CN108732348A - 一种配体门控诊疗体系的构建方法及其在肿瘤实时响应方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物技术和制药技术领域，涉及一种基于OMCN的高效灵敏的配体门控诊疗体系的制备方法，本发明通过特异性结合恶性肿瘤表面高度表达的MUC1，可实现体内外的肿瘤多重诊断及治疗，本发明的基于OMCN的配体门控诊疗体系，检测限低，可应用于MUC1分子、肿瘤细胞和活体肿瘤组织不同水平上的检测和治疗，确保诊断真实可靠，治疗靶向高效。本发明提供了一种经济实用简单的基于OMCN的配体门控诊疗体系的制备技术，可实现体内外的肿瘤多重诊断及治疗。

Description

一种配体门控诊疗体系的构建方法及其在肿瘤实时响应方面 的应用
技术领域
本发明属生物技术和制药技术领域，涉及载药系统，具体涉及一种配体门控诊疗体系的构建方法及其在肿瘤实时响应方面的应用。
背景技术
资料显示，近年来，虽然人们对于肿瘤这一重大疾病的处理投入了大量的科研力量，肿瘤患者的死亡率仍然未得到显著性的改善。目前临床实践中对于肿瘤的治疗仍然囿于诊断和治疗分离的模式，调查显示，假阳性/阴性诊断、晚期诊断、肿瘤转移、脱靶副作用等缺陷仍然存在。事实上，基于实时诊断的靶向可控/按需给药是一种理想的肿瘤治疗模式，可以实现肿瘤的早期、高效诊断，将药物精准递送到肿瘤区域，最大化减少非靶向递送导致的机体副作用，同时实现基于肿瘤发展程度的可控、按需释药。这一理想的纳米肿瘤诊疗平台的搭建，是目前肿瘤靶向诊疗领域的研究热点。
研究报道，基于荧光共振能量转移的生物传感器，特别是荧光猝灭-恢复型传感器，由于其高灵敏度、低背景噪音、强抗干扰能力等特性，是一种灵敏、可行的肿瘤诊断途径；而具有高生物相容且孔径可调的介孔纳米材料是目前肿瘤递药的有效载体；将荧光猝灭-恢复型传感器与介孔纳米递药系统相结合，可以实现肿瘤高效的诊疗。然而由于普遍使用的介孔硅纳米粒的光学透明性，唯有通过进一步的表面或孔道修饰才可使得结合的荧光探针淬灭，这不仅增加了合成复杂性及降低了临床应用的潜力，也增加了药物载入(诊疗结合)的困难程度。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种配体门控诊疗体系的构建方法及其在肿瘤实时响应方面的应用，本发明将有助于特异性原位高效诊断粘蛋白过表达的肿瘤，实现靶向、、肿瘤发展程度的按需释药，起到更好的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种配体门控诊疗体系的构建方法及其在肿瘤实时响应方面的应用，本发明的配体门控诊疗体系通过特异性结合恶性肿瘤表面高度表达的MUC1，实现肿瘤实时响应的诊断和治疗。
本发明基于介孔碳球及特定序列的单链核苷酸(P0)，构建了一种配体门控的载药系统，门控P0可被多数恶性肿瘤细胞表面高度表达的粘蛋白(MUC1)特异性解吸附，实现诊断及靶向递药的功能；该纳米门控诊疗平台，可特异性原位高效诊断粘蛋白过表达的肿瘤，实现靶向、肿瘤发展程度(粘蛋白浓度响应)的按需释药，并且氧化介孔碳球还具有pH响应的释药性质，结合肿瘤微酸性环境条件能起到更好的治疗效果。
具体的，本发明所述的配体门控诊疗体系，以氧化介孔碳纳米球OMCN为支撑，负载抗肿瘤药物阿霉素(Dox)，表面通过π-π非共价作用覆盖单链DNA门控。
本发明制备所述配体门控诊疗体系的步骤如下：介孔碳纳米球使用强酸混合物处理，超声，搅拌，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN，适量OMCN和Dox混合，搅拌6h，透析，进一步与P0混合，摇床振摇，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，储存备用。
上述制备方法中，合成OMCN时所述强酸混合物为硫酸和硝酸的混合物，体积比为2～4:1。
上述方法中，合成OMCN时，超声方式为普通超声和超声破碎仪超声。
上述方法中，合成OMCN时，超声时间为0.5～4h。
上述方法中，合成OMCN时，搅拌温度为30～70℃。
上述方法中，合成OMCN时，搅拌时间为0.5～4h。
上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，OMCN的浓度范围是5～800μg/mL。
上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，DOX的浓度是20μg/mL。
上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，OMCN与Dox的搅拌混合时间为0.5～6h。
上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，OMCN与Dox的搅拌速率为300rpm。
上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，P0的浓度范围是40～4000nmol/L。
上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，Dox-OMCN与P0的搅拌混合时间为1h。
上述方法中，制备Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系时，Dox-OMCN与P0的搅拌速率为300rpm。
上述方法中，所得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的适宜储存温度为4～25℃。
本发明使用Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系检测的溶液体系为PBS溶液(pH＝5.0或7.4)和含10％血浆的PBS溶液(pH＝7.4)。
本发明使用Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系检测的目标对象为MUC1分子、肿瘤细胞和活体肿瘤组织。
本发明使用Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系治疗的目标对象为肿瘤细胞和荷乳腺癌瘤鼠。
本发明通过多种方法对所制备的OMCN进行表征，表征方法包括：扫描电镜、透射电镜。
本发明使用荧光光谱仪考察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的线性范围和检测限，Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系分别与含有MUC1的不同溶液体系(PBS 5.0,PBS 7.4或含10％血浆的PBS 7.4溶液)，孵育10h，使用荧光光谱仪检测溶液荧光，考察线性范围和检测限。结果显示，本发明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在不同溶液中的线性范围为1.06–10.6μM，其中在PBS溶液(pH 5.0)中检测限为101nM。
本发明进一步使用Infinite M1000Pro酶标仪考察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的线性范围和检测限。Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系与含有MUC1PBS溶液(pH 5.0)孵育10h，使用Infinite M1000Pro酶标仪检测溶液荧光，考察线性范围和检测限，本发明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在PBS溶液(pH 5.0)中的线性范围为0.10–5.3μM，检测限为17.5nM。
本发明使用共聚焦显微镜考察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对肿瘤细胞的选择特异性。Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系分别与人乳腺癌MCF-7细胞和乳腺上皮MCF-10A细胞孵育0h、4h、8h和12h，PBS淋洗，共聚焦显微镜拍照观察，结果显示，MCF-7乳腺癌细胞上的红色荧光随着时间逐渐增强，而乳腺上皮MCF-10A细胞几乎无荧光，表明本发明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对乳腺癌细胞有很好的选择特异性响应。
