CN111018842B - 一种唑代嘧啶衍生物、其药物组合物和在抗肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种唑代嘧啶衍生物、其药物组合物和在抗肿瘤中的应用，涉及药物及化工领域。所述唑代嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐具有通式(I)所示的结构。本发明公开了所述唑代嘧啶衍生物及其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化合物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或者前药及其药物组合物制备治疗肿瘤的药物中的应用，通过抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶进而治疗肿瘤疾病，特别是用于治疗慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病和急性髓细胞白血病的治疗。

Description

一种唑代嘧啶衍生物、其药物组合物和在抗肿瘤中的应用

技术领域

本发明涉及药物及化工领域，具体涉及一种唑代嘧啶衍生物、其药物组合物和在抗肿瘤中的应用。

背景技术

蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTKs)通过控制细胞的信号传导通路调节细胞的生长、分化、凋亡等一系列生理生化过程。受体型酪氨酸激酶是一类横跨细胞膜相对较大的激酶，其具有配体结合的胞外结构域、跨膜结构域和可以起到激酶作用的磷酸化特定酪氨酸残基并且由此影响细胞增殖的胞内结构域。在一般人类癌症中(如肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤)已发现所述激酶的异常表达，因此蛋白酪氨酸激酶已成为抗肿瘤药物研究开发的重要靶点之一。

布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)是一种胞浆蛋白，非受体蛋白酪氨酸激酶Tec家族，其表达于多数造血细胞，如B细胞、肥大细胞、巨核细胞等，但在T细胞、NK细胞和浆细胞中不表达。在BCR信号通路中，随着BCR的激活，BTK依赖Syk、Lyn活化，活化后的BTK可以进一步磷酸化PLCγ2，进而引起包括MAPK、NF-κB等下游信号的活化。BTK在B淋巴细胞的生成过程中起着不可替代的作用。BTK可以通过激活细胞周期正向调控因子和分化因子来控制B细胞的发育、分化，也能通过调节促凋亡和抗凋亡蛋白的表达来控制B细胞的存活和增殖，BTK依赖性通路的异常激活可能与多种肿瘤的发生和发展都存在着密切的关系。

白血病是一种骨髓和外周血被造血干/祖细胞浸润的恶性血液肿瘤，主要表现为白血病细胞过度增殖，并多存在分化障碍，病态的幼稚细胞大量浸润骨髓和外周血，引起人体血液系统异常。目前国内外白血病的治疗以化疗为主，但是因其缺乏靶向性、特异性，且对正常细胞也具有一定的毒性作用，治疗的过程中患者经常会严重的毒副作用，治疗效果非常有限。因此，寻找高效、低毒、高选择性的靶向治疗药物是近年来该领域的研究热点之一，但相比于其他实体肿瘤，白血病相关的靶向药物的研究进展和临床应用都比较落后。

慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种成人最常见的白血病。95％患者的该肿瘤来源于B淋巴细胞，仅有一小部分是由T淋巴细胞恶性转化而来，BTK的持续激活是CLL发展的一个先决条件。研究表明，急性髓细胞白血病(ALL)患者体内也存在BTK的高表达，并且包括HL-60在内的多种白血病细胞株均存在BTK的表达增高。布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)依赖性通路的异常激活可能与血液恶性肿瘤在内多种恶性疾病的发生和发展都存在着密切关系，BTK小分子抑制剂对于治疗血液恶性肿瘤和自身免疫失调疾病具有良好前景。

CN102746305B公开了一种Btk抑制剂单独使用或者与其它治疗药联合使用以治疗自身免疫性疾病或病症、异种免疫性疾病或病症、癌症包括淋巴瘤以及炎性疾病或病症的方法。在细胞测定中，该发明中的化合物4对Btk表现出显著的选择性。在抗IgM刺激的Ramos细胞中，化合物4抑制PLC-γ1的磷酸化，其IC₅₀＝0.014μM，而在Btk上的酪氨酸551的Lyn和Syk依赖性磷酸化被更弱地抑制(IC₅₀＞7.5μM)。因此，化合物4在细胞中的Btk和Lyn或Syk之间显示出＞500倍的选择性。

