西汀去甲基代谢物去甲氟西汀(norfluoxetine)、氟伏沙明(fluvoxamine)(例如顺丁烯二酸氟伏沙明)、帕罗西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)和舍曲林代谢物去甲舍曲林(demethylsertraline)；双重血清素-去甲肾上腺素再吸收抑制剂(SNRI)，如比西发定(bicifadine)、度洛西汀(duloxetine)、米那普仑(milnacipran)、奈法唑酮(nefazodone)和文拉法辛(venlafaxine)；和其组合。

在另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下肌肉弛缓剂组合给予，其实例包括：肌安宁(carisoprodol)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)、环苯扎平(cyclobenzaprine)、二氟尼柳(diflunisal)、美他沙酮(metaxalone)、美索巴莫(methocarbamol)和其组合。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下利钠肽或类似物组合给予，其实例包括：卡培立肽(carperitide)、CD-NP(Nile Therapeutics)、CU-NP、奈西立肽(nesiritide)、PL-3994(帕拉丁技术公司(Palatin Technologies,Inc.))、乌拉立肽(ularitide)、森德立肽(cenderitide)和奥佳华(Ogawa)等人,(2004)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279:28625-31中所述的化合物。这些化合物也称为利钠肽受体-A(NPR-A)促效剂。在另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下利钠肽清除受体(NPR-C)拮抗剂组合给予，如SC-46542、cANF(4-23)和AP-811(维尔(Veale)(2000)生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg Med Chem Lett)10:1949-52)。举例来说，当与NEP抑制剂塞奥芬组合时，AP-811展示协同作用(韦格纳(Wegner)(1995)临床与实验高血压(Clin.Exper.Hypert.)17:861-876)。

在另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下脑啡肽酶(NEP)抑制剂组合给予，其实例包括：AHU-377；坎沙曲；坎沙曲拉；右卡多曲(dexecadotril)((+)-N-[2(R)-(乙酰基巯基甲基)-3-苯基丙酰基]甘氨酸苯甲酯)；CGS-24128(3-[3-(联苯-4-基)-2-(膦酰基甲基氨基)丙酰氨基]丙酸)；CGS-24592((S)-3-[3-(联苯-4-基)-2-(膦酰基甲基氨基)丙酰氨基]丙酸)；CGS-25155(N-[9(R)-(乙酰基硫基甲基)-10-氧代-1-氮杂环癸-2(S)-基羰基]-4(R)-羟基-L-脯氨酸苯甲酯)；赫普沃斯(Hepworth)等人的WO 2006/027680中所述的3-(1-氨甲酰基环己基)丙酸衍生物(辉瑞公司(Pfizer Inc.))；JMV-390-1(2(R)-苯甲基-3-(N-羟基氨甲酰基)丙酰基-L-异亮氨酰基-L-白氨酸)；依卡曲尔(ecadotril)；膦酰二肽；反向塞奥芬(retrothiorphan)；RU-42827(2-(巯基甲基)-N-(4-吡啶基)苯丙酰胺)；RU-44004(N-(4-吗啉基)-3-苯基-2-(磺酰基甲基)丙酰胺)；SCH-32615((S)-N-[N-(1-羧基-2-苯乙基)-L-苯丙氨酰基]-β-丙氨酸)和其前药SCH-34826((S)-N-[N-[1-[[(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基]羰基]-2-苯乙基]-L-苯丙氨酰基]-β-丙氨酸)；萨洛芬(sialorphin)；SCH-42495(N-[2(S)-(乙酰基磺酰基甲基)-3-(2-甲基苯基)丙酰基]-L-甲硫氨酸乙酯)；司皮诺芬(spinorphin)；SQ-28132(N-[2-(巯基甲基)-1-氧代-3-苯丙基]白氨酸)；SQ-28603(N-[2-(巯基甲基)-1-氧代-3-苯丙基]-β-丙氨酸)；SQ-29072(7-[[2-(巯基甲基)-1-氧代-3-苯丙基]氨基]庚酸)；塞奥芬和其前药消旋卡多曲(racecadotril)；UK-69578(顺-4-[[[1-[2-羧基-3-(2-甲氧基乙氧基)丙基]环戊基]羰基]氨基]环己甲酸)；UK-447,841(2-{1-[3-(4-氯苯基)丙基氨甲酰基]-环戊基甲基}-4-甲氧基丁酸)；UK-505,749((R)-2-甲基-3-{1-[3-(2-甲基苯并噻唑-6-基)丙基氨甲酰基]环戊基}丙酸)；5-联苯-4-基-4-(3-羧基丙酰基氨基)-2-甲基戊酸和5-联苯-4-基-4-(3-羧基丙酰基氨基)-2-甲基戊酸乙酯(WO 2007/056546)；赫德尔(Khder)等人的WO 2007/106708中所述的达鲁曲(daglutril)[(3S,2'R)-3-{1-[2'-(乙氧羰基)-4'-苯基丁基]-环戊-1-羰基氨基}-2,3,4,5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮呯-1-乙酸](诺华公司(Novartis AG))；和其组合。在一个特定实施例中，NEP抑制剂选自AHU-377、坎沙曲、坎沙曲拉、CGS-24128、膦酰二肽、SCH-32615、SCH-34826、SQ-28603、塞奥芬和其组合。在一个特定实施例中，NEP抑制剂为如达鲁曲或CGS-26303([N-[2-(联苯-4-基)-1(S)-(1H-四唑-5-基)乙基]氨基]甲基膦酸)的化合物，其具有作为内皮素转化酶(ECE)与NEP的抑制剂的活性。也可使用其它双重作用ECE/NEP化合物。NEP抑制剂以足以提供每天约20-800mg的量给予，其中典型日剂量在每天50-700mg，更通常每天100-600mg或100-300mg范围内。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下氧化氮供体组合给予，其实例包括尼可地尔(nicorandil)；有机硝酸酯，如季戊四醇四硝酸酯；和斯德酮亚胺(sydnonimine)，如林西多明(linsidomine)和吗多明(molsidomine)。

在又另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下非甾族消炎剂(NSAID)组合给予，其实例包括：阿西美辛(acemetacin)、乙酰水杨酸(acetyl salicylic acid)、阿氯芬酸(alclofenac)、阿明洛芬(alminoprofen)、胺芬酸(amfenac)、胺普立糖(amiprilose)、阿洛普令(aloxiprin)、阿尼罗酸(anirolac)、阿帕宗(apazone)、阿扎丙宗(azapropazone)、贝诺酯(benorilate)、苯恶洛芬(benoxaprofen)、苯哌隆(bezpiperylon)、溴哌莫(broperamole)、布氯酸(bucloxic acid)、卡洛芬(carprofen)、环氯茚酸(clidanac)、双氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳、地弗他酮(diftalone)、依诺利康(enolicam)、依托度酸(etodolac)、依托昔布(etoricoxib)、芬布芬(fenbufen)、芬氯酸(fenclofenac)、芬克洛酸(fenclozic acid)、非诺洛芬(fenoprofen)、芬替酸(fentiazac)、非普拉宗(feprazone)、氟芬那酸(flufenamic acid)、氟苯柳(flufenisal)、氟洛芬(fluprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、呋罗芬酸(furofenac)、异丁芬酸(ibufenac)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、吲哚洛芬(indoprofen)、伊索克酸(isoxepac)、伊索昔康(isoxicam)、酮洛芬(ketoprofen)、酮洛酸(ketorolac)、洛非咪唑(lofemizole)、氯诺昔康(lornoxicam)、甲氯芬那酸酯(meclofenamate)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、美色拉嗪(mesalamine)、咪洛芬(miroprofen)、莫非布宗(mofebutazone)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、尼氟酸(niflumic acid)、奥沙普嗪(oxaprozin)、奥西平酸(oxpinac)、羟布宗(oxyphenbutazone)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、吡洛芬(pirprofen)、普拉洛芬(pranoprofen)、双水杨酸酯(salsalate)、舒多昔康(sudoxicam)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、舒林酸(sulindac)、舒洛芬(suprofen)、替诺昔康(tenoxicam)、硫平酸(tiopinac)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)、硫恶洛芬(tioxaprofen)、托芬那酸(tolfenamic acid)、托美丁(tolmetin)、三氟米酯(triflumidate)、齐多美辛(zidometacin)、佐美酸(zomepirac)和其组合。在一个特定实施例中，NSAID选自依托度酸、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、美洛昔康、萘普生、奥沙普嗪、吡罗昔康和其组合。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下N-甲基d-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂组合给予，其实例包括金刚烷胺(amantadine)、右甲吗喃(dextromethorphan)、右丙氧芬(dextropropoxyphene)、氯胺酮(ketamine)、凯托米酮(ketobemidone)、美金刚(memantine)、美沙酮(methadone)等。

在再另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与类鸦片受体促效剂(也称为类鸦片镇痛剂)组合给予。代表性类鸦片受体促效剂包括：丁丙诺啡(buprenorphine)、布托啡诺(butorphanol)、可待因(codeine)、二氢可待因(dihydrocodeine)、芬太尼(fentanyl)、氢可酮(hydrocodone)、氢吗啡酮(hydromorphone)、左洛啡烷(levallorphan)、左啡诺(levorphanol)、哌替啶(meperidine)、美沙酮、吗啡(morphine)、纳布啡(nalbuphine)、纳美芬(nalmefene)、纳洛芬(nalorphine)、纳洛酮(naloxone)、纳曲酮(naltrexone)、纳洛芬、氧可酮(oxycodone)、氧吗啡酮(oxymorphone)、戊唑星(pentazocine)、丙氧吩(propoxyphene)、曲马多(tramadol)和其组合。在某些实施例中，类鸦片受体促效剂选自可待因、二氢可待因、氢可酮、氢吗啡酮、吗啡、氧可酮、氧吗啡酮、曲马多和其组合。