本发明使用共聚焦显微镜考察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对MUC1不同表达程度肿瘤细胞的选择特异性，Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系分别与人乳腺癌MCF-7细胞及添加不同浓度MUC1多肽(1.06μM，2.12μM，4.24μM，6.36μM，8.48μM，10.6μM)的MCF-7细胞孵育8h，PBS淋洗，共聚焦显微镜拍照观察，结果显示，MCF-7乳腺癌细胞上的红色荧光随着体系MUC1浓度增加逐渐增强，表明本发明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对MUC1不同表达程度的乳腺癌细胞有很好的选择特异性响应。
本发明使用CCK8细胞凋亡试剂检测Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在MCF-7肿瘤细胞及MCF-10A中的治疗效果，不同浓度的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系(0μg/mL，15μg/mL，30μg/mL，60μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL)分别与MCF-7和MCF-10A细胞孵育24h，PBS淋洗，试剂染色，酶标仪检测，结果显示，MCF-7乳腺癌细胞的死亡率随着Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的浓度增加逐渐增强，而对MCF-10A细胞毒性效应较弱且随着Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的浓度增加未明显增强，表明本发明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对肿瘤细胞有很好的选择性治疗效应。
本发明使用倒置荧光显微镜观察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在MCF-7肿瘤细胞中的治疗效果，不同浓度的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系(0μg/mL，15μg/mL，30μg/mL，60μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL)与MCF-7乳腺癌细胞孵育24h，PBS淋洗，Live-Dead荧光试剂染色，倒置荧光显微镜观察，结果显示，MCF-7乳腺癌细胞的死亡率随着Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的浓度增加逐渐增强，表明本发明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对肿瘤细胞有很好的治疗效应。
本发明使用活体成像系统观察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对体内肿瘤的响应效果，雌性Balb/c裸鼠皮下接种MCF-7细胞，待瘤体积增大至200mm3可用，正常鼠和荷瘤鼠分别皮下注射或瘤内注射Dox溶液和Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，分别于0h、2h、4h、8h和12h使用Maestro-2活体成像系统观察裸鼠，结果显示，荷瘤鼠瘤内注射Dox溶液，荧光信号非常弱，荷瘤鼠瘤内注射Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，荧光信号随着时间延长先增强后减弱，正常鼠皮下注射Dox溶液，荧光信号非常弱，正常鼠皮下注射Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，未检测到荧光信号，表明本发明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对活体肿瘤组织有非常好的响应。
本发明的突出优点及特征在于，提供了一种基于OMCN的高效灵敏的配体门控诊疗体系，通过特异性结合恶性肿瘤表面高度表达的MUC1，可实现体内外的肿瘤多重诊断和靶向递药。本发明制备的基于OMCN的配体门控诊疗体系，与现有的基于氧化石墨烯、介孔硅的配体门控诊疗体系相比，检测限明显降低，简便性明显增强，且可应用于MUC1分子、肿瘤细胞和活体肿瘤组织不同水平的检测和治疗，确保诊断真实可靠，治疗及时有效。
本发明提供了一种经济实用简单的基于OMCN的配体门控诊疗体系的制备技术，可实现体内外的肿瘤多重诊断和治疗。
附图说明
图1，OMCN及Dox-OMCN-P0的物理表征结果，
其中，A：OMCN透射电镜图，
B：OMCN反傅里叶变换透射电镜图，
C：Dox-OMCN-P0扫描电镜图(插入图：EDS能谱)，
D：EDS-Mapping能谱图(C谱)，
E：EDS-Mapping能谱图(O谱)，
F：EDS-Mapping能谱图(N谱)，
G：EDS-Mapping能谱图(P谱)，
H：EDS-Mapping能谱图(混合图谱)。
图2，共聚焦显微镜法考察MCF-7肿瘤细胞对Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的摄取及释放情况，
其中，A：MCF-7细胞与Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育0h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
B：MCF-7细胞与Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育4h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
C：MCF-7细胞与Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育8h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
D：MCF-7细胞与Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育12h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
E：MCF-7细胞与Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育8h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
F：MCF-7细胞与1.06μM MUC1多肽及Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育8h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
G：MCF-7细胞与2.12μM MUC1多肽及Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育8h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
H：MCF-7细胞与4.24μM MUC1多肽及Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育8h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