CN101610676A公开了一种布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，含有布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂的口服药物依鲁替尼(Ibrutinib)已被批准上市，用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL)和CLL。该药物具有优秀的靶向性和理想的治疗效果，被广泛的应用于包括AML在内的其他肿瘤治疗的研究。依鲁替尼(Ibrutinib)可以显著抑制AML细胞的增殖和迁移等功能。其他还有多种可口服的高选择性BTK抑制剂，如CC-292(AVL-292，US8563568，WO2014100748A1)，其IC50小于0.5nmol/L，与其他激酶相比，选择性提升了超国标1400倍。

目前这些化合物或药物对对BTK激酶的抑制效果、抗肿瘤性能仍然有很大的提升空间。鉴于治疗癌症的迫切需要，本领域有必要开发新的效果更加良好的药物，有鉴于此，本发明目的是提供一种唑代嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐及其药物组合物和应用，其对肿瘤的抑制作用更强，活性更高，且毒性更小。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种唑代嘧啶衍生物及其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化合物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或者前药。

本发明的另一目的在于提供包含上述化合物的医药制品或药物组合物。

本发明的再一目的在于提供所述唑代嘧啶衍生物或其药学上可接受的盐、其药物组合物的应用。

技术方案如下：

一种如式(I)所述的化合物，及其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化合物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或者前药：

其中，

R₁选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基；

优选地，R₁选自H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃或CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃；

更优选地，R₁选自H、CH₃或CH₂CH₃。

R₂选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基；

优选地，R₂选自H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃或CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃；

更优选地，R₂选自H、CH₃或CH₂CH₃。

R₃选自卤素；

优选地，R₃选自F、Cl、Br或I；

更优选地，R₃选自F或Cl。

在一些更具体的实施方案中，本发明所披露的化合物为式(I-1)-式(I-5)中的一种：

所述的式(I-1)-式(I-5)的化合物制备方法为：

其中，

合成路线a-d所用试剂及条件分别为：

a：丙烯酰氯，NaHCO₃，CH₃CN，25℃，0.5小时。

b：Fe-NH₄Cl，MeOH-H₂O，70℃，2小时。

c中间体7，DIPEA，1，4-二氧六环，60℃，2小时；优选为60℃，2小时。

d三氟乙酸，中间体3，2-BuOH，100℃，12小时；优选为100℃，12小时。

如式(1)及式(I-1)-式(I-5)所示结构化合物为唑代嘧啶衍生物，本发明抗肿瘤活性筛选显示，此类化合物具有较强的抑制白血病细胞(Ramos、Raji、NAMALWA、HL60和U937)增殖能力，部分化合物显示出比依鲁替尼(Ibrutinib)更加优良的抗BTK活性。作为一类结构新颖的分子，本发明中的化合物具有开发成新型高效BTK抑制剂的潜力，对治疗相关的恶性肿瘤疾病尤其是慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病和急性髓细胞白血病有较大的应用价值。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，包括有效剂量的如本发明式(I)所述的化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化合物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或者前药，及药用载体。

在一些优选地实施方案中，所述的药物组合物包括有效剂量的(I-1)-式(I-5)任一式所示的化合物或其药学上可接受的盐，及药用载体。

本发明所述化合物由于它们在药物中的可能用途，式(I)化合物的盐优选药物可接受的盐。本发明的化合物为碱，其中所需盐形式可以通过本领域已知的合适方法制备，包括用无机酸处理游离碱，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或用有机酸处理游离碱、所述有机酸例如乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羟基乙酸、水杨酸、吡喃糖苷酸，例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，α-羟基酸，例如柠檬酸或酒石酸，氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。药学上可接受的盐的包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟基乙酸盐、酒石酸盐、苦杏仁酸盐和磺酸盐、例如二甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐和萘-2-磺酸盐。