在一个特定实施例中，化合物I或结晶形式I'与磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(尤其PDE-V抑制剂)组合给予。代表性PDE-V抑制剂包括阿伐那非(avanafil)、罗地那非(lodenafil)、米罗地那非(mirodenafil)、西地那非(sildenafil)他达拉非(tadalafil)伐地那非(vardenafil)和乌地那非(udenafil)。

在另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与前列腺素类似物(也称为前列腺素或前列环素类似物)组合给予。代表性前列腺素类似物包括贝前列素钠(beraprost sodium)、比马前列素(bimatoprost)、依前列醇(epoprostenol)、伊洛前列素(iloprost)、拉坦前列素(latanoprost)、他氟前列素(tafluprost)、曲伏前列素(travoprost)和曲前列环素(treprostinil)，其中比马前列素、拉坦前列素和他氟前列素备受关注。

在又另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下前列腺素受体促效剂组合给予，其实例包括比马前列素、拉坦前列素、曲伏前列素等。

化合物I或结晶形式I'也可与如下肾素抑制剂组合给予，其实例包括阿利吉仑(aliskiren)、依那吉仑(enalkiren)、瑞米吉仑(remikiren)和其组合。

在另一实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)组合给予，其实例包括：西酞普兰和西酞普兰代谢物去甲西酞普兰、达泊西汀、依地普兰(例如草酸依地普兰)、氟西汀和氟西汀去甲基代谢物去甲氟西汀、氟伏沙明(例如顺丁烯二酸氟伏沙明)、帕罗西汀、舍曲林和舍曲林代谢物去甲舍曲林和其组合。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下5-HT_1D血清素受体促效剂组合给予，其实例包括曲普坦(triptan)，如阿莫曲普坦(almotriptan)、阿维曲普坦(avitriptan)、依来曲普坦(eletriptan)、夫罗曲普坦(frovatriptan)、那拉曲普坦(naratriptan)、利扎曲普坦(rizatriptan)、舒马曲普坦(sumatriptan)和佐米曲普坦(zolmitriptan)。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下钠通道阻断剂组合给予，其实例包括卡马西平(carbamazepine)、磷苯妥英(fosphenytoin)、拉莫三嗪(lamotrignine)、利多卡因(lidocaine)、美西律(mexiletine)、奥卡西平(oxcarbazepine)、苯妥英(phenytoin)和其组合。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂或活化剂组合给予，其实例包括阿他瓜特(ataciguat)、瑞司瓜特(riociguat)和其组合。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下三环抗抑郁剂(TCA)组合给予，其实例包括阿米替林(amitriptyline)、氧阿米替林(amitriptylinoxide)、布替林(butriptyline)、氯米帕明(clomipramine)、地美替林(demexiptiline)、地昔帕明(desipramine)、二苯西平(dibenzepin)、二甲他林(dimetacrine)、度硫平(dosulepin)、多塞平(doxepin)、丙咪嗪(imipramine)、氧米帕明(imipraminoxide)、洛非帕明(lofepramine)、美利曲辛(melitracen)、美他帕明(metapramine)、硝沙西平(nitroxazepine)、去甲替林(nortriptyline)、诺昔替林(noxiptiline)、哌泊非嗪(pipofezine)、丙吡西平(propizepine)、普罗替林(protriptyline)、奎纽帕明(quinupramine)和其组合。

在一个实施例中，化合物I或结晶形式I'与如下血管加压素受体拮抗剂组合给予，其实例包括考尼伐坦(conivaptan)和托伐普坦(tolvaptan)。

组合的第二治疗剂也可有助于使用本发明化合物的其它组合疗法。举例来说，本发明化合物可与利尿剂和ARB、或钙通道阻断剂和ARB、或利尿剂和ACE抑制剂、或钙通道阻断剂和他汀组合。特定实例包括ACE抑制剂依那普利(呈顺丁烯二酸盐形式)与利尿剂氢氯噻嗪的组合，其以商标出售；或钙通道阻断剂胺氯地平(呈苯磺酸盐形式)与ARB奥美沙坦(呈美度米前药形式)的组合；或钙通道阻断剂与他汀的组合，其也均可与化合物I一起使用。其它治疗剂(如α₂-肾上腺素激导性受体促效剂和血管加压素受体拮抗剂)也可有助于组合疗法。示范性α₂-肾上腺素激导性受体促效剂包括氯压定(clonidine)、右旋美托咪啶(dexmedetomidine)和胍法新(guanfacine)。

下列调配物说明本发明的代表性医药组合物。

用于口服给予的示范性硬明胶胶囊

充分掺合本发明化合物(50g)、440g喷雾干燥的乳糖和10g硬脂酸镁。接着将所得组合物装入硬明胶胶囊中(每胶囊500mg组合物)。或者，将化合物I或结晶形式I'(20mg)与淀粉(89mg)、微晶纤维素(89mg)和硬脂酸镁(2mg)充分掺合。接着使混合物穿过45号目美国筛，并且装入硬明胶胶囊中(每胶囊200mg组合物)。

或者，充分掺合化合物I或结晶形式I'(30g)、第二药剂(20g)、440g喷雾干燥的乳糖和10g硬脂酸镁，并且如上文所述处理。

用于口服给予的示范性明胶胶囊调配物

将化合物I或结晶形式I'(100mg)与聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(50mg)和淀粉粉末(250mg)充分掺合。接着将混合物装入明胶胶囊中(每胶囊400mg组合物)。或者，将化合物1(70mg)和第二药剂(30mg)与聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(50mg)和淀粉粉末(250mg)充分掺合，并且将所得混合物装入明胶胶囊中(每胶囊400mg组合物)。

或者，将化合物I或结晶形式I'(40mg)与微晶纤维素(艾维素(Avicel)PH 103；259.2mg)和硬脂酸镁(0.8mg)充分掺合。接着将混合物装入明胶胶囊(1号尺寸，白色，不透明)中(每胶囊300mg组合物)。

用于口服给予的示范性羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊

将化合物I或结晶形式I'(50mg或100mg)直接装入HPMC胶囊中。

用于口服给予的示范性片剂调配物

使化合物I或结晶形式I'(10mg)、淀粉(45mg)和微晶纤维素(35mg)穿过20号目美国筛，并且充分混合。在50℃-60℃下干燥如此产生的颗粒，并且穿过16号目美国筛。将聚乙烯吡咯烷酮溶液(4mg于无菌水中的10％溶液)与羧甲基淀粉钠(4.5mg)、硬脂酸镁(0.5mg)和滑石(1mg)混合，接着使这一混合物穿过16号目美国筛。接着向颗粒中添加羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石。在混合之后，在压片机上压缩混合物，得到重量为100mg的片剂。

或者，将化合物I或结晶形式I'(250mg)与微晶纤维素(400mg)、烟雾状二氧化硅(10mg)和硬脂酸(5mg)充分掺合。接着压缩混合物以形成片剂(每片剂665mg组合物)。

或者，将化合物I或结晶形式I'(400mg)与玉米淀粉(50mg)、交联羧甲纤维素钠(25mg)、乳糖(120mg)和硬脂酸镁(5mg)充分掺合。接着压缩混合物以形成单刻痕片剂(每片剂600mg组合物)。

或者，用明胶水溶液(20mg)将化合物I或结晶形式I'(100mg)与玉米淀粉(100mg)充分掺合。干燥混合物，并且研磨成细粉末。接着将微晶纤维素(50mg)和硬脂酸镁(5mg)与明胶调配物混合，粒化，并且压缩所得混合物以形成片剂(每片剂100mg本发明化合物)。

用于口服给予的示范性悬浮液调配物

混合下列成分以形成每10mL悬浮液含有100mg化合物I或结晶形式I'的悬浮液：

用于口服给予的示范性液体调配物

适合液体调配物为含有基于羧酸的缓冲剂(如柠檬酸盐、乳酸盐以及顺丁烯二酸盐缓冲溶液)的调配物。举例来说，将化合物I或结晶形式I'(其可与DMSO预混)与100mM柠檬酸铵缓冲剂掺合并且将pH调节至pH 5，或与100mM柠檬酸溶液掺合并且将pH调节至pH 2。此类溶液还可包括增溶性赋形剂(如环糊精)，例如溶液可包括10wt％羟丙基-β-环糊精。

其它适合调配物包括含有或不含有环糊精的5％NaHCO₃溶液。

用于注射给予的示范性非经肠静脉内调配物

将化合物I或结晶形式I'(0.2g)与0.4M乙酸钠缓冲溶液(2.0mL)掺合。视需要使用0.5N盐酸水溶液或0.5N氢氧化钠水溶液将所得溶液的pH调节至pH 4，接着添加足够注射用水以提供20mL的总体积。接着经由无菌过滤器(0.22微米)过滤混合物，得到适合于注射给予的无菌溶液。

以下调配物说明本发明的代表性医药组合物。

调配物实例A

适用于制备可注射溶液的冷冻溶液如下制备：

代表性程序：将赋形剂(如果存在)溶解于约80％注射用水中，添加活性化合物I或I'并且溶解。用1M氢氧化钠将pH调节至3至4.5，并且随后用注射用水将体积调节至最终体积的95％。检验pH值并且必要时进行调节，并且用注射用水将体积调节至最终体积。随后经由0.22微米过滤器无菌过滤调配物并且在无菌条件下置于无菌小瓶中。将小瓶加盖、作标记并且冷冻储存。

