CN108727222B - 一种选择性抗癌活性的tyd1608及其制备及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供含氰基TYD1608，即(Z)‑3‑(p‑甲基苯基)‑2‑(3，4，5‑三甲氧基苯基)丙烯腈及其制备及用途，涉及药用化合物领域，其结构如下所示：

目前诸多抗癌药物不仅对癌细胞有杀伤能力，而且对正常细胞的毒性也较大，严重影响癌症患者的治疗，所以研制出对正常细胞安全的选择性抗癌活性药物尤为重要。本专利合成了TYD1608，此化合物对6种人来源癌细胞表现出很强的抑制增殖能力，而且对L‑02正常人肝细胞的毒性却很弱。其对MGC‑803胃癌细胞的IC₅₀值小于0.01μM，强于临床常用抗癌药紫杉醇，并具有很好的选择性抗癌活性。机理研究显示，TYD1608对BEL‑7402癌细胞的抑制增殖活性是通过抑制细胞周期中G2/M期、诱导早期和晚期凋亡、阻碍细胞迁移、抑制细胞周期相关蛋白cyclin A1和cyclin D1的结果。

Description

一种选择性抗癌活性的TYD1608及其制备及用途

技术领域

本发明涉及药用化合物领域，特别涉及一种选择性抑制癌细胞增殖的化合物TYD1608及其制备及用途。

背景技术

考布他汀A4是从非洲灌木矮柳树(Combretum Caffrum)的树皮中分离的一种顺式二苯乙烯类天然产物，其抗肿瘤机制主要有抑制微管蛋白聚合，诱导细胞凋亡和对抗肿瘤血管等作用，其化学名称为(Z)-2- 甲氧基-5-(3，4，5-三甲氧苯乙烯基)苯酚，化学结构如结构式1所示：

结构式1：考布他汀A4的结构式

经医学研究发现考布他汀A4对胃癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、白血病、卵巢癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞均有明显的抑制作用。但，经临床研究发现考布他汀A4在抑制癌细胞的同时对周围的正常细胞也产生很强的抑制作用，从而有必要修饰其结构以期待增强化合物的抗癌活性，同时降低对正常细胞的毒性。正是基于考布他汀A4是一种已被证实的很有希望的天然抗肿瘤药物前体，人们期望通过对其母体分子进行化学修饰而寻找到更加安全、高效的抗癌药物。

发明内容

针对现有技术的不足，在对考布他汀A4母体结构进行修饰的过程中发现，在其乙烯单元上引入氰基后可有效避免双苯乙烯结构的异构化，而且当保留A环上3，4，5位的三个甲氧基的基础上其B环的4位引入甲基(结构式2，TYD1608)时，对HCT116、AGS、MGC-803、HepG2、A549、BEL-7402等6种人癌细胞有很强的抑制增殖活性，而对L-02正常人肝脏细胞的毒性却很弱，具有非常优秀的选择性抑癌活性。本发明提供TYD1608，也就是(Z)-3-(p-甲苯基)-2-(3，4，5-三甲氧基苯基)丙烯腈及其制备方法及用途。通过化学合成方法获得其化合物，并且经MTT法测定其活性，发现其选择性抗癌活性很强。此外，本发明还提供TYD1608对BEL-7402癌细胞的抑制增殖活性是通过抑制细胞周期中G2/M期的抑制、诱导早期和晚期凋亡、阻碍细胞迁移、抑制细胞周期相关蛋白cyclin A1和cyclin D1、增强细胞周期相关蛋白cyclin B1的结果。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

TYD1608结构如结构式2所示：

结构式2：(Z)-3-(p-甲苯基)-2-(3，4，5-三甲氧基苯基)丙烯腈(TYD1608)