作为一系列具体的实例，本发明所述化合物的无机酸盐的制备方法包括但不限于：取目标分子溶于无水甲醇中，冰浴下，滴加无机酸的无水甲醇混合液，滴加完毕，搅拌，然后常温蒸除甲醇，即得目标分子的无机酸盐。

其中，每1mmol目标分子溶于10mL无水甲醇；

其中，每1mmol无机酸加入5mL无水甲醇。

作为另一系列具体的实例，本发明所述化合物的有机酸盐的制备方法包括但不限于：取目标分子溶于无水甲醇中，冰浴下，滴加有机酸的乙醚混合液，滴加完毕，搅拌，然后减压蒸除乙醚，即得目标分子的有机酸盐。

其中，每1mmol目标分子溶于10mL无水甲醇；

其中，每1mmol有机酸加入5mL干燥乙醚。

所述的无机酸包括但不限于溴酸、硫酸、硝酸、磷酸。

所述的机酸包括但不限于氟乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羟基乙酸、水杨酸、吡喃糖苷酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、α-羟基酸、柠檬酸、酒石酸、氨基酸、天冬氨酸、谷氨酸、芳香酸、苯甲酸、肉桂酸、磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸。

本发明所述的药物组合物通常含有一种本发明披露的化合物。然而，在一些实施方案中，本发明的药物组合物可含有超过一种本发明披露的化合物。另外，本发明的药物组合物还可任选包括一种或多种其它药学活性化合物。

两个目标分子混合物的制备方法包括但不限于：取等摩尔量的上述两个目标分子于无水甲醇中，室温搅拌，减压蒸除溶剂，即得目标分子的混合物。

本发明还提供本发明式(I)所述的化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化合物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或者前药，或所述药物组合物通过抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶进而抑制肿瘤增殖的用途。具体地，该用途主要为制备用于治疗慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病和急性髓细胞白血病的药物中的用途。

本发明提供本发明式(I)所述的化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化合物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或者前药，或所述药物组合物在制备布鲁顿氏酪氨酸激酶抑制剂中的应用。

本发明提供本发明式(I)所述的化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化合物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或者前药，或所述药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。优选地，所述肿瘤选自慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病和急性髓细胞白血病，进一步优选慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病。更优选地，所述用途主要通过抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶实现的。本发明具有如下有益效果：

(1)本发明中的唑类嘧啶衍生物对BTK激酶有较强的抑制效果。

(2)对淋巴细胞白血病细胞(Ramos、Raji、NAMALWA)、急性髓细胞白血病(HL60、U937)有非常有效的抑制作用。

(3)在保证药物活性的同时减轻药物的毒性，具有潜在的药用价值。

(4)抑制Ramos细胞增殖，抑制BTK信号通路中相关蛋白的表达，具有开发成新型高效BTK抑制剂的潜力。

附图说明

图1为唑类嘧啶衍生物I-1和依鲁替尼处理后NAMALWA细胞、Ramos细胞的形态变化图。

图2为唑类嘧啶衍生物I-1和依鲁替尼对PBMC的毒性效果图。

图3为唑类嘧啶衍生物I-1和依鲁替尼处理后细胞凋亡情况的结果图。

图4为唑类嘧啶衍生物I-1和依鲁替尼对细胞周期影响的结果图。

图5为唑类嘧啶衍生物I-1和依鲁替尼处理后获得的凝胶图像。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1唑代嘧啶衍生物的制备

薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm-0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm-0.5mm。

本发明使用的原料主要购自国药集团化学试剂有限公司，北京偶合科技有限公司、阿拉丁化学试剂有限公司、达瑞化学品等公司。

实施例中若无特殊说明，溶液是指水溶液。

实施例中若无特殊说明，反应的温度为室温，即25±5℃。

实施例1.1中间体2a的制备

取2-乙基-4-甲基嘧啶(1.10g，10.0mmol)、对硝基溴苄(2.14g，10.0mmol)、DIPEA(20.0mmol)于1，4-二氧六环中，60℃反应2h，TLC监测反应结束。减压浓缩至干，用乙酸乙酯萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后减压蒸出溶剂得产物，收率91％。