调配物实例B

适用于制备可注射溶液的冻干粉末或结晶固体如下制备：

代表性程序：将赋形剂和/或缓冲剂(如果存在)溶解于约60％注射用水中。添加活性化合物I或I'，溶解，用1M氢氧化钠将pH调节至3至4.5并且用注射用水将体积调节至最终体积的95％。检验pH值并且必要时进行调节，并且用注射用水将体积调节至最终体积。随后经由0.22微米过滤器无菌过滤调配物并且在无菌条件下置于无菌小瓶中。随后使用适当冻干循环将调配物冻干。将为加盖(任选地在部分真空或干燥氮气下)，作标记并且冰冻储存。

调配物实例C

用于静脉内给予患者的可注射溶液由以上调配物实例B如下制备：

代表性程序：用20mL无菌水复原调配物实例B(例如含有10至1000mg活性化合物I或I')的冻干粉末，并且用80mL无菌生理食盐水于100mL输注袋中进一步稀释所得溶液。随后将经稀释溶液经30至120分钟静脉内给予患者。

用于吸入给予的示范性组合物

将化合物I或I'(0.2mg)微米化，接着与乳糖(25mg)掺合。接着将这一掺合混合物装入明胶吸入筒中。举例来说，使用干粉吸入器给予所述筒的内含物。

或者，将微米化的化合物I或I'(10g)分散在通过将卵磷脂(0.2g)溶解于去矿物质水(200ml)中所制备的溶液中。喷雾干燥所得悬浮液，接着微米化以形成包含平均直径小于约1.5μm的粒子的微米化组合物。接着将微米化组合物装入含有经加压1,1,1,2-四氟乙烷的定量剂量吸入器筒中，组合物的量在用吸入器给予时足以提供每剂量约10μg至约500μg本发明化合物。

或者，将化合物I或I'(25mg)溶解于柠檬酸盐缓冲(pH 5)的等张生理食盐水(125mL)中。搅拌混合物并且进行超音处理直到化合物溶解。检查溶液的pH，并且必要时通过缓慢添加1N NaOH水溶液将pH调节至pH 5。使用每剂量提供约10μg至约500μg化合物I或I'的喷雾器装置给予溶液。

实例

提供以下反应流程/制备和实例以说明本发明的特定实施例。然而，除非特定指明，否则这些特定实施例并不意图以任何方式限制本发明的范围。

除非另外指明，否则以下缩写具有以下含义，并且本文所使用但未定义的任何其它缩写均具有其通常接受的标准含义：

ACN＝乙腈

CPME＝环戊基甲醚

d＝天

DCC＝N,N'-二环己基碳化二亚胺

DCM＝二氯甲烷或亚甲基氯

DIPE＝二异丙醚

DIPEA＝N,N-二异丙基乙胺

DMF＝N,N-二甲基甲酰胺

EDTA＝乙二胺四乙酸

EtOH＝乙醇

EtOAc＝乙酸乙酯

g＝克

h＝小时

H₂＝氢气

H₂O₂＝过氧化氢

HCTU＝2-(6-氯-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(V)

HATU＝N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐

HCl＝氯化氢

NaBH₄＝硼氢化钠

NaCl＝氯化钠

NaHCO₃＝碳酸氢钠

Na₂CO_3＝碳酸钠

NaHMDS＝双(三甲基硅烷基)氨基钠或六甲基二硅烷氨基钠

NaOH＝氢氧化钠

Na₂SO₄＝硫酸钠

NH₄Cl＝氯化铵

NMM＝N-甲基吗啉

MeI＝甲基碘

MeOH＝甲醇

min＝分钟

MgSO₄＝硫酸镁

Pd(PPh₃)₄＝四(三苯基膦)钯(0)

Pd/C＝钯/活性碳，10％负载

PE＝石油醚

SiO₂＝二氧化硅(silicon dioxide或silica)

TFA＝三氟乙酸

THF＝四氢呋喃

除非另外提和，否则所有材料(如试剂、起始材料和溶剂)均购自商业供货商(如西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)、弗卢卡瑞戴尔-哈恩(Fluka Riedel-de )等)，并且不经进一步纯化即使用。

除非另外提和，否则反应在氮气气氛下进行。通过薄层色谱(TLC)、分析型高效液相色谱(anal.HPLC)和质谱分析监测反应进程，其细节在特定实例中给出。代表性分析型HPLC条件如下：

A.分析型HPLC条件-方法A

B.分析型HPLC条件-方法B

如例如在各制备中特别描述来处理反应物；通常通过萃取和其它纯化方法(如温度依赖性和溶剂依赖性结晶和沉淀)来纯化反应混合物。另外，通过制备型HPLC通常使用Microsorb C18和Microsorb BDS柱填充物和常规洗脱剂来常规纯化反应混合物。通常通过液相色谱质谱(LCMS)来测量反应进程。通过核奥氏效应光谱法(Nuclear Overhausereffect spectroscopy，NOE)进行异构体表征。通过质谱和¹H-NMR光谱法常规进行反应产物的表征。为进行NMR测量，将样品溶解于氘化溶剂(CD₃OD、CDCl₃或DMSO-d₆)中，并且在标准观察条件下用Varian Gemini 2000仪器(400 MHz)获得¹H-NMR光谱。通常用应用生物系统公司(Applied Biosystems)(加利福尼亚州福斯特城(Foster City,CA))API 150EX型仪器或安捷伦(加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto,CA))1200LC/MSD型仪器使用电喷雾电离法(ESMS)来进行化合物的质谱鉴别。

测量技术

粉末X射线衍射

使用布鲁克D8高级(Bruker D8-Advance)X射线衍射仪来进行粉末X射线衍射分析。X射线源为Cu-Kα辐射，其中输出电压为40kV并且电流为40mA。所述仪器以布拉格-布伦塔诺(Bragg-Brentano)几何模式操作并且使用格贝尔(Goebel)镜获得平行X射线束。射束的任何发散由源中的0.2°垂直发散狭缝和源和检测器中的索勒狭缝(Soller slit)(2.5°)限制。为进行测量，将少量粉末(5-25mg)轻轻压于零背景硅样品固持器上以形成平滑表面并且进行X射线曝露。以偶合的θ-2θ模式以2°至35°的2θ扫描样品，其中步长为0.02°并且扫描速度为每步0.3秒。通过布鲁克DiffracSuite软件控制数据采集并且通过Jade软件(7.5.1版)分析。用刚玉标准物在±0.02°2θ角内校准仪器。

应记住数据收集中所用的布拉格-布伦塔诺几何模式易于进行优选定向。在这些条件下，衍射峰的相对强度可能不代表获自球形粒子的理想化分布或自单一晶体数据仿真的衍射图案的真实相对强度。也可能一些峰在一些衍射图案中由于大量优选定向而不可见。

差示扫描热量测定

使用具有热分析仪(Thermal Analyst)控制器的TA仪器(TA Instruments)Q-100型模块进行DSC测量。收集数据并且使用TA仪器Universal分析软件分析。将样品精确称量于经覆盖铝盘中。在5℃下进行5分钟等温平衡阶段后，使用10℃/分钟的线性加热匀变从0℃加热样品至250℃。

热重分析

使用具有高分辨能力的TA仪器Q-500型模块进行热重测量。使用TA仪器热分析仪(Thermal Analyst)控制器收集数据并且使用TA仪器Universal分析软件分析。将称量的样品置于铂盘上并且以10℃/min的加热速率从环境温度至300℃扫描。在使用期间用氮气流吹扫其余部分和熔炉室。

偏光显微术

为进行偏光显微镜(PLM)研究，在具有正交偏光过滤器的光学显微镜(奥林巴斯(Olympus)BX51)下检验样品。用由PaxIt成像软件(6.4版)控制的PaxCam摄影机收集图像。于玻璃盖玻片上使用轻质矿物油作为浸渍介质制备样品。取决于粒子尺寸，将4×、10×或20×物镜用于放大。

动态湿气吸附评定

使用VTI大气压微量天平SGA-100系统(佛罗里达州海厄利亚的VTI公司(VTICorp.,Hialeah,FL)33016)进行DMS测量。使用称量的样品并且在开始分析时湿度为最低可能值(接近0％相对湿度)。在5-90％的整个湿度范围中，DMS分析由5％相对湿度/步的扫描速率组成。DMS操作在25℃下以等温方式进行。

合成反应流程

本发明中所用的(3S,5R)-5-[[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]甲基]-3-(羟基甲基)-3-甲基吡咯烷-2-酮(A)可由起始物质和试剂使用实例1中所述并且如流程A中所示的程序制备：

流程A

流程A中的通用反应步骤如下。化合物1的氨基首先通过如下方法保护：在碱水溶液存在下，在惰性气氛下，在低温下，将1溶解于溶剂中，继而在室温下在溶剂中添加胺保护剂，随后分离。可使用1比碱比胺保护剂约1:2:1的摩尔当量。可用于1与胺保护剂的反应的溶剂包括(但不限于)极性非质子性溶剂，如乙腈。碱包括(但不限于)强碱，包含LiOH、NaOH和KOH。低温通常处于-10℃下或低于-10℃。

随后，在溶剂中，在添加两性化合物(例如NaHCO₃水溶液)和催化剂(如Pd(PPh₃)₄)下，在惰性气氛下，使化合物2与3偶合。这得到衍生物4，随后在非质子性溶剂中，在亲核性催化剂存在下，在惰性气氛下，使其与5反应。进一步使用肽偶合剂形成化合物6。随后在弱酸存在下，在惰性气氛下，将化合物6置于溶剂中，并且在低温(处于-5℃下或低于-5℃)下添加还原剂。使这一混合物搅拌数小时，随后用盐水淬灭。随后通过用弱碱溶液萃取分离化合物7，并且用干燥剂干燥，随后在真空下浓缩。

