CN108743598A - 土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用 - Google Patents

土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108743598A
CN108743598A CN201810660260.XA CN201810660260A CN108743598A CN 108743598 A CN108743598 A CN 108743598A CN 201810660260 A CN201810660260 A CN 201810660260A CN 108743598 A CN108743598 A CN 108743598A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
derivant
tobeimosides
glucosides
glucosides tobeimosides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810660260.XA
Other languages
English (en)
Inventor
孙学刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University
Original Assignee
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University filed Critical Southern Medical University
Priority to CN201810660260.XA priority Critical patent/CN108743598A/zh
Publication of CN108743598A publication Critical patent/CN108743598A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用。本发明发现土贝母皂苷甲可诱导癌细胞发生巨胞饮作用，从而抑制癌细胞生长。并进一步通过动物实验发现巨胞饮作用的诱导剂土贝母苷甲和5‑氟尿嘧啶5‑Fu联合应用比单独使用抑制肿瘤的效果更好。本发明细胞发生巨胞饮作用的诱导剂是研究巨胞饮作用的优秀工具药，土贝母苷甲具有促进肿瘤细胞通过巨胞饮作用吸收化疗药的作用，具备成为化疗辅助药的潜力。

Description

土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种巨胞饮作用的诱导剂。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一。2017年美国癌症预测数据显示，男性CRC新增病例和死亡人数分别为71420例和27150 例，各占癌症新发病例和死亡病例的9％；女性CRC新增病例和死亡人数分别为64010例和23110例，各占癌症新发病例和死亡病例的8％，是男性和女性第三常见的癌症。2016年最新统计表明：我国结直肠癌连续位居恶性肿瘤发病率第5位和死亡率第5位。结直肠癌早期以手术治疗为首选，但由于其发病隐匿，待患者确诊时已属中晚期，已不合适手术。放化疗可以降低复发，提高临床疗效，但长期放化疗在杀死肿瘤细胞的同时也损伤了正常的细胞，并大大提高了肿瘤组织对放化疗的抵抗作用。药物辅助治疗为结肠癌患者延长生命、提高生活质量发挥着重要作用。中草药因为历史悠久，毒副作用相对较小，作用原理独特，效果明显，正在成为抗癌新药研究与开发的对象。在结肠癌患病率逐年增高的情形下，能从中草药中研究出治疗结肠癌的高效、低毒的天然药物，具有重要的科学价值和临床意义。
土贝母Bolbostemma paniculatum(Maxim)Franquet为葫芦科植物，主要分布在河南、河北、山东、山西、陕西、甘肃、云南等地。药用部位为其干燥块茎，性味苦，微寒，归肺、脾经，有散结、消肿、解毒之功能，其主要成分为皂苷类 (土贝母苷甲、乙、丙、丁、戊)等。药理研究显示，土贝母皂苷具有抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制、抗炎、杀精子、对抗蛇毒、溶血等药理活性，对多种癌症、肝炎、各种疣症均有显著疗效，例如《土贝母的化学成分及药理作用研究进展》 (孙健，温庆辉.中国药物警戒[J].2010，7，(7)：430-431)、《土贝母的药理作用研究进展》(石会丽，韩燕萍，肖会玲.陕西中医[J],2004，25(9)：857-858) 等文献所公开的。