实施例1.2中间体2b的制备

取2-甲基嘧啶(0.82g，10.0mmol)、对硝基溴苄(2.14g，10.0mmol)、DIPEA(20.0mmol)于1，4-二氧六环中，60℃反应2h，TLC监测反应结束。减压浓缩至干，用乙酸乙酯萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后减压蒸出溶剂得产物，收率90％。

实施例1.3中间体2c的制备

取4-甲基嘧啶(0.82g，10.0mmol)、对硝基溴苄(2.14g，10.0mmol)、DIPEA(20.0mmol)于1，4-二氧六环中，60℃反应2h，TLC监测反应结束。减压浓缩至干，用乙酸乙酯萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后减压蒸出溶剂得产物，收率85％。

实施例1.4中间体3a的制备

取中间体2a(1.96g，8.0mmol)、铁粉(16.0mmol)、饱和aq.NH₄Cl于甲醇中，60℃反应2h，TLC监测反应结束。滤除铁粉，减压蒸出甲醇，乙酸乙酯萃取，稀氨水洗涤有机层，有机层经无水硫酸钠干燥后减压蒸出溶剂，经柱层析分离得产物，收率90％。

实施例1.5中间体3b的制备

取中间体2b(1.74g，8.0mmol)、铁粉(16.0mmol)、饱和aq.NH₄Cl于甲醇中，60℃反应2h，TLC监测反应结束。滤除铁粉，减压蒸出甲醇，乙酸乙酯萃取，稀氨水洗涤有机层，有机层经无水硫酸钠干燥后减压蒸出溶剂，经柱层析分离得产物，收率86％。

实施例1.6中间体3c的制备

取中间体2c(1.74g，8.0mmol)、铁粉(16.0mmol)、饱和aq.NH₄Cl于甲醇中，60℃反应2h，TLC监测反应结束。滤除铁粉，减压蒸出甲醇，乙酸乙酯萃取，稀氨水洗涤有机层，有机层经无水硫酸钠干燥后减压蒸出溶剂，经柱层析分离得产物，收率72％。

实施例1.7中间体5、6的制备

取化合物4(3.20g，23.4mmol)和NaHCO₃(4.50g，35.1mmol)于50mL乙腈中，慢慢加入丙烯酰氯(3.80g，23.4mmol)，室温下反应0.5h，反应完后加入400mL水，析出白色固体，抽滤，烘干，得到的白色固体即为化合物5，取化合物5(19.0g，68.0mmol)和氯化铵(7.30g，136.1mmol)于反应瓶中，加入MeOH(125mL)和水(25mL)，边搅拌边加入铁粉(15.0g，272.1mmol)，升温至70℃反应2小时，反应后趁热抽滤，得到的水相用乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并乙酸乙酯层，用饱和食盐水清洗洗一次，用无水硫酸钠干燥，减压蒸干得黄白色固体，即化合物6。

实施例1.8中间体8a的制备

取中间体6(3.24g，20.0mmol)和DIPEA(40.0mmol)于1，4-二氧六环(50ml)中，加入化合物7a(2，4-二氯-5-氟嘧啶，20.0mmol)，升温至60℃，反应2小时后，冷却至室温，加入400mL水，析出黄白色固体，抽滤，烘干，得类白色固体，即为中间体8a。

实施例1.9唑代嘧啶衍生物(I-1)的合成

取中间体8a(0.58g，2.0mmol)和三氟乙酸(3.5mmol)于2-BuOH(50mL)中，慢慢加入中间体3a(0.43g，2.0mmol)，升温至100℃，反应12h后，反应完毕，冷却，倒入饱和碳酸氢钠溶液中，析出固体，抽滤，水洗，硅胶柱层析分离，得唑代嘧啶衍生物I-1:

1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.19(s，1H)，9.45(s，1H)，9.23(s，1H)，8.10(d，J＝4.0Hz，1H)，7.96(s，1H)，7.63(d，J＝8.4Hz，2H)，7.50(d，J＝8.0Hz，1H)，7.44(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(t，J＝8.0Hz，1H)，6.98(d，J＝8.4Hz，2H)，6.73(s，1H)，6.48(dd，J＝18.0，10.0Hz，1H)，6.26(dd，J＝18.0，2.0Hz，1H)，5.75(dd，J＝10.0，2.0Hz，1H)，4.91(s，2H)，2.55(q，J＝7.5Hz，2H)，2.03(s，3H)，1.11(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)：δ163.59，155.84(d，J＝2.9Hz)，150.24(d，J＝10.9Hz)，147.98，141.18(d，J＝19.9Hz)，141.06(d，J＝245.9Hz)，140.68，139.60，139.50，134.56，132.39，130.16，129.07，127.84(2C)，127.29，119.14(2C)，117.84，116.62，115.23，113.76，48.43，19.81，13.85，12.59；HRMS(ESI)for C26H26FN7O，[M+H]⁺理论计算：472.2256，实测：472.2250。

实施例1.10唑代嘧啶衍生物(I-2)的合成

取中间体8b(0.62g，2.0mmol)和三氟乙酸(3.5mmol)于2-BuOH(50mL)中，慢慢加入中间体3a(2.0mmol)，升温至100℃，反应12小时后，反应完毕，冷却，倒入饱和碳酸氢钠溶液中，析出固体，抽滤，水洗，硅胶柱层析分离，得唑代嘧啶衍生物I-2：

1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.27(s，1H)，9.39(s，1H)，8.94(s，1H)，8.13(s，1H)，7.92(s，1H)，7.58(d，J＝8.5Hz)，7.52–7.24(m，3H)，6.98(d，J＝8.5Hz，2H)，6.72(s，1H)，6.48(m，dd，J＝16.0，12.0Hz，1H)，6.26(dd，J＝16.0，2.0Hz，1H)，5.75(dd，J＝12.0，2.0Hz，1H)，4.90(s，2H)，2.55(q，J＝7.5Hz，2H)，2.03(s，3H)，1.11(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)：δ163.62，158.04，156.59，155.19，147.95，140.26，139.62，139.29，134.38，132.39，130.37，128.97，127.81(2C)，127.28，119.6，119.50(2C)，116.65，115.85，115.51，104.45，48.45，19.75，13.72，12.55；HRMS(ESI)for C26H26ClN7O，[M+H]⁺理论计算：488.9839，实测：488.1952。

实施例1.11唑代嘧啶衍生物(I-3)的合成

取中间体8b(2.0mmol)和三氟乙酸(3.5mmol)于2-BuOH(50mL)中，慢慢加入中间体3b(0.37g，2.0mmol)，升温100℃，反应12小时后，反应完毕，冷却，倒入饱和碳酸氢钠溶液中，析出固体，抽滤，水洗，硅胶柱层析分离，得唑代嘧啶衍生物I-3：

1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.17(s，1H)，9.35(s，1H)，8.95(s，1H)，8.14(s，1H)，7.86(s，1H)，7.57(d，J＝8.0Hz，2H)，7.51-7.26(m，3H)，7.05(s，1H)，6.94(d，J＝8.0Hz，2H)，6.74(s，1H)，6.45(dd，J＝16.8，9.6Hz，1H)，6.25(d，J＝16.8Hz，1H)，5.76(d，J＝9.6Hz，1H)，4.96(s，2H)，2.21(s，3H)；HRMS(ESI)for C24H22ClN7O，[M+H]⁺理论计算：460.9308，实测：460.1659。

实施例1.12唑代嘧啶衍生物(I-4)的合成

取中间体8b(2.0mmol)和三氟乙酸(3.5mmol)于2-BuOH(50mL)中，慢慢加入中间体3c(0.37g，2.0mmol)，升温100℃，反应12小时后，反应完毕，冷却，倒入饱和碳酸氢钠溶液中，析出固体，抽滤，水洗，硅胶柱层析分离，得唑代嘧啶衍生物I-4：