随后在非质子性溶剂中，在弱碱存在下，使用甲基化剂(如MeI)甲基化化合物7。分离所形成的固体并且进一步溶解于溶剂中，随后用干燥剂干燥并且在真空下浓缩，得到化合物8。在醚溶剂中使化合物8进一步与酸反应，得到化合物9，随后浓缩并且用另一溶剂洗涤，得到化合物9'。随后将化合物9'放置在惰性气氛下极性非质子溶剂中并且在低温(<-5℃)下与10反应，得到中间物11。通过使11与有机碱反应继而在低温下与10反应并且用还原剂还原形成化合物A。

本发明中所用的(2S,4R)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸苯甲酯(B)可由先前制备的起始物质(A)和试剂使用实例2中所述并且如流程B中所示的程序制备：

流程B

流程B中的通用反应步骤如下。首先在含有酸的溶剂中使化合物A与3,4-二氢-2H-吡喃反应，随后中和并且分离。将所得粗混合物置于醚溶剂中并且在低温下搅拌，形成浆液。进一步冲洗浆液，干燥并且浓缩，得到粘稠油12，随后用二碳酸二叔丁酯保护环氮，在标准条件下形成13。进一步用强酸裂解13中的醚基，形成如14中所示的醇基。随后通过在惰性气氛中添加杂环有机配体(例如1,10-啡啉)继而添加金属催化剂(例如钯催化剂)使化合物14与乙基乙烯基醚反应。使用例如H₂和10％Pd/C还原纯化产物15中的烯烃基团，得到16。用碱水溶液完成16中吡咯烷酮的开环(皂化)，随后纯化并且分离，得到化合物17。进一步例如在标准条件下用苯甲基溴保护17中的羧酸酯基，形成18。之后，去除18的氨基的保护基，形成化合物B。

如上所述，以下实例1和实例2中分别描述流程A和B的示范性反应条件。

实例1

合成(3S,5R)-5-[[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]甲基]-3-(羟基甲基)-3-甲基吡咯烷-2-酮(A)

步骤A-1：

将(2R)-2-氨基-3-(4-溴苯基)丙酸(1)(3300g，13.52mol)于乙腈(46.2L)中的溶液置于250L用惰性氮气气氛吹扫并且维持的反应器中。在-10℃下分数批添加NaOH(1081g，27.02mol)于水(46.2L)中的溶液。继而添加二碳酸二叔丁酯(2948g，13.51mol)于ACN(6.6L)中的溶液。在室温下搅拌所得溶液隔夜并且进一步在真空下浓缩。用45L水/冰稀释这一所得溶液并且用1N HCl调节溶液的pH值至pH 2。随后用3×50L DCM萃取所得溶液并且合并有机层。用1×50L盐水洗涤所得混合物，经无水MgSO₄干燥并且在真空下浓缩。这产生3720g(80％)呈白色固体状的(2R)-3-(4-溴苯基)-2-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]丙酸(2)。

步骤A-2：

将(2R)-3-(4-溴苯基)-2-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]丙酸(2)(530g，1.54mol)于二恶烷(9.54L)中的溶液、(5-氯-2-氟苯基)硼酸(3)(348g，2.00mol)、Na₂CO₃(228g，2.15mol)于水(1.06L)中的溶液和Pd(PPh₃)₄(8.89g，7.69mmol)的溶液放置于20L用惰性氮气气氛吹扫并且维持的4颈圆底烧瓶中。于油浴中加热所得溶液至回流后维持2.5小时，随后用水/冰浴冷却至室温。用15L EtOAc稀释所得溶液并且用1×5L 1N HCl和4×5L盐水洗涤。经无水MgSO₄干燥经合并的有机萃取物并且在真空下浓缩。用2×1L PE洗涤残余物。这产生510g(84％)呈棕色油状的(2R)-2-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]丙酸(4)。

步骤A-3：

将(2R)-2-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]丙酸(4)(510g，1.29mol)于DCM(5000mL)中的溶液、2,2-二甲基-1,3-二恶烷-4,6-二酮(5)(205g，1.42mol)和4-二甲基氨基吡啶(237g，1.94mol)的溶液放置于10L用惰性氮气气氛吹扫并且维持的4颈圆底烧瓶中。继而在-10℃下在搅拌下逐滴添加DCC(294g，1.43mol)于DCM(600mL)中的溶液。在室温下搅拌所得溶液隔夜并且通过过滤除去固体。用1N HCl(2L)和盐水(3L)洗涤滤液。经无水MgSO₄干燥经合并的有机萃取物并且通过过滤除去固体。滤液N-[(2R)-3-[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]-1-(2,2-二甲基-4,6-二氧代-1,3-二恶烷-5-基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯(6)不经进一步纯化即直接用于下一步骤中。

步骤A-4：

将N-[(2R)-3-[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]-1-(2,2-二甲基-4,6-二氧代-1,3-二恶烷-5-基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯(6)于DCM(7L)和AcOH(600mL)中的溶液放置于20L用惰性氮气气氛吹扫并且维持的4颈圆底烧瓶中。继而在-5℃下分数批添加NaBH₄(88.8g，2.35mol)。在-5℃下于冰/盐浴中搅拌所得溶液3小时，随后通过逐滴方式添加1L盐水淬灭。用2L盐水稀释所得溶液并且用2×2L水和1×1L Na₂CO₃和1×2L盐水洗涤。经无水MgSO₄干燥经合并的有机萃取物并且在真空下浓缩。这得到520g(79％)呈黄色油状的N-[(2S)-1-[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]-3-(2,2-二甲基-4,6-二氧代-1,3-二恶烷-5-基)丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯(7)。

步骤A-5：

将N-[(2S)-1-[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]-3-(2,2-二甲基-4,6-二氧代-1,3-二恶烷-5-基)丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯(7)(520g，1.03mol)于丙酮/DMF(1:1)(5.2L)中的溶液、Na₂CO₃(163g，1.54mol)和MeI(219g，1.54mol)的溶液放置于10L用惰性氮气气氛吹扫并且维持的4颈圆底烧瓶中。在室温下搅拌所得溶液隔夜，随后用15L水稀释。搅拌1小时后，通过过滤收集固体。将残余物溶解于5L DCM中。经无水MgSO₄干燥经合并的有机萃取物并且在真空下浓缩。这得到520g(97％)呈黄色固体状的N-[(2R)-1-[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]-3-(2,2,5-三甲基-4,6-二氧代-1,3-二恶烷-5-基)丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯(8)。

步骤A-6和A-7：

将N-[(2R)-1-[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]-3-(2,2,5-三甲基-4,6-二氧代-1,3-二恶烷-5-基)丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯(8)(520g，1.00mol，1.00当量)于CPME(2.6L)中的溶液放置于10L用惰性氮气气氛吹扫并且维持的4颈圆底烧瓶中。继而在-5℃下添加HCl/CPME(4N)(2.6L)。在室温下搅拌所得溶液隔夜。在真空下浓缩所得混合物至体积的一半。通过过滤收集固体，并且进一步用EtOAc/DIPE(1:2)洗涤。这得到呈灰白色固体状的220g(61％)(3R,5R)-5-[[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]甲基]-3-甲基-2-氧代吡咯烷-3-甲酸(9')。

步骤A-8和A-9：

将(3R,5R)-5-[[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]甲基]-3-甲基-2-氧代吡咯烷-3-甲酸(9')(218g，602.55mmol)于THF(4L)中的溶液、NMM(170g，1.68mol)的溶液放置于10L用惰性氮气气氛吹扫并且维持的4颈圆底烧瓶中。继而在-5℃下在搅拌下逐滴添加氯甲酸2-甲基丙酯(164.4g，1.20mol)。在-5℃下在冰/盐浴中再搅拌所得溶液20分钟。在-5℃下在搅拌下进一步逐滴添加NaBH₄(91.5g，2.42mol)于水(400mL)中的溶液并且再在室温下搅拌1小时。随后通过逐滴添加2.6L 1N HCl淬灭反应物。再搅拌所得混合物1小时，随后在真空下浓缩以除去THF。随后再搅拌残余混合物1小时，接着通过过滤收集固体。用水洗涤固体，溶解于THF中，经无水Na₂SO₄干燥并且在真空下浓缩。这得到170g(81％)呈白色固体状的(3S,5R)-5-[[4-(5-氯-2-氟苯基)苯基]甲基]-3-(羟基甲基)-3-甲基吡咯烷-2-酮(A)。

实例2

合成(2S,4R)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸苯甲酯(B)

步骤B-1：

在5000mL有夹套的圆底烧瓶中添加(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-(羟基甲基)-3-甲基吡咯烷-2-酮(A)(121.0g，348mmol)和DCM(2420mL)，得到均匀透明溶液，随后在搅拌下冷却至0℃。添加3,4-二氢-2H-吡喃(71.0ml，783mmol)和4-甲基苯磺酸(20.97g，122mmol)并且在18.5℃下搅拌反应混合物隔夜，实现>98％转化。随后用2420mL饱和NaHCO₃淬灭反应混合物，缓慢分离各相，经硫酸钠干燥有机层，过滤并且除去溶剂。随后将粗混合物置于DIPE(1815mL)中，同时在21℃下搅拌1小时，随后冷却并且在0-5℃下搅拌5小时，得到白色浆液。过滤浆液并且用1倍体积的冷(0℃)DIPE冲洗并且过滤。干燥所得固体隔夜，得到113.8g；99.1％HPLC纯度。进一步干燥滤液，得到重量为24g的浓稠油状物。添加DIPE(96mL)并且在0-5℃下搅拌混合物隔夜，得到(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-甲基-3-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)吡咯烷-2-酮(12)。