I：MCF-7细胞与6.36μM MUC1多肽及Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育8h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
J：MCF-7细胞与8.48μM MUC1多肽及Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育8h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
K：MCF-7细胞与10.6μM MUC1多肽及Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育8h(200倍放大，bar＝50μm；900倍放大，bar＝10μm及2.5D切面图)，
L：MCF-7细胞与不同浓度MUC1多肽及Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育后的荧光平均强度-多肽浓度拟合曲线。
图3，共聚焦显微镜法考察MCF-10A人乳腺上皮细胞对Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的摄取及释放情况，
其中，A-C：MCF-10A细胞与Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育0h(A：200倍放大，bar＝50μm；B：900倍放大，bar＝10μm及C：2.5D切面图)，
D-F：MCF-10A细胞与Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育4h(D：200倍放大，bar＝50μm；E：900倍放大，bar＝10μm及F：2.5D切面图)，
G-I：MCF-10A细胞与Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育8h(G：200倍放大，bar＝50μm；H：900倍放大，bar＝10μm及I：2.5D切面图)，
J-L：MCF-10A细胞与Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育12h(J：200倍放大，bar＝50μm；K：900倍放大，bar＝10μm及L：2.5D切面图)。
图4，倒置荧光显微镜及CCK-8细胞凋亡实验观察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在肿瘤细胞中的治疗效果，
其中，A：MCF-7肿瘤细胞未经Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系处理的24h的存活细胞荧光图(bar＝150μm)，
B：MCF-7肿瘤细胞未经Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系处理的24h的死亡细胞荧光图(bar＝150μm)，
C：MCF-7肿瘤细胞与15μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的存活细胞荧光图(bar＝150μm)，
D：MCF-7肿瘤细胞与15μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的死亡细胞荧光图(bar＝150μm)，
E：MCF-7肿瘤细胞与30μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的存活细胞荧光图(bar＝150μm)，
F：MCF-7肿瘤细胞与30μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的死亡细胞荧光图(bar＝150μm)，
G：MCF-7肿瘤细胞与60μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的存活细胞荧光图(bar＝150μm)，
H：MCF-7肿瘤细胞与60μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的死亡细胞荧光图(bar＝150μm)，
I：MCF-7肿瘤细胞与100μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的存活细胞荧光图(bar＝150μm)，
J：MCF-7肿瘤细胞与100μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的死亡细胞荧光图(bar＝150μm)，
K：MCF-7肿瘤细胞与250μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的存活细胞荧光图(bar＝150μm)，
L：MCF-7肿瘤细胞与250μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的死亡细胞荧光图(bar＝150μm)，
M：MCF-7肿瘤细胞与500μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的存活细胞荧光图(bar＝150μm)，
N：MCF-7肿瘤细胞与500μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的死亡细胞荧光图(bar＝150μm)，
O：MCF-7肿瘤细胞与1000μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的存活细胞荧光图(bar＝150μm)，
P：MCF-7肿瘤细胞与1000μg/mL Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的死亡细胞荧光图(bar＝150μm)，
Q：MCF-7肿瘤细胞及MCF-10A人乳腺正常细胞与不同浓度Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系孵育24h的细胞凋亡柱形图。
图5，活体成像系统观察Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对体内肿瘤的响应效果，
其中，I组：荷瘤鼠尾静脉Dox溶液，
II组：荷瘤鼠尾静脉Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，
III组：正常鼠尾静脉Dox溶液，
IV组：正常鼠尾静脉Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，
A：裸鼠经不同处理0h后使用Maestro-2活体成像系统观察结果，
B：裸鼠经不同处理2h后使用Maestro-2活体成像系统观察结果，
C：裸鼠经不同处理4h后使用Maestro-2活体成像系统观察结果，
D：裸鼠经不同处理8h后使用Maestro-2活体成像系统观察结果，
E：裸鼠经不同处理12h后使用Maestro-2活体成像系统观察结果，
F：裸鼠经不同处理12h后，离体脏器使用Maestro-2活体成像系统观察结果，
G：裸鼠经不同处理12h后，离体脏器荧光定量图。
具体实施方式
实施例1.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为2:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌1h，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例2.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌1h，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例3.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为4:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌1h，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例4.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，超声破碎仪破碎1h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌1h，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例5.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声0.5h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌1h，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例6.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声4h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌1h，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例7.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，30℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌1h，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例8
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，70℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌1h，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例9
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌0.5h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌1h，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例10
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌4h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌1h，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例11.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(800μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例12.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(200μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例13.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(100μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例14.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(50μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例15.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(20μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例16.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(10μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例17.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(5μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例18.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌0.5h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例19.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌1h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例20.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(5μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌1.5h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例21.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(5μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌2h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例22.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(5μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌3h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例23.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(5μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌4h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例24.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(5μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌5h，再加入P0(2μmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例25.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(40nmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例26.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(200nmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例27.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(400nmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例28.