制备TYD1608的总合成路线如下：

实施例1：合成方式

对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

(Z)-3-(p-甲苯基)-2-(3，4，5-三甲氧基苯基)丙烯腈(TYD1608)的制备

中间产物3，4，5-三甲氧基苯甲酸甲酯2的合成

15.641g(0.092mol)3，4，5-三羟基苯甲酸(化合物1)、K₂CO₃(碳酸钾)26.021g(0.189mol)和100mL 丙酮(CH₃COCH₃)于500mL两口烧瓶中，用恒压滴液漏斗缓慢匀速滴加(CH₃)₂SO₄(硫酸二甲酯)17mL，约30min滴完后开始加热，回流4h，薄层色谱跟踪检测，反应完毕冷却至室温，过滤，丙酮洗涤滤渣并合并滤液，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，干燥，得到化合物2(参见总合成路线)。

中间产物3，4，5-三甲氧基苯甲醇3的合成

在氩气保护和冰浴条件下，依次加入LiAlH₄(氢化铝锂)1.251g(0.033mol)与20mL无水THF(四氢呋喃)于100mL三口烧瓶中，搅拌，用注射器滴加6.786g(0.03mol)化合物2的四氢呋喃溶液20mL，撤去冰浴，继续在室温反应4h，薄层色谱跟踪检测，等反应完毕将反应液缓慢倒入200mL冰水中，搅拌，出现絮状沉淀，用稀盐酸溶解沉淀，乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，减压蒸除乙酸乙酯，干燥得化合物3(参见总合成路线)。

中间产物3，4，5-三甲氧基溴苄4的合成

在氩气保护和冰浴条件下，加入3.682g(0.02mol)化合物3的CH₂Cl₂(二氯甲烷)溶液20mL于100mL 三口烧瓶中，搅拌，用注射器滴加5.669g(0.021mol)三溴化磷(PBr₃)，继续反应4h，薄层色谱跟踪检测，等反应完毕将反应液倾入50mL冰水中，搅拌，下层为乳白色液体，加碳酸氢钠调pH至7，分出水层后用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，干燥得化合物4(参见总合成路线)。

中间产物3，4，5-三甲氧基苯乙腈5的合成

依次将2.897g(0.150mol)3，4，5-三甲氧基溴苄(化合物4)、2.231g(0.225mol)三甲基氰硅烷 (TMSCN)、7.100g(0.225mol)四丁基氟化铵(TBAF)三水化合物与10mL乙腈(CH₃CN)于反应装置中，搅拌，升温至回流6h，薄层色谱跟踪检测，冷却至室温，反应液倾入100mL冰水中，搅拌，析出白色固体，过滤，固体用50％甲醇洗涤，干燥得化合物5(参见总合成路线)。

(Z)-3-(p-甲苯基)-2-(3，4，5-三甲氧基苯基)丙烯腈(TYD1608)的制备

取0.193g(0.01mol)3，4，5-三甲氧基苯乙腈(化合物5)、0.124g(0.01mol)4-甲基苯甲醛与20mL甲醇至50mL三口烧瓶中，搅拌升温至60℃，加入甲醇钠0.027g(0.005mol)，恒温反应6h，薄层色谱跟踪检测，待反应完毕后冷却至室温，过滤，水洗，干燥，用甲醇重结晶得浅黄色固体。收率：35.1％，熔点： 168-170℃，IR(KBr)cm^-1：2206.10(C≡N).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ7.79(d，J＝8.2Hz，2H)，7.56(d，J＝ 8.3Hz，2H)，7.47(s，1H)，7.28(d，J＝3.3Hz，2H)，15.07.23(s，2H)，2.39(t，J＝8.5Hz，6H).¹³C NMR(75MHz， CDCl₃)δ153.50(s)，141.74(s)，141.04(s)，130.87(s)，130.28(s)，129.62(s)，129.18(s)，118.19(s)，110.32(s)， 103.28(s)，60.93(s)，56.26(s)，21.51(s).HR-MS(MALDI)(M⁺)：预测值为309.1359，实测值为309.1363.