步骤B-2：

在5000mL有夹套的圆底烧瓶中，在搅拌下添加(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-甲基-3-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)吡咯烷-2-酮(12)(113.8g，263mmol)和THF(1707mL)，得到透明均匀溶液，用氮气吹扫并且冷却至-10℃。在低于0℃的温度下逐滴添加1M NaHMDS的THF溶液(290mL，290mmol)并且搅拌反应混合物30分钟。通过在低于10℃的温度下逐滴添加于3倍体积的THF(207mL)中溶解二碳酸二叔丁酯(69.0g，316mmol)。在20℃下搅拌反应混合物隔夜并且用20％氯化铵溶液(2731mL)淬灭。添加EtOAc(1821mL)并且将各相分离成水层(pH 9)和有机层。用盐水(2731mL)洗涤有机层并且将各相再次分离成水相(pH 7)和有机层，其中用Na₂SO₄干燥有机层，随后过滤。除去溶剂，得到浓稠油状物。进一步干燥隔夜后，产生(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-甲基-2-氧代-3-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(13)的含泡沫固体(146.5g，275mmol，105％产率，98.76％纯度)。

步骤B-3：

将(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-甲基-2-氧代-3-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(13)(146.5g，275mmol)和MeOH(1465mL)添加到3000mL圆底烧瓶中。进一步添加4-甲基苯磺酸,H₂O(3.93g，20.65mmol)，并且在0℃下搅拌反应混合物16小时，获得>97％转化。向完成的反应物中添加EtOAc(2930mL)，继而在低于30℃的浴温下蒸馏，以使总体积减至约293mL。向经浓缩溶液中再次添加EtOAc(2930mL)并且蒸馏至约293mL。通过添加EtOAc(2930mL)完成最终洗涤并且蒸馏至1465mL的最终体积以完全除去任何残余甲醇。通过用含有10％NaHCO₃的EtOAc(1465mL)洗涤以上最终体积(1465mL)，同时于≤21℃的温度下搅拌30分钟淬灭剩余酸。通过关闭搅拌使各层分离(水层pH～7)。用1465mL盐水洗涤有机层并且使其分离(水层pH＝7)。随后真空干燥乙酸乙酯层，得到约146.5mL，随后缓慢添加1465mL己烷至浊点。使溶液静置1小时，继而添加1465mL己烷。在0℃下搅拌混合物隔夜，过滤固体并且用293mL己烷洗涤。在高真空下干燥剩余固体隔夜，得到98.4g(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-(羟基甲基)-3-甲基-2-氧代吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(14)；80％产率；99.3％HPLC纯度。

步骤B-4：

将(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-(羟基甲基)-3-甲基-2-氧代吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(14)(118.2g，264mmol)和DCM(591mL)添加到100mL圆底烧瓶中，形成无色溶液。将乙基乙烯基醚(761mL，7916mmol)和1,10-啡啉(4.76g，26.4mmol)添加到容器中并且用N₂吹扫，继而添加乙酸Pd(II)(8.89g，39.6mmol)。在室温下搅拌反应混合物20小时以获得约81％转化。通过旋转蒸发除去溶剂，得到粗产物，通过管柱色谱纯化。用100％己烷预调节管柱，将粗产物(30g/操作)溶解于DCM中并且装载于300g硅胶填充管柱上。使用40％乙酸乙酯/己烷的等度梯度洗脱化合物，得到91.25g经纯化(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-甲基-2-氧代-3-((乙烯氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(15)。

步骤B-5：

将(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-甲基-2-氧代-3-((乙烯氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(15)(185g，390mmol)溶解于THF(1900mL)中，并且添加乙酸(11.17mL)，通过N₂吹扫10分钟。随后将混合物用H₂鼓泡并且添加10％Pd/C(或18.5g)。在22℃下持续缓慢吹扫H₂(气体)隔夜，直到如通过HPLC测量反应实现完成为止。经由硅藻土过滤反应混合物，得到均匀溶液。随后在高真空下泵送滤液至干燥，得到185克(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-(乙氧基甲基)-3-甲基-2-氧代吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(16)；89％HPLC；99％产率。

步骤B-6：

将(3S,5R)-5-((5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)甲基)-3-(乙氧基甲基)-3-甲基-2-氧代吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(16)(185g，389mmol)和约1205mL THF添加于3000mL圆底烧瓶中，得到无色溶液。添加约1205mL 1M LiOH的H₂O溶液并且在室温下搅拌反应混合物隔夜以完成皂化。将约1205mL EtOAc添加到隔夜反应混合物(pH＝13)中，随后用约1205mL饱和NH₄Cl水溶液洗涤。将各相分离成水相(pH＝8)和有机相，其中产物保留在有机层中。随后用盐水洗涤有机层，再次分离各层并且经Na₂SO₄干燥有机层，随后过滤并且真空干燥，得到(2S,4R)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸锂(17)(213g，426mmol，94.6％产率)。

步骤B-7：

将(2S,4R)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸锂(17)(194.0g，393mmol)和约650mL DMF添加到2L圆底烧瓶中，得到无色溶液。添加K₂CO₃(81g，589mmol)并且在室温下搅拌反应混合物15分钟。随后整份添加苯甲溴(56.1mL，471mmol)并且在约22℃下搅拌反应混合物隔夜。20小时后，如通过LCMS或TLC所测量，完成完全转化。添加约3900mL NH₄Cl和约650mL EtOAc并且搅拌15分钟，并且分离各相。用约3900mL盐水洗涤有机层，再次分离各层，并且经硫酸钠干燥有机层，继而除去溶剂。在SiO₂ 0-25％EtOAc/己烷上纯化粗产物，并且经合并的经纯化洗脱份得到(2S,4R)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸苯甲酯(18)(190g，322mmol，82％产率)。MS m/z{M+H]⁺C₃₃H₃₉ClFNO₅的计算值584.118；实验值584.12。

步骤B-8：

将(2S,4R)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸苯甲酯(18)馈入3L圆底烧瓶中(190.0g，325mmol)。添加3M HCl的CPME溶液(1084mL，3253mmol)并且在室温下搅拌反应混合物50小时，以>99％的转化率得到浆液。添加约1084mL新鲜CPME并且搅拌所得浆液3小时，随后过滤。用约250mL冷(0℃)CPME冲洗固体。随后在N₂气体下干燥固体，得到白色固体(2S,4R)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸苯甲酯(B),HCl(150g，288mmol，89％产率，99.5％纯度)。MS m/z{M+H]⁺C₂₈H₃₁ClFNO₃的计算值484.00；实验值520.46(HCl盐)。

实例3：

(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(化合物I)

步骤1：

使用HCTU(2.71kg，6551mmol)和DIPEA(0.28kg，2180mmol)于THF(26.64kg)中的溶液使(2S,4R)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸苯甲酯盐酸盐(B)(2.95kg，5668mmol)与3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异恶唑-5-甲酸(19)(1.48kg，5939mmol)偶合。将混合物冷却至<10℃。随后在低于10℃的温度下将DIPEA(2.24kg，17.332mmol)添加到混合物中，将混合物调节至20℃±10℃的温度并且搅拌至少1小时直到完成为止。随后向混合物添加EtOAc(26.55kg)，继而在低于30℃的温度下添加USP水(29.5kg)。随后在20℃±10℃的温度下搅拌混合物至少30分钟并且使其沉降至少30分钟。将下部水层分离至容器中。在低于30℃的温度下将5w/w％NaHCO₃溶液(30.4kg)添加到混合物中，进一步在20℃±10℃的温度下搅拌至少30分钟并且沉降至少30分钟。将下部水层分离至容器中。再重复NaHCO₃步骤两次，随后将混合物采样以用于测定6-氯-1-羟基苯并三唑含量。在低于30℃的温度下将10w/v％NaCl(31.6kg)溶液添加到混合物中，在20℃±10℃的温度下搅拌至少30分钟，随后沉降至少30分钟。将下部水层分离至容器中。将剩余层蒸馏至约9L，同时将批料温度维持在低于30℃。随后将EtOAc(39.8kg)添加到混合物中并且使用真空蒸馏将混合物的体积降至约9L，同时将批料温度维持在低于30℃。再次将EtOAc(10.3kg)添加到混合物中并且搅拌混合物至少10分钟。随后将第一反应容器中的混合物经由在线过滤器转移至第二反应容器。使用EtOAc(5.6kg)冲洗第一反应容器并且经由在线过滤器转移至第二反应容器。将反应容器二中的产物(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸苯甲酯(20)(4.05kg；5663mmol)混合至少10分钟并且排入无菌奈尔津容器(Nalgenecontainer)中并且储存在0-10℃下直到进一步处理为止。

步骤2：

将Pd/C(10％w/w，0.42kg)与(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸苯甲酯(20)(4.05kg；5663mmol)一起馈入反应容器一中。随后将变性乙醇(27.5kg)添加到反应容器一中并且在20-30℃下混合组分至少5分钟。使用含有NaOH的洗涤器处理这一步骤期间释放的HCl气体。将6M HCl(3.1kg)添加到反应物中，同时维持<30℃的温度并且混合至少5分钟。通过施加真空并且同时供应氮气将混合物脱气。随后调节混合物的温度至20-30℃并且将反应容器抽空。使H₂(5.0超高纯度)鼓泡通过混合物直到反应完成为止。关闭氢气供应，用氮气吹扫混合物并且经由在线过滤器转移至第二反应容器。将变性乙醇(6.5kg)馈入第一反应容器中作为冲洗剂并且经由在线过滤器转移至第二反应容器。随后使用真空将第二反应容器中的混合物蒸馏至约41L，同时将温度维持在低于30℃。将温度调节至20-30℃并且将30％w/w H₂O₂溶液(0.36kg)添加到第二反应容器中的混合物中，同时将温度维持在<25℃。在20-30℃下搅拌混合物至少16小时直到反应完成为止。使用真空将第二反应容器中的混合物蒸馏至约12L，同时维持温度低于30℃。随后将ACN(40.1kg)添加到这一混合物中并且使用真空将混合物蒸馏至约12L，同时将温度维持在低于30℃(重复这一步骤)。随后，再次将ACN(3.2kg)添加到第二反应容器中的混合物中并且加热至40-50℃后维持至少1小时。经至少1.5小时冷却混合物至15-25℃并且再维持在所述温度下至少2小时，随后通过离心机过滤。随后将ACN(13.0kg)添加到第一反应容器中并且用于洗涤经离心的固体。随后在20-30℃下在真空下干燥经离心的固体至少16小时，得到(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(4,218mmol；2.13kg；74.5％产率；97.5％纯度)。