介孔碳纳米球使用硫酸和硝酸的混合物(体积比为3:1)处理，普通超声2h，50℃搅拌2h，离心，水洗，干燥，即得氧化介孔碳纳米球OMCN。OMCN(400μg/mL)与Dox(20μg/mL)混合，300rpm搅拌6h，再加入P0(4000nmol/L)搅拌即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，4℃储存备用。
实施例29.
通过JEOL-2100F透射电镜观察实施例2制备的OMCN，结果显示该OMCN分散性好，具有有序介孔，孔径约为3nm(如图1A和1B所示)。
实施例30.
通过Zeiss Ultra-55扫描电镜观察实施例2制备的Dox-OMCN-P0，结果显示该Dox-OMCN-P0具有均一的尺寸，呈圆整球形，粒径在100nm左右，覆盖P0后的OMCN粘连，显示P0较好覆盖于OMCN表面(如图1C所示)。
实施例31.
通过Zeiss Ultra-55扫描电镜拍摄实施例2制备的Dox-OMCN-P0的mapping图谱，结果显示该Dox-OMCN-P0具有明显的覆盖球体的N、P特征元素分布，表明P0较好覆盖于OMCN表面(如图1D-1H所示)。
实施例32.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系与含有MUC1的PBS溶液(pH 7.4)混合，孵育10h，使用荧光光谱仪检测溶液荧光，考察线性范围。结果显示，所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在PBS溶液(pH 7.4)中的线性范围为1.06–10.6μmol/L，如表1所示。
实施例33.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系与含有MUC1的PBS溶液(pH 5.0)混合，孵育10h，使用荧光光谱仪检测溶液荧光，考察线性范围。结果显示，所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在PBS溶液(pH 5.0)中的线性范围为1.06–10.6μmol/L，如表1所示。
实施例34.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系与MUC1及含10％血清的PBS溶液(pH 7.4)混合，孵育10h，使用荧光光谱仪检测溶液荧光，考察线性范围。结果显示，所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在含10％血清的PBS溶液(pH 7.4)中的线性范围为1.06–10.6μmol/L，如表1所示。
实施例35.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系与含有MUC1的PBS溶液(pH 5.0)混合，孵育10h，使用Infinite M1000Pro酶标仪检测溶液荧光，考察线性范围。结果显示，所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在PBS溶液(pH 5.0)中的线性范围为0.10–5.3μmol/L，如表1所示。
实施例36.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系与含有MUC1的PBS溶液(pH 5.0)混合，孵育10h，使用荧光光谱仪检测溶液荧光，考察检测限。结果显示，所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在PBS溶液(pH 5.0)中的检测限为101nM，如表1所示。
实施例37.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系与含有MUC1的PBS溶液(pH 5.0)混合，孵育10h，使用Infinite M1000Pro酶标仪检测溶液荧光，考察检测限。结果显示，所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在PBS溶液(pH 5.0)中的检测限为17.5nM，如表1所示。
表1
实施例38.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系与人乳腺癌MCF-7细胞孵育0h、4h、8h和12h，PBS淋洗，共聚焦显微镜拍照观察。结果显示，MCF-7乳腺癌细胞上的红色荧光随着时间逐渐增强，表明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对乳腺癌细胞有非常好的响应(如图2A-D所示)。
实施例39.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系及添加不同浓度MUC1多肽(1.06μM，2.12μM，4.24μM，6.36μM，8.48μM，10.6μM)的MCF-7细胞孵育8h，PBS淋洗，共聚焦显微镜拍照观察。结果显示，MCF-7乳腺癌细胞上的红色荧光随着体系MUC1浓度增加逐渐增强，表明本发明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对MUC1不同表达程度的乳腺癌细胞有很好的选择特异性响应，(如图2E-K所示)。
实施例40.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系与人乳腺上皮细胞MCF-10A孵育0h、4h、8h和12h，PBS淋洗，共聚焦显微镜拍照观察。结果显示，MCF-10A乳腺上皮细胞几乎无荧光，表明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对乳腺上皮细胞无响应(如图3所示)。
实施例41.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系(0μg/mL，15μg/mL，30μg/mL，60μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL)分别与人乳腺癌MCF-7细胞孵育24h，PBS淋洗，CCK8细胞凋亡试剂染色，酶标仪检测。结果显示，MCF-7乳腺癌细胞的死亡率随着Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的浓度增加逐渐增强，表明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对乳腺癌细胞有非常好的响应(如图4Q所示)。
实施例42.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系(0μg/mL，15μg/mL，30μg/mL，60μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL)分别与人乳腺上皮细胞MCF-10A孵育24h，PBS淋洗，CCK8细胞凋亡试剂染色，酶标仪检测。结果显示，各浓度Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对人乳腺上皮细胞几乎无毒性，表明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对人乳腺上皮细胞几乎无响应(如图4Q所示)。
实施例43.