实施例2：生物活性实验

实验步骤如下：

①将TYD1608、对照药紫杉醇(taxol)用DMSO(二甲基亚砜)配成最终浓度1000倍的储备液，在无菌环境中避光冷冻保存，临用前将储备液用相应的培养基稀释至1000倍的供试液，备用；

②实验前将人结肠癌细胞HCT116、人肝癌细胞BEL-7402、人胃癌细胞AGS、人胃癌早期分化细胞 SGC-7901、人胃癌晚期分化细胞MGC-803和人正常肝细胞L-02用RPMI-1640培养基(含10％FBS和1％青霉素链霉素双抗)进行培养，人子宫癌细胞HeLa细胞、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549用DMEM 培养基(含10％FBS和1％青霉素链霉素双抗)进行培养；

③取对数生长期的HCT116、AGS、SGC-7901、MGC-803、HepG-2、HeLa、A549、BEL-7402和L-02 以每孔8000-10000个细胞接种于96孔板；

④培养隔夜后换成不同浓度的上述供试液，继续培养48小时后弃去培养基，每孔加入0.01g/L MTT 溶液后继续培养4h后弃去培养基，用DMSO充分溶解所生成的甲瓒后在492nm波长处测其吸光度值，按下列公式计算抑制率。

抑制率％＝[(1-实验组吸光度值)/对照组吸光度值]X 100％

根据抑制率值再计算供试化合物对细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)，所有实验在相同条件下重复进行3次以上，最终结果以mean±SD表示。

对于本发明，其IC₅₀值(μM)如表一所示，在100μM浓度的TYD1608和taxol分别处理L-02正常细胞时的抑制率如表二所示。

表一：化合物TYD1608以及对照药taxol在肿瘤细胞及正常细胞中的IC₅₀值(μM)

化合物

MGC-803

A549

HEPG-2

AGS

Bel-7402

HCT-116

L-02

HeLa

SGC-7901

TYD1608

＜0.01

0.53±0.023

3.74±1.73

0.51±0.45

0.148±0.03

0.61±0.16

＞100

＞100

＞100

Taxol

0.06±0.01

0.44±0.02

0.94±0.03

0.02±0.01

0.09±0.02

0.03±0.01

＞100

12.95±0.47

＞100

表二：浓度为100μM时化合物TYD1608与taxol对正常细胞的增殖抑制率(％)

化合物	L-02
		TYD1608	29.7％±2.5％
Taxol	35.6％±3.1％

实施例3：细胞周期实验

1、取100-mm培养皿上的对数生长期的BEL-7402细胞，弃去培养基，加入1mL PBS缓冲液进行冲洗，弃去PBS缓冲液，加入1mL胰蛋白酶进行消化，待消化完全后，1000rpm离心5min弃去上清液，加入少量培养基制成细胞混悬液，计数，取含5×10⁶个细胞的悬液种在30-mm培养皿上。

2、待细胞贴壁后，加药处理，12h后吸除培养基，将细胞消化，合并，1000rpm离心5min。

3、收集的细胞用PBS缓冲液洗2次。

4、用1mL PBS悬浮细胞后置入15mL离心管中，在漩涡振荡器上边振荡边缓慢加入共9mL的70％预冷冰乙醇，盖上盖子。

5、将固定好的细胞放入-20℃保存。

6、使用前，1000rpm离心10min，弃去70％冰乙醇，用预冷的PBS洗涤2次。

7、用0.5mL 50μg/mL RNase PBS液悬浮细胞后，置37℃水浴中放置30min。

8、加入25μL 1mg/mL PI溶液，避光染色30min。

9、用流式细胞仪检测细胞周期。

10、重复进行三次以上实验，处理数据。

对于本发明，TYD1608对细胞周期的影响结果如表三所示。

表三：化合物TYD1608与taxol作用于BEL-7402细胞12h后的周期分布情况(n≥3)。

根据细胞周期的结果可以看出，随着化合物TYD1608药物浓度的增加，G0/G1期的细胞数明显减少，从正常组的74.17％±2.19％减少到0.1μM的21.28％±1.36％，G2/M期的细胞数明显增多，从正常组的 18.44％±1.30％增加0.1μM的59.50％±0.84％，所以可以得出，该药物主要使细胞停留在G2/M期，与taxol 的结果很相似。