实例4：

结晶型(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(化合物I')的制备

步骤3：

将化合物I(2.0kg；3961mmol)、EtOAc(36.0kg)和USP水(20kg)添加到反应容器A中并且在20±10℃下搅拌所得混合物至少30分钟。随后将批料再沉降至少30分钟。分离下部水层并且储存于容器中，同时将剩余非水相经由在线过滤器转移至反应容器B。将EtOAc(3.6kg)添加到反应容器A中以进行冲洗并且经由在线过滤器转移至反应容器B中的混合物中。随后将反应容器B中的混合物真空蒸馏至减少的体积(6L)。将额外量的EtOAc(25.2kg)添加到反应容器A中并且经由在线过滤器转移至反应容器B中的混合物中。随后加热反应容器B中的混合物至75±5℃的温度并且搅拌至少5分钟直到固体溶解为止。随后经至少6小时将这一混合物冷却至-10±5℃，并且在-10±5℃下另外搅拌至少12小时，随后于过滤器C上过滤。将额外量的EtOAc(5.4kg)馈入反应容器A中，进一步经由在线过滤器转移至反应容器B中并且冷却至-10±10℃。随后使用这一溶剂洗涤过滤器C上的滤液。随后于容器中收集滤液和洗涤液。在40℃±10℃下在真空下干燥滤液或湿滤饼至少16小时，随后采样以获得纯度。如通过HPLC测量，化合物I'的纯度≥98.0％，并且如通过气相色谱法所测量，EtOAc以≤2.5w/w％存在。结晶后化合物I'的产量为(1.05kg；2079mmol；52.5％产率；98.5％纯度)。

实例5：

结晶型(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(化合物I')的替代性制备

将化合物I(4.9kg；9705mmol)、硫醇(1.62kg)和EtOH(200标准强度，54.9kg)添加到反应容器A中并且在约25℃至35℃的温度下搅拌所得混合物至少1小时。随后经由硅藻土过滤混合物并且用EtOH(200标准强度，7.8kg)洗涤，使用在线0.22μm过滤器转移至反应容器B并且用EtOH(200标准强度，7.8kg)冲洗。在约40℃至60℃的温度下将容器B中的混合物进一步真空蒸馏至其初始体积的约10％。将含有剩余混合物的容器调节至>50℃，随后添加经过滤(0.22μm)的USP纯化水(49kg)。随后在搅拌下将混合物加热至约75℃至85℃的温度，直到产物完全溶解为止。经至少4小时将混合物冷却至约-5℃至5℃的温度并且再在相同温度下搅拌至少16小时。随后过滤所得混合物并且用预先冷却的EtOH(200标准强度，9.8kg)与USP水(12.3kg)的混合物洗涤。将预先冷却的溶剂混合物的温度调节至约0℃至10℃。在约40℃至60℃的温度下在真空下干燥剩余滤液至少16小时，随后采样以通过HPLC测定溶剂和纯度。结晶后化合物I'的产率为90％(4.6kg；9110mmol；≥97.0％纯度)。

实例6：

结晶型(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异恶唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(I')的稳定性研究

医药开发的一个挑战与发现具有适当高熔点的药物的稳定结晶形式有关。本发明的一个挑战为难以获得具有上述有利物理特性的化合物I的游离酸的小晶体。实现后，小晶体在约216℃下熔融，并且在以下报告的温度和相对湿度(RH)％下进行化合物I'的加速稳定性研究。

RH＝相对湿度；nt＝未测试；LOQ＝定量限

^a加速储存条件，测量6个月并且一般认为等效于在25℃，60％相对湿度下2年。

^b分析＝(质量物质/总质量)*100＝％(w/w)。

这些数据展示化合物I'在25℃，60％RH下保持稳定持续至少18个月，并且通过40℃，75％RH的加速条件测量保持稳定持续至少2年。这些数据还展示在12个月未检测到可定量的量的水，因此指示晶体经所述时间段保持非吸湿性。另外，这些数据指示经18个月(25℃，60％RH)或2年(40℃，75％RH的加速条件)检测到不超过1％的总杂质/降解产物。

分析

分析1：大鼠、犬和猴中的静脉内/口服药物动力学研究

各大鼠、犬或猴PK研究以测试化合物的调配物开始。将适当质量的各测试化合物添加到一定量的媒剂(例如5％碳酸氢钠、5％右旋糖的H₂O溶液)中以使得各化合物的最终浓度适于给与。尽管均匀悬浮液为口服给药可接受，但静脉内给药溶液在给药之前经无菌过滤(0.2μm)以确保不给予粒子。

在大鼠研究中，从哈兰实验室(Harlan Laboratories)或查理河实验室(CharlesRivers Laboratories)获得预插管的雄性史泊格-多利大鼠(Sprague-Dawley rat)(每种途径3只)。使用注射器和管饲管使大鼠接受递送至胃中的口服剂量，或使大鼠接受给药溶液的静脉内(经由外侧尾部静脉)剂量。最终剂量为0.5mg/kg。经由植入颈静脉中的导管在给药后3分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时收集连续血液样品。手动或使用自动血液采样器进行采样。将样品收集于含有EDTA作为抗凝剂的微量采血管中并且通过冷冻离心加工成血浆。

在犬研究中，使圈养在安哲列克斯实验室(Agilux Laboratories)(马萨诸塞州伍斯特(Worcester,MA))并且体重为9-14kg的未处理雄性米格鲁犬(beagle dog)(每种途径3只)接受口服或静脉内剂量。使用注射器和管饲管将口服剂量递送至胃中，继而用约10mL的水冲洗。给予2mL/kg的体积的口服剂量。经由置于隐静脉中的经皮导管给予静脉内剂量，继而用约3mL生理食盐水冲洗。给予的静脉内剂量为0.5mL/kg的体积。静脉内或口服的最后剂量为0.1mg/kg。经由直接静脉穿刺在给药后3分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时收集连续血液样品。将所有样品手动收集于含有EDTA作为抗凝剂的微量采血管中并且通过冷冻离心加工成血浆。

用适当质量的化合物I于一定量的媒剂中的溶液(例如5％碳酸氢钠、5％右旋糖的H₂O溶液，pH 7.4(口服和静脉内)并且经由0.22μm PDVF注射器过滤(静脉内))执行猴PK研究，使得对于静脉内与口服剂量，最终浓度均以1.0mg/mL给与。

圈养在山莫曲斯(Xenometrics)(堪萨斯州斯蒂尔韦尔(Stilwell,KS))的雄性食蟹猕猴(每种途径3只)接受1或2mg/kg的静脉内或口服剂量的化合物I。经由头静脉中的留置导管给予静脉内剂量的化合物I，继而用约3mL的生理食盐水冲洗。给予1mL/kg的体积的静脉内剂量。使用注射器和管饲管将口服剂量递送至胃中，继而用约10mL水冲洗。给予2mL/kg的体积的口服剂量。在各时间点(给药前、0.083小时、0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时)经由头静脉、股静脉或隐静脉从各动物收集血液样品直到48小时。将所有样品收集于K₂EDTA管中并且放置在冰上。通过离心(3200rpm，10分钟，5℃)将样品加工成血浆，并且用2％最终浓度的乙酸酸化。将血浆的等分试样转移至96孔板管并且冷冻储存(-70℃)，随后进行生物分析。

化合物I的血浆浓度通过LC/MS/MS测定。将血浆研究样品涡旋并且置于96孔板中。用200μL含有内标的乙腈萃采样品。将萃取物在2809RPM下离心10分钟并且将50μL上清液与200μL 0.2％甲酸的水溶液混合。将样品(10-15μL)以0.35mL/min的流速注射在赛默飞世尔(ThermoFisher)海皮瑞提^TM(HyPURITY^TM)(C18 50×2.1mm)管柱上。移动相A由水:乙腈:甲酸(95:5:0.1，v:v:v)组成并且移动相B由甲醇:乙腈:甲酸(50:50:0.1，v:v:v)组成(犬)。移动相A由0.2％甲酸的水溶液组成，并且移动相B由0.2％甲酸的乙腈溶液组成(大鼠和猴)。化合物I的药物动力学参数通过使用Phoenix WinNonlin 6.3版(加利福尼亚桑尼维尔的赛他拉(Certara,Sunnyvale,CA))和使用来自每处理组3只动物的个别血浆浓度时间曲线进行非房室分析(对于静脉内和口服给药，分别为模型201和模型200)测定。

血浆清除率从研究的静脉内组测定，并且表示血浆清除药物的速率。其等于剂量除以血浆浓度时间曲线下面积。除血浆清除率以外，口服给予的药物在口服递送后达到有效全身性含量也必要。口服生物可用性为口服给予后的血浆暴露相对于静脉内给予后的暴露的度量。