将实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系(0μg/mL，15μg/mL，30μg/mL，60μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL)分别与MCF-7乳腺癌细胞孵育24h，PBS淋洗，Live-Dead荧光试剂染色，倒置荧光显微镜观察。结果显示，MCF-7乳腺癌细胞的死亡率随着Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系的浓度增加逐渐增强，表明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对乳腺癌细胞有非常好的响应(如图4A-4P所示)。
实施例44.
雌性Balb/c裸鼠皮下接种MCF-7细胞，待瘤体积增大至200mm3可用。正常鼠和荷瘤鼠尾静脉分别注射Dox溶液和实施例2制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，分别于0h、2h、4h、8h和12h使用Maestro-2活体成像系统观察裸鼠。结果显示，荷瘤鼠瘤内注射Dox溶液，荧光信号非常弱，荷瘤鼠瘤内注射Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，荧光信号随着时间延长先增强后减弱，正常鼠皮下注射Dox溶液，荧光信号随着时间延长减弱，正常鼠皮下注射Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，未检测到荧光信号，表明本发明所制备的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系对活体肿瘤组织有非常好的响应(如图5所示)。

Claims (11)

1.一种配体门控诊疗体系，其特征在于，以氧化介孔碳纳米球OMCN为支撑，表面通过π-π非共价作用连接覆盖单链DNA门控，制成氧化介孔碳纳米球配体门控诊疗体系。的构建方法一种氧化介孔碳纳米球配体门控诊疗体系的制备方法，其特征在于通过特异性结合恶性肿瘤表面高度表达的MUC1，实现体内外的肿瘤多重诊断。
2.权利要求1所述的配体门控诊疗体系的制备方法，其特征在于，其包括步骤：介孔碳纳米球使用强酸混合物处理，超声，搅拌，离心，水洗，干燥，制得氧化介孔碳纳米球OMCN；适量Dox-OMCN与P0混合，混匀搅拌，即得Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系，储存备用。
3.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于：合成OMCN时所述强酸混合物为硫酸和硝酸的混合物，体积比为2～4:1。
4.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于：合成OMCN时，超声方式为普通超声和超声破碎仪超声。
5.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于：合成OMCN时，超声时间为0.5～4h，搅拌温度为30～70℃，搅拌时间为0.5～4h。
6.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于：OMCN载入阿霉素时间为0.5～6h，OMCN的浓度范围是5～800μg/mL。
7.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于：Dox-OMCN的浓度是400μg/mL，P0的浓度范围是40～4000nmol/L。
8.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于：适宜储存温度为4～25℃。
9.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制得的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系用于检测的溶液体系为PBS溶液pH 5.0、PBS溶液pH 7.4和含血浆PBS溶液pH 7.4。
10.按权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述制得的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在用于制备检测目标对象为MUC1分子、肿瘤细胞、或活体肿瘤组织的载药系统中的用途。
11.按权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述制得的Dox-OMCN-P0配体门控诊疗体系在用于制备检测目标对象为肿瘤细胞或荷瘤鼠的载药系统中的用途。
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