实施例4：细胞凋亡实验

1、取100-mm培养皿上对数生长期的BEL-7402细胞，弃去培养基，加入1mL PBS缓冲液进行冲洗，弃去PBS缓冲液，加入1mL胰蛋白酶进行消化，待消化完全后，1000rpm离心5min弃去上层清液，制成细胞混悬液，计数，取5×10⁵个细胞的悬液种在30-mm培养皿上。

2、待细胞贴壁后，加药处理，12h后吸除培养基，将细胞消化，合并，1000rpm离心5min。

3、收集细胞，用PBS缓冲液洗2次。

4、用200μL 1x binding buffer(染色缓冲液)重悬细胞，再用1000rpm离心5min。

5、弃去上层清液，加入2.5μL Annexin V-FITC后在避光条件下染色15-20分钟，上机前5分钟再加入5μL 50μg/mL PI溶液染色，避光保存。

6、加入400μL 1x binding buffer后进行流式细胞仪检测其细胞凋亡情况。

对于本发明，TYD1608对细胞凋亡的结果如图1所示。

图1：用不同浓度TYD1608和taxol处理BEL-7402细胞12h后的细胞凋亡分布情况

根据细胞凋亡的结果可以看出，随着化合物TYD1608浓度的增加，处于早期凋亡的细胞数从正常组的3.4％增加到8.2％(0.1μM TYD1608处理)，这与0.1μM紫杉醇处理结果(8.1％)相当，而晚期凋亡细胞从正常组的1.3％增加到2.0％(0.1μM TYD1608处理)，从而可以得出此化合物是通过诱导细胞凋亡的机制影响细胞的增殖，但其影响程度并不显著。

实施例5：蛋白印迹法测定蛋白表现情况

1、总蛋白的提取

取对数生长期的BEL-7402细胞接种于培养皿中，待贴壁后加入含不同浓度药物的培养基继续培养12 h，培养结束后，移至冰上，弃去培养基后快速用1mL冷PBS洗涤，重复两到三次，洗涤至无色，吸干溶液，加入100μl裂解液(100mmol/L三羟甲基氨基甲烷，100mmol/L氯化钠，10％聚乙二醇辛基苯基醚，1mmol/L苯甲基磺酰氟，0.1mmol/L亮肽素，1μg/mL抑肽素，pH7.5)，用细胞刮将贴壁的细胞刮下来，将刮下来的细胞转移至1.5毫升离心管中，继续裂解30min。期间每间隔3-4min敲打一次，裂解结束后放入4℃离心机，10000rpm离心30min，取上层清液转移到新离心管中，测定总蛋白含量，加入上样缓冲液，100℃灭火5min，冷冻(-20℃)待用。

2、电泳

将玻璃板提前清洗干净，将玻璃板用夹子夹好，首先配制分离胶，将分离胶沿边慢慢注入玻璃板中，注入一定高度后，加入2mL水将分离胶压平。等待30-40min后将水倒掉，用滤纸吸干，然后注入浓缩胶，注满后插入梳子，等待30min，将玻璃板转移到电泳槽中加入电泳液，拔掉梳子，将样品注入到不同泳道中，插上电源，先70v(约30min)将样品压至分离胶上端后改110v(约1.5h)继续电泳至结束。

3、转膜

提前将滤纸以及棉花用转膜缓冲液浸泡一段时间，将转膜放置在甲醇溶液中，后用PBS洗涤2-3次，浸泡在转移缓冲液中待用，按照黑面-海绵-滤纸-胶-转移膜-滤纸-海绵-白面的顺序依次放入，然后在冰浴条件下300mA转膜1.5h。