药物动力学数据

^a AUC_最终为时间0至给药后观察到最后一个可定量浓度的时间的血浆浓度相对于时间曲线下面积，其通过线性梯形法估算

^b CL_最终为除以AUC_最终的剂量

^c口服生物可用性以口服给予后的AUC_最终除以静脉内给予后的AUC_最终计算，其对所给予剂量的任何差异进行标准化，表示为百分比形式。

这一大鼠数据展示化合物I在0.5mg/kg的剂量下具有约33％的口服生物可用性。在较高剂量(30-1000mg/kg)下，大鼠中的平均生物可用性在49-79％(数据未示出)范围内。化合物I还与阿奇沙坦(azilsartan)一起在大鼠物种中给予(数据未示出)。这一犬数据展示化合物I具有约17％的有限口服生物可用性。在较高剂量(100-300mg/kg)下，平均生物可用性在7-13％(数据未示出)范围内。猴数据展示化合物I的口服生物可用性为约42％。在较高剂量(30和100mg/kg)下，三种不同调配物的平均生物可用性在55-83％范围内(数据未示出)。

分析2：大鼠、犬和猴物种中化合物I的肾分泌

确保适当长期药物给与和患者中的适当稳态药物浓度的重要因素为药物清除率。一般来说，药物清除率降低产生较高药物浓度和较大药物作用。为了解化合物I的肾清除率，在三种动物物种中评定单次静脉内给药后尿中所回收的所给予剂量的百分比。在雄性史泊格多利大鼠、雄性米格鲁犬和雄性食蟹猕猴中分别进行三次独立研究并且程序和实验结果如下文所述。

体重为297至316g和294至311g的雄性史泊格多利大鼠(N＝6，两组，每组3只)接受0.5mg/kg(组I)和3.0mg/kg(组II)的化合物I的静脉内剂量作为给药盒的一部分。将化合物I以0.25mg/mL的浓度溶解于5％NaHCO₃的D5W(5％右旋糖的水溶液，pH7.8)溶液中，得到1.0mg/mL的最终总浓度以递送0.5mg/kg静脉内剂量。另外，将化合物I以1.5mg/mL的浓度溶解于5％NaHCO₃的D5W(5％右旋糖的水溶液，pH 7.4)溶液中以递送3mg/kg静脉内剂量。两种调配物在静脉内给予前均进行无菌过滤。在给予化合物I之前和之后，使大鼠根据其典型喂养方案获取食物。对于接受0.5mg/kg化合物I的群组，在干冰上收集尿。24小时尿收集期后，将尿样品融化，记录体积并且将样品混合，随后移出等分试样(～700μL)以供生物分析。对于接受3.0mg/kg化合物I的群组，如上所述收集尿，但将冰醋酸添加到所收集的尿等分试样中，得到2％乙酸的最终浓度。将所有样品在生物分析前冷冻储存(-70℃)。

通过LC/MS/MS测定化合物I的大鼠尿浓度。将尿样品融化并且用K₂EDTA大鼠血浆稀释5倍。将50μL经稀释尿的等分试样转移至96孔板中并且用200μL含有内标的乙腈萃取。将96孔板在2809RPM下离心10分钟并且用0.2％甲酸的水溶液五倍稀释转移至新96孔板中的上清液。用0.2％甲酸的水溶液稀释上清液。以0.30或0.35mL/min的流速将样品(10至15μL)注射于赛默海皮瑞提(Thermo Hypurity)(C18 50×2.1mm)管柱上。移动相A由0.2％甲酸的水溶液组成，并且移动相B由0.2％甲酸的乙腈溶液组成。化合物I分析范围为0.0125至25μg/mL(0.5mg/kg群组)和0.0058至25μg/mL(3.0mg/kg群组)。

体重为9.00-11.1kg和10.6-13.4kg的未处理雄性米格鲁犬(N＝6，两组，每组3只)接受0.1mg/kg(组I)和1.0mg/kg(组II)的化合物I的静脉内剂量作为给药盒的一部分。将化合物I以0.2mg/mL的浓度(用于以0.1mg/kg给药)或2mg/mL的浓度(用于以1mg/kg静脉内给药)溶解于PEG-200:乙醇:水(40:10:50)中并且在给予前无菌过滤。在给予化合物I之前和之后，使犬根据其典型喂养方案获取食物。将尿样品收集在预填充有冰醋酸的预称量容器中的湿冰或冷包上。再次称量样品并且如果需要再添加冰醋酸至2％的最终浓度。将样品在生物分析前冷冻并且储存(-80℃)。

通过LC/MS/MS测定化合物I的犬尿浓度。将尿研究样品(于K₂EDTA米格鲁犬血浆中稀释，Biochemed,Winchester,VA)融化并且涡旋并且将10或20μL置于96孔板中。用6倍体积的含内标金黄素或格列苯脲(glyburide)的乙腈(60或120μL)萃采样品。将萃取物在3000RPM下离心5分钟并且将约70％上清液(50或100μL)转移至新96孔板并且与等体积的水组合。将样品以0.8或0.9mL/min的流速注射于Mac Mod Ace C18(2.1×50mm，3μm)或WatersAcquity UPLC BEH C18(50×2.1mm，1.7μm)管柱上。移动相A由95:5:0.1(v:v:v)水:乙腈:甲酸组成并且移动相B由50:50:0.1(v:v:v)甲醇:乙腈:甲酸组成。尿中的化合物I分析范围为0.0002至1.00μg/mL。

体重为2.87-3.61kg的未处理雄性食蟹猕猴(N＝3)接受1mg/kg的化合物I的静脉内剂量。将化合物I溶解于5％NaHCO₃的D5W溶液(pH 7.4)中并且在给予前经由0.22μM聚二氟乙烯(PVDF)针筒过滤器(Millipore Millex-GV，SLGV033RB)过滤。在给药前一天制备调配物，储存在-70℃下隔夜并且在给药前融化。经由头静脉中的留置导管给予静脉内剂量的化合物I，继而用约3mL的生理食盐水冲洗。给予1mL/kg的体积的静脉内剂量。将尿样品收集在含有冰醋酸的管中的湿冰或冷包上以稳定任何可能葡萄糖苷酸结合物。以重量分析法估算总尿样品体积，获得等分试样并且在生物分析前冷冻(-70℃)。

通过LC/MS/MS测定化合物I的猴尿浓度。将尿样品融化并且用K₂EDTA猴血浆(Bioreclamation,Westbury,NY)5倍稀释。将样品涡旋并且将50μL转移至96孔板。随后用200μL含内标的乙腈萃采样品。将萃取物在2809RPM下离心10分钟并且将50μL上清液添加到200μL 0.2％甲酸的水溶液中。将样品(10-15μL)以0.35mL/min的流速注射于赛默飞世尔的海皮瑞提^TM(C18 50×2.1mm)管柱上。移动相A由0.2％甲酸的水溶液组成并且移动相B由0.2％甲酸的乙腈溶液组成。化合物I分析范围为0.00125至5μg/mL。

平均量的尿经24小时的收集期分泌并且尿中所分泌的给予剂量的大致百分比报告于下表中。

^a三个测定值的平均值

^b标准偏差

大鼠中化合物I的肾分泌少于给予剂量的0.02％或少于0.03％，犬中少于给予剂量的0.02％或少于0.001％，并且在猴中为给予剂量的约0.670％±0.593％。这些数据指示化合物I在所测试的三个物种中具有低肾分泌。

分析3：1期单次递增剂量研究

进行化合物I'(形式I)(其在体内转化为其可溶形式化合物I或溶解提供其可溶形式化合物I)的1期单次递增剂量(SAD)临床试验来评定脑啡肽酶抑制以治疗一系列心血管和肾病，包括例如慢性肾病、糖尿病性肾病、急性和慢性心脏衰竭、具有降低的射血分数的心脏衰竭、具有保留的射血分数的心脏衰竭、心肌梗塞后无症状左心室功能障碍(MI后无症状LVD)、亚急性心脏衰竭和抗性和独立性收缩性高血压。测试安全性和耐受性、药物动力学(支持QD/BID给药和非肾分泌)、药效动力学(测试标靶接合生物标记物cGMP和ANP)、食物影响和使用尤其¹⁴C静脉内微型追踪器测试绝对口服生物可用性和肾消除。

1期研究为以4:1比率随机分组的健康男性和女性志愿者中的双盲式随机安慰剂对照单次递增剂量研究。研究经多周招收56名健康志愿者以进行递增剂量部分，其包括给予50mg、100mg、200mg、400mg和600mg的单次递增剂量的群组(每个群组n＝10，8名用活性剂，并且2名用安慰剂)。静脉内分别给予第六群组(n＝6)微型追踪器和10μg和100mg的口服剂量。SAD临床试验数据部分展现在高达600mg的单次剂量后化合物I充分耐受。

分析3.1：在人类中的NEP活性(cGMP)

这一研究的一个目标为确定化合物I在于人类中给与后作用的机制/持续时间。为此，在用化合物I'给药后测量cGMP(脑啡肽酶标靶接合的生物标记物)的含量以提供化合物I的生物学作用的证据。举例来说，给药后24小时血浆cGMP含量增加指示药理学作用的持续时间，类似于血浆清除率值展示药物动力学持久性。

图6说明在测试剂量下平均血浆cGMP相对于时间从基线起的变化(nM)。这一数据展现化合物I在单次剂量后经24小时提供平均血浆cGMP的持续增加，其中最大cGMP含量发生在8小时至24小时范围，其中8-12小时范围为最高cGMP含量。另外，血浆cGMP剂量反应在剂量范围下限(即≥100mg的剂量)展现接近最大作用(参见图7)。

分析3.2化合物I'在人类中的PK曲线、口服生物可用性和肾分泌

化合物I的药物动力学曲线与剂量呈比例(参见图8)并且经展示化合物I具有高口服生物可用性(约80％)。SAD临床试验的数据还表明低水平的肾消除，即如通过静脉内微型追踪器测试技术证实，少于总化合物I'给予剂量的1％经由肾消除。

有趣的是，PK曲线(例如化合物I的C_最大)和PD曲线(例如cGMP_最大)在不同时间范围内展现峰值。SAD临床试验的数据表明血浆cGMP含量的剂量相关性增加和血浆与尿中cGMP经24小时持续增加，从而支持使用化合物I或化合物I'进行每天一次给药。