发明内容
本发明的目的在于提供土贝母皂苷甲应用于制备巨胞饮作用诱导剂。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用。
所述土贝母皂苷甲在制备诱导结肠癌细胞发生巨胞饮作用的诱导剂中的应用。
所述土贝母皂苷甲在制备抑制癌细胞的药物中的应用。
所述土贝母皂苷甲在制备抑制结肠癌细胞的药物中的应用。
上述应用时，土贝母皂苷甲与5-氟尿嘧啶联合使用。
本发明发现土贝母皂苷甲可诱导癌细胞发生巨胞饮作用，从而抑制癌细胞生长。并进一步通过动物实验发现巨胞饮作用的诱导剂土贝母苷甲和5-氟尿嘧啶 5-Fu联合应用比单独使用抑制肿瘤的效果更好。
本发明细胞发生巨胞饮作用的诱导剂是研究巨胞饮作用的优秀工具药，土贝母苷甲具有促进肿瘤细胞通过巨胞饮作用吸收化疗药的作用，具备成为化疗辅助药的潜力。
附图说明
图1是本发明实验例中土贝母皂苷甲(Tubeimoside I)对结肠癌细胞DLD-1细胞活力的影响。
图2是本发明实验例中土贝母皂苷甲(TBM1)诱导结肠癌细胞发生形态学的变化。
图3是本发明实验例中土贝母皂苷甲诱导结肠癌细胞胞质泡的融合。
图4是本发明实验例中土贝母皂苷甲诱导结肠癌细胞产生胞质泡，胞质泡吞噬荧光黄，其中：Phase为明场图片，Lucifer yellow为巨胞饮特异性指示剂， Merge为前两者分别摄片后合并图片。
图5是本发明实验例中土贝母皂苷甲处理结肠癌细胞DLD-1后，内质网、线粒体以及溶酶体探针检测胞质泡中是否含有这些细胞器，其中：Phase为明场状态下细胞巨胞饮图片；ERtracker、MitoTracker和LysoTracker分别为内质网、线粒体核溶酶体等亚细胞器特异性染色剂；Merge为亚细胞指示剂与明场图片融合图片。
图6是本发明实验例中通过Dextran Af-488探针和溶酶体探针检测胞质泡中的溶酶体，其中：Phase为明场图片；Dextran Af488为巨胞饮特异性指示剂； LysoTracker为溶酶体指示剂，Merge为前三者分别摄片后融合图片。
图7是本发明实验例中Amiloride抑制土贝母皂苷甲诱导胞质泡的对比图，其中Amiloride为特异性巨胞饮抑制剂。
图8是本发明实验例中裸鼠肿瘤组织的大小。
具体实施方式
本发明中的土贝母皂苷甲为天然化合物，是药材土贝母的提取物。土贝母皂苷甲可以应用于制备巨胞饮(macropinocytosis)作用诱导剂。更优选的，土贝母皂苷甲在制备诱导结肠癌细胞发生巨胞饮作用的诱导剂中的应用。
土贝母皂苷甲在制备抑制癌细胞的药物中的应用。更优选的，土贝母皂苷甲在制备抑制结肠癌细胞的药物中的应用。
上述应用时，土贝母皂苷甲与5-氟尿嘧啶联合使用，效果更佳。
实验例：证明土贝母皂苷甲可以作为巨胞饮的诱导剂
1.材料
1.1细胞
人结肠癌细胞DLD-1购于中科院上海细胞库。在含10％胎牛血清、1％双抗的RPMI1640培养液中生长，放置在37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，倒置显微镜下观察细胞状态良好。
1.2试药
土贝母皂苷甲购于中国食品药品检定研究院(分析标准品，HPLC≥98％)，用DMSO溶解，存放于-20℃，作为储备液，使用时用培养液稀释成相应浓度。
1.3仪器Elx酶标仪(Bio-TEK-INSTUMENTS INC产品)，倒置荧光显微镜 Nikon Ti-S(Nikon公司)，Nikon C2+共聚焦显微镜(Nikon公司)。迷你型化学发光成像仪MiniChemiTMⅡ(北京赛智创业科技有限公司)。
2.方法
2.1 MTT法
人结肠癌细胞DLD-1以5×104个·ml-1密度接种于96孔板，于37℃， 5％的CO2条件下培养，细胞贴壁后，每孔加不同浓度的土贝母皂苷甲，使其终浓度分别0、4、8、12、16、24μM，每组设置5个复孔。药物处理细胞24、 48h后，加5mg·ml-1的MTT 20μl，反应4h后，弃上清，加入DMSO 150 μl于室温振荡15min使结晶溶解，在490nm处用酶标仪测OD值。结果如图1所示。同时观察土贝母皂苷甲作用结肠癌细胞后形态学的变化，结果如图2 所示。
2.2荧光黄的吞噬和细胞器示踪剂的追踪
用8μM的土贝母皂苷甲处理人结肠癌细胞DLD-1后，除去培养液，用 Hank’s液洗3次，加荧光黄，在培养箱中孵育。孵育结束后，用Hank’s液洗3 次。在共聚焦显微镜下拍照。结果如图4所示。