4、染色

将转移好的膜放在丽春红染液中染色3-5min，用TBST(1X)(缓冲液)洗涤，可观察到清晰的蛋白条带。

5、封闭

取5g脱脂奶粉，加入10ml TBST(1X)，配成封闭液，然后将膜放到封闭液中封闭1h。封闭结束后用TBST(1X)洗涤3次，每次3-5min。

6、孵育一抗

将一抗按照说明书配制成相应浓度的溶液，放入膜，4℃过夜孵育(常温2.5h摇床孵育)。孵育结束后用TBST(1X)洗涤3次，每次3-5min。

7、孵育二抗

将二抗按照说明书配制成相应浓度的溶液，放入膜，常温2h摇床孵育。孵育结束后用TBST(1X) 洗涤3次，每次3-5min。

8、发光

取等体积的ECL发光试剂A液和B液混合后，均匀涂在膜表面，孵育1-2min。

9、显影定影

将膜平铺在曝光盒上，上面铺一层薄膜，在暗室里将剪好的胶片放置在膜上，盖上曝光盒，曝光10s。显影-蒸馏水-定影。

对于本发明，TYD1608对细胞周期相关蛋白的影响结果如图2所示。

图2：蛋白印迹法测定TYD1608和taxol对BEL-7402细胞的细胞周期相关蛋白的结果

蛋白印迹法测定结果显示，在BEL-7402细胞中TYD1608抑制细胞周期相关蛋白cyclin A和cyclin D1 的表达，并且促进细胞周期相关蛋白cyclin B1的表达，其蛋白表现方式类似于阳性对照药物taxol。

实施例6：细胞迁移实验

取对数生长期的BEL-7402细胞，弃去培养基，加PBS缓冲液冲洗，弃去PBS缓冲液，加入1mL胰蛋白酶进行消化，待消化完全后，1000rpm离心5min，弃去上层清液，制成细胞混悬液(1X10⁵个细胞/mL)，往Transwell(转移盘)的上室加入100μL细胞混悬液，下室加入200μL含20％FBS的细胞培养液待贴壁，后加入不同浓度的药物，继续孵育24h，用棉签擦去上室的细胞，加入200μL甲醇固定10min，蒸馏水清洗，用萨姆染液进行染色，显微镜下选取五个不同视野进行计数。

图3：化合物TYD1608和taxol对BEL-7402细胞的迁移情况，***(p＜0.001)

迁移实验结果显示，与对照组相比，化合物TYD1608在0.1μM和0.5μM两种浓度条件下都具有显著的抑制细胞迁移效果，其抑制迁移程度明显优于阳性对照药taxol。

总而言之，所合成出的化合物(Z)-3-(p-甲苯基)-2-(3，4，5-三甲氧基苯基)丙烯腈(TYD1608)在6种人来源肿瘤细胞中表现出很强的活性，并在不同的细胞中表现出不同的肿瘤抑制作用，其在MGC-803细胞中的IC₅₀值小于0.01μM，远远优于对照药taxol，但TYD1608在100μM浓度时对正常细胞L-02的抑制率仅为29.7％±2.5％，其细胞毒性小于对照药taxol(35.6％±3.1％)。经进一步的作用机制研究发现，在 BEL-7402中，TYD1608主要使细胞停留在G2/M期导致细胞的增殖受到抑制，而其对早期凋亡和晚期凋亡的影响结果并不特别显著。经蛋白印迹法发现，TYD1608能够浓度依赖性地抑制cyclin A和cyclin D1 等细胞周期相关蛋白的表达。此外，TYD1608显著抑制BEL-7402肿瘤细胞的迁移。综上所述，TYD1608 具有很强的抗肿瘤活性以及很低的正常细胞毒性，即具有很强的选择性抗癌活性，甚至是在MGC-803胃癌细胞中显示出明显优于临床对照药taxol的抗癌活性，是一种很有开发前景的抗癌候选化合物。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.含氰基化合物TYD1608在制备抗癌药物的应用，其特征在于，所述含氰基化合物TYD1608为(Z)-3-(p-甲苯基)-2-(3，4，5-三甲氧基苯基)丙烯腈，结构如下：

所述抗癌药物针对AGS、MGC-803、A549 3种人癌细胞有抑制增殖活性。

2.如权利要求1所述的含氰基化合物TYD1608在制备抗癌药物的应用，其特征在于，所述含氰基化合物TYD1608在MGC-803细胞中的IC₅₀值小于0.01μM。

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