分析3.3：与标准治疗的区别

当前，沙库必曲与缬沙坦组合使用经指示降低患有慢性心脏衰竭和射血分数降低的患者的心脏血管死亡风险和因心脏衰竭住院。沙库必曲(脑啡肽酶抑制剂)与化合物I的比较展现肾消除和24小时标靶接合的关键区别。举例来说，沙库必曲主要经由肾消除(60％肾消除)，而化合物I并非如此(<1％肾消除)(参见图9)。对于治疗有或无心脏病的肾受损患者来说，这可能很重要。另外，在给与沙库必曲后24小时，cGMP(即标靶接合)的含量不增加，而以化合物I'给药后cGMP的含量增加。这使得化合物I或化合物可每天给与一次，对于沙库必曲与缬沙坦组合并非如此，其为每天两次给药方案。

分析4：1期多次递增剂量研究

进行化合物I'(形式I)的1期多次递增剂量(MAD)临床试验以进一步评估化合物I和其代谢物的安全性、耐受性、药物动力学、化合物I的药效学、化合物I'的多次递增口服剂量在健康成年和老年受试者中的食物影响、绝对口服生物可用性和肾消除。如下文所论述，所报告数据证实源于SAD临床试验的结果。

1期研究为以4:1比率随机分组的健康男性和女性志愿者中的双盲式随机安慰剂对照多次递增剂量研究。研究经多周招收50名健康成年(19-55岁)和老年(65-80岁)志愿者以进行递增剂量部分，其包括给予如下剂量的群组(每个群组n＝10，8名用活性剂，并且2名用安慰剂)：(1)50mg、100mg和200mg的递增剂量，(2)与用于PK/PK研究的200mg并行研究的10mg的剂量，和(3)用于一个老年群组的100mg的剂量。MAD临床试验数据部分展现在达14天的多次口服剂量后化合物I大体上充分耐受。另外，化合物I的肾消除在多次给药后可忽略，例如对于所有受试者，在第1天和第14天观测到<1％。

分析4.1：人类中的NEP活性(cGMP)和与标准治疗的区别

MAD临床研究的部分为测定于人类中给药后化合物I作用的机制/持续时间。为此，在用化合物I'给药后测量cGMP(脑啡肽酶标靶接合的生物标记物)的含量以提供化合物I的生物学作用的证据。举例来说，给药后24小时血浆cGMP含量增加指示药理学作用的持续时间，类似于血浆清除率值展示药物动力学持久性。

图10说明在测试剂量下平均血浆cGMP相对于时间从基线起的变化(nM)。这数据展现化合物I提供平均血浆cGMP经24小时的持续增加。重要结果展示于图10中。这数据说明在临床研究的第14天，对于每日给与一次的化合物I'，在谷值(0小时)存在所有剂量的标靶接合，以及在长达24小时存在测量的所有剂量的标靶接合。将其与标准治疗相比，在标准治疗中用每天两次给药方案在谷值和24小时存在少量标靶接合乃至不存在标靶接合(参见顾(Gu)等人,临床药理学杂志(J.Clin.Pharmacol.),2010,第50卷,第4期,第401-414页中的第411页)。

虽然本发明已参考其特定方面或实施例进行描述，但所属领域的普通技术人员应了解，在不偏离本发明的真实精神和范围的情况下，可进行各种变化或可代入等效物。另外，在由适用的专利状况和规定允许的程度上，本文中所引用的所有公开、专利和专利申请以全文引用的方式并入本文中，所述引用的程度如同将各文件单独地以引用的方式并入本文中一般。

Claims (39)

1.一种(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异噁唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸的结晶游离酸形式(I')。

2.根据权利要求1所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过粉末x射线衍射图案表征，所述粉末x射线衍射图案在6.51±0.20、11.62±0.20、13.05±0.20、15.07±0.20和23.28±0.20的2θ值处包含衍射峰。

3.根据权利要求1所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过粉末x射线衍射图案表征，所述粉末x射线衍射图案在6.51±0.20、11.62±0.20、13.05±0.20、15.07±0.20、17.12±0.20、23.28±0.20和26.19±0.20的2θ值处包含衍射峰。

4.根据权利要求1所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过在选自6.51±0.20、11.62±0.20、13.05±0.20、15.07±0.20、15.72±0.20、17.12±0.20、20.79±0.20、21.10±0.20、23.28±0.20、24.48±0.20、25.81±0.20和26.19±0.20的2θ值处具有一个或多个其它衍射峰表征。

5.根据权利要求1所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过如下粉末x射线衍射图案表征，其中峰位置大体上符合图1中所示的图案的峰位置。

6.根据权利要求1所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过每分钟10℃的加热速率记录的差示扫描热量测定迹线表征，所述差示扫描热量测定迹线展示在约214℃至约218℃的温度下具有吸热热流的最大值。

7.根据权利要求1所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过大体上符合图2中所示的差示扫描热量测定迹线表征。

8.一种医药组合物，其包含根据权利要求1到7中任一权利要求所述的结晶形式和药学上可接受的载剂。

9.根据权利要求8所述的医药组合物，其中所述药学上可接受的载剂为硬脂酸镁。

10.一种医药组合物，其包含根据权利要求1至7中任一权利要求所述的结晶形式和AT₁受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂、肾素抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂、盐皮质素受体拮抗剂、利尿剂或其组合。

11.根据权利要求10所述的医药组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。

12.一种包含根据权利要求1至7中任一权利要求所述的结晶形式的口服剂型，其呈胶囊、片剂或悬浮液形式。

13.根据权利要求12所述的口服剂型，其中所述结晶形式在受试者中的释放为立即、控制或延迟释放。

14.根据权利要求12所述的口服剂型，其中所述胶囊材料为明胶、多醣、聚葡萄胺糖或合成聚合物。

15.根据权利要求12所述的口服剂型，其中硬胶囊包含明胶、多醣或合成聚合物。

16.根据权利要求12所述的口服剂型，其中所述胶囊包含羟基丙基甲基纤维素。

17.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的结晶形式，其用于疗法中。

18.根据权利要求17所述的结晶形式，其用于治疗高血压、心脏衰竭或肾病。

19.一种根据权利要求1至7中任一权利要求所述的化合物的用途，其用于制造用于治疗高血压、心脏衰竭或肾病的药剂。

20.一种用于治疗高血压、心脏衰竭或肾病的方法，所述方法包含每天一次给予患者(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异噁唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(I)，例如根据权利要求1至7中任一权利要求所述的化合物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中高血压为原发性高血压、肺动脉高血压、慢性血栓栓塞性肺高血压或具有肾动脉狭窄的高血压。

22.根据权利要求20所述的方法，其中肾病为糖尿病性肾病、慢性肾病、蛋白尿、急性肾脏损伤、肾病综合征、局灶节段性肾小球硬化或多囊性肾病。

23.一种治疗肾受损患者中的高血压、心脏衰竭或肾病的方法，所述方法包含每天一次给予所述患者治疗有效量的所述(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异噁唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(I)，例如根据权利要求1至7中任一权利要求所述的化合物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述肾受损患者患有慢性肾病，其肾小球滤过率估算值eGFR为60mL/min/1.73m²至15mL/min/1.73m²。

25.一种增加人类中的心房利钠肽ANP或环单磷酸鸟苷cGMP含量持续至少24小时的方法，所述方法包含每天一次给予所述人类增加ANP或cGMP量的(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异噁唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(I)，例如根据权利要求1至7中任一权利要求所述的化合物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中在所述人类中的尿液或血浆或这两者中测量ANP及cGMP的含量。

27.根据权利要求20、23或25中任一权利要求所述的方法，其中非经肠给予(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异噁唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(I)，例如根据权利要求1至7中任一权利要求所述的化合物。

28.一种制备(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异噁唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(I)的方法，所述方法包含：

(a)在溶剂中使(2S,4R)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸苯甲酯盐酸盐与3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异噁唑-5-甲酸以约1:1摩尔比偶合，得到(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异噁唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸苯甲酯；和

(b)去除(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异噁唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸苯甲酯的保护基，形成(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异噁唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸(I)。

29.根据权利要求28所述的方法，其中步骤(a)进一步包含肽偶合剂和碱，其中偶合剂比碱比(2S,4R)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-2-甲基戊酸苯甲酯盐酸盐比3-((4-甲氧基苯甲基)氧基)异噁唑-5-甲酸的摩尔比为约1:3:1:1。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述偶合剂为2-(6-氯-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(V)并且所述碱为N,N-二异丙基乙基胺。

31.根据权利要求28所述的方法，其中去除保护基的所述步骤(b)用钯催化剂和氢气执行。

32.一种制备根据权利要求1所述的结晶形式的方法，所述方法包含：

(a)在高温下形成包含(2S,4R)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-2-(乙氧基甲基)-4-(3-羟基异噁唑-5-甲酰氨基)-2-甲基戊酸和溶剂并且任选地含有金属清除剂的溶液；

(b)将所述溶液冷却至约-20℃至5℃的温度；和

(c)分离所得固体，得到所述结晶形式。

33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(a)中所述溶剂为极性溶剂。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述溶剂为乙酸乙酯与水的混合物、乙酸乙酯或乙醇。

35.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(a)中的所述温度为约60℃至95℃。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述温度为约70℃至85℃。

37.根据权利要求29所述的方法，其中在步骤(c)中分离所述固体包括过滤、用一种或多种溶剂洗涤、在空气中或在真空下干燥或这些步骤的组合。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述溶剂为乙酸乙酯和水、乙酸乙酯或乙醇。

39.根据权利要求37所述的方法，其中在真空下干燥是在25℃至70℃的温度下执行。