为了明确形成的囊泡中是否含有内质网、线粒体以及溶酶体，分别用三种相应的探针标记三种细胞器，然后拍照。结果如图5所示。
用8μM的土贝母皂苷甲处理人结肠癌细胞DLD-1后，除去培养液。用 Dextran Af-488培养，然后再用溶酶体探针Lyso-tracker Red培养。用无酚红的完全培养液洗3次，用显微镜拍照。结果如图6所示。
2.3实时显微摄影
在35mm的玻底皿中培养人结肠癌细胞DLD-1。细胞贴壁后，用8μM的土贝母皂苷甲处理细胞，立即将细胞放在共聚焦显微镜的培养小室中培养，培养小室的培养条件是：37℃，饱和湿度的含5％CO2的条件。每隔30秒拍一次照片。结果如图3所示。
2.4动物实验
培养MC-38小鼠结肠癌细胞，接种于BALB/c-nu雄性裸鼠腹股沟处，皮下各注射0.2ml MC-38细胞(细胞数为1×10 7个·ml-1)。待肿瘤生长至一定大小时，实验动物分为4组，每组各10只，模型组(Vehicle)、土贝母苷甲组(TBM1)、土贝母苷甲与5-Fu联合用药组(TBM1+5Fu)以及5-Fu组(5Fu)。腹腔注射给药14天后，1％戊巴比妥钠麻醉后处死裸鼠，剥离肿瘤组织，称重。结果如图8 所示。
2.5统计学处理
所有数据以均数±标准差表示，统计学处理采用spss22.0软件进行分析，当P<0.05时有统计学差异。
3.结果
3.1土贝母皂苷甲对结肠癌细胞的增殖抑制作用
如图1所示，不同浓度的土贝母皂苷甲作用结肠癌细胞DLD-1 24、48h后，细胞的存活率降低；同一浓度的土贝母皂苷甲作用结肠癌细胞不同时间后，随着时间的增加，细胞的存活率降低。说明土贝母皂苷甲抑制结肠癌细胞的增殖具有剂量和时间依赖性。
3.2土贝母皂苷甲作用结肠癌细胞后形态学的变化
如图2所示，4μM、8μM、12μM的土贝母皂苷甲处理结肠癌细胞后，细胞会出现胞质泡。随着浓度的增加，胞质泡会增大；同一浓度下，随着时间的增加，胞质泡也会增大。胞质泡的增加具有剂量和时间的依赖性。
3.3胞质泡的融合
8μM土贝母皂苷甲处理结肠癌细胞后，用共聚焦显微镜实时拍摄，从图3 中可以看出，两个较小的胞质泡能够融合，形成一个更大的胞质泡。
3.4荧光黄的吞噬
巨胞饮的另外一个特点是：胞质泡能吞噬细胞外液体。为了证实土贝母皂苷甲诱导的胞质泡来自巨胞饮体，因此用荧光黄来培养土贝母皂苷甲处理的结肠癌细胞DLD-1，发现胞质泡能吸收荧光黄，如图4。
3.5胞质泡中的细胞器
为了明确胞质泡中是否含有内质网、线粒体以及溶酶体等细胞器，用8μM土贝母皂苷甲处理结肠癌细胞诱导胞质泡后，再分别用内质网、线粒体以及溶酶体探针Lyso-tracker Red孵育，发现胞质泡中不含内质网、线粒体，但偶见细胞器中含有溶酶体，如图5。
为了进一步明确细胞器中是否含有溶酶体，用Dextran Af-488探针和溶酶体探针进行孵育，发现极少部分较小的胞质泡中含有溶酶体，见图6。
3.6 Amiloride明显抑制胞质泡的形成
先用或不用抑制剂Amiloride处理DLD-1细胞1h，再用8μM土贝母皂苷甲(TBM1)处理结肠癌细胞，发现用Amiloride和土贝母皂苷甲共同处理DLD-1 后，比土贝母皂苷甲单独处理DLD-1诱导的胞质泡明显减少，如图7。
3.7土贝母苷甲与5-Fu联合应用更有效的抑制肿瘤的生长
从动物实验结果可以看出，如图8，模型组肿瘤重量明显大于土贝母苷甲组、土贝母苷甲与5-Fu联合用药组和5-Fu组的肿瘤重量；而土贝母苷甲与5-Fu联合用药组的肿瘤重量明显小于他们单独给药的肿瘤重量。
4.结论
4.1通过MTT法，证明土贝母皂苷甲抑制结肠癌细胞生长，且证明土贝母皂苷甲诱导细胞发生巨胞饮。
4.2通过土贝母皂苷甲处理结肠癌细胞后，观察细胞形态学的变化、胞质泡的融合、线粒体、内质网溶酶体等细胞器是否存在胞质泡中，证明这种抑制作用是巨胞饮作用。
4.3通过使用巨胞饮作用的抑制剂Amiloride，检测到土贝母皂苷甲诱导结肠癌细胞的胞质泡会减少，进一步证明这种抑制作用是巨胞饮作用。
4.4通过动物实验，证实巨胞饮作用的诱导剂土贝母苷甲和5-Fu联合应用比单独使用抑制肿瘤的效果更好，巨胞饮作用的诱导剂土贝母苷甲促进5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)在肿瘤中的吸收，二者联用，能更有效的发挥治疗作用。
通过以上实验，证明土贝母皂苷甲能诱导结肠癌细胞产生胞质泡，符合巨胞饮的特点，因此，土贝母皂苷甲是一种有用的工具，可以作为巨胞饮作用的诱导剂。