1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.18(s，1H)，9.35(s，1H)，8.95(s，1H)，8.14(s，1H)，7.87(s，1H)，7.56(d，J＝7.6Hz，2H)，7.54-7.46(m，2H)，7.35-7.26(m，2H)，7.03(d，J＝7.6Hz，2H)，6.76(s，1H)，6.45(dd，J＝17.2，10.4Hz，1H)，6.26(d，J＝17.2Hz，1H)，5.75(d，J＝10.4Hz，1H)，4.93(s，2H)，2.04(s，3H)；HRMS(ESI)for C24H22ClN7O，[M+H]⁺理论计算:460.9308，实测：460.1636。

实施例1.13唑代嘧啶衍生物(I-5)的合成

取中间体8a(2.0mmol)和三氟乙酸(3.5mmol)于2-BuOH(50mL)中，慢慢加入中间体3b(2.0mmol)，升温至100℃，反应12小时后，冷却至室温，倒入饱和碳酸氢钠溶液中，析出固体，抽滤，水洗，硅胶柱层析分离，得唑代嘧啶衍生物I-5：

1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ10.27(s，1H)，9.39(s，1H)，8.94(s，1H)，8.13(d，J＝2.8Hz，1H)，7.90(d，J＝8.4Hz，2H)，7.62–7.47(m，2H)，7.36–7.23(m，2H)，6.94(d，J＝8.4Hz，2H)，6.73(s，1H)，6.52–6.43(m，1H)，6.26(dd，J＝18.0，2.0Hz，1H)，5.75(dd，J＝10.2，1.8Hz，1H)，4.90(s，2H)，2.03(s，3H)；HRMS(ESI)for C24H22FN7O，[M+H]⁺理论计算：444.4762，实测：444.1932。

实施例2唑代嘧啶衍生物的药学上可用的盐的制备

实施例2.1唑代嘧啶衍生物的无机酸盐的制备

取1mmol唑代嘧啶衍生物I-1溶于10mL无水甲醇中，在冰水浴下，慢慢滴加溴酸溶液(1mmol溴酸溶于5mL无水甲醇制得)，全部滴加完毕后，在冰水浴下搅拌30min，然后在常温下蒸除甲醇，得唑代嘧啶衍生物的溴酸盐。

取1mmol唑代嘧啶衍生物I-2溶于10mL无水甲醇中，在冰水浴下，慢慢滴加硝酸溶液(1mmol硝酸溶于5mL无水甲醇制得)，全部滴加完毕后，在冰水浴下搅拌30min，然后在常温下蒸除甲醇，得唑代嘧啶衍生物的硝酸盐。

实施例2.2唑代嘧啶衍生物的有机酸盐的制备

取1mmol唑代嘧啶衍生物I-3溶于10mL无水甲醇中，在冰水浴下，慢慢滴加马来酸溶液(1mmol马来酸溶于5mL干燥乙醚制得)，全部滴加完毕后，在冰水浴下搅拌30min，然后减压蒸除溶剂，得唑代嘧啶衍生物的马来酸盐。

取1mmol唑代嘧啶衍生物I-4溶于10mL无水甲醇中，在冰水浴下，慢慢滴加草酸溶液(1mmol草酸溶于5mL干燥乙醚制得)，全部滴加完毕后，在冰水浴下搅拌30min，然后减压蒸除溶剂，得唑代嘧啶衍生物的草酸盐。

取1mmol唑代嘧啶衍生物I-5溶于10mL无水甲醇中，在冰水浴下，慢慢滴加磺酸溶液(1mmol磺酸溶于5mL干燥乙醚制得)，全部滴加完毕后，在冰水浴下搅拌30min，然后减压蒸除溶剂，得唑代嘧啶衍生物的磺酸盐。

实施例3唑代嘧啶衍生物抑制效果实验

实施例3.1体外对受体酪氨酸激酶抑制活性实验

(1)制备激酶检测缓冲液

①室温下融解激酶检测缓冲液(Kinase Detection Buffer)，观察是否有沉淀。

②如果出现沉淀，就在37℃孵育(Kinase Detection