Claims (5)

1.土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用。
2.土贝母皂苷甲在制备诱导结肠癌细胞发生巨胞饮作用的诱导剂中的应用。
3.土贝母皂苷甲在制备抑制癌细胞的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的癌细胞为结肠癌细胞。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的应用，其特征在于：所述应用时，土贝母皂苷甲与5-氟尿嘧啶联合使用。
CN201810660260.XA 2018-06-25 2018-06-25 土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用 Pending CN108743598A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810660260.XA CN108743598A (zh) 2018-06-25 2018-06-25 土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810660260.XA CN108743598A (zh) 2018-06-25 2018-06-25 土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108743598A true CN108743598A (zh) 2018-11-06

Family

ID=63977250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810660260.XA Pending CN108743598A (zh) 2018-06-25 2018-06-25 土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108743598A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114306358A (zh) * 2022-01-28 2022-04-12 南方医科大学 治疗胶质母细胞瘤的药物及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
马润娣等: "土贝母甙甲抗肿瘤活性的研究.", 《中国肿瘤临床》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114306358A (zh) * 2022-01-28 2022-04-12 南方医科大学 治疗胶质母细胞瘤的药物及其应用
CN114306358B (zh) * 2022-01-28 2022-08-12 南方医科大学 治疗胶质母细胞瘤的药物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102038690B (zh) 沙蟾毒精在制备抗肿瘤药物制剂中的应用
CN101647796A (zh) 蛇床子素在制备抑制血管新生药物中的应用
CN102603689B (zh) 降二萜类化合物莱茄萜a及其制备方法和用途
CN108743598A (zh) 土贝母皂苷甲在制备巨胞饮作用诱导剂中的应用
CN102078317A (zh) 一种双氢青蒿素磷脂复合物及其制备与应用
CN105560608A (zh) 一种治疗肺癌的药物组合物
CN103638052A (zh) 双齿多刺蚁提取物及其制备和医药用途
CN106727701A (zh) 一种由四神丸制备的含药血清及其制备方法和应用
CN104000820B (zh) 盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用
CN102058579B (zh) 去氢木香内酯在制备抑制血管生成药物中的应用
CN102440987B (zh) 含有芹菜素及芹菜素类衍生物和青蒿素及青蒿素类衍生物的药物组合物及其应用
CN101732412A (zh) 黄芩总黄酮苷元提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用
CN102617526B (zh) 二倍半萜类化合物黑珀萜j及其制备方法和用途
CN104523680A (zh) 一种抗肿瘤的药物组合物
CN100430064C (zh) 黄芩甙在制备抑制血管生成药物中的应用
CN102210725B (zh) 田基黄总黄酮用于制备治疗肝纤维化的药物的用途
CN103230398B (zh) 汉黄芩素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用
CN107693509A (zh) Sb‑fi‑26在制备治疗乳腺癌药物中的应用
CN109602775B (zh) 乳苣醇提物在制备抗乳腺癌药物中的用途
CN103638068A (zh) 舌状蜈蚣藻提取物及其制备方法和应用
CN110585189B (zh) 三尖杉宁碱在制备治疗疟疾药物中的应用
CN108042527A (zh) 白花前胡乙素在制备药物性肝损伤保护药物中的用途
CN102617596B (zh) 二倍半萜类化合物黑珀萜i及其制备方法和用途
CN104116778B (zh) 一种中药组合物、其提取物及应用
CN106176982A (zh) 黑顶黄堇有效部位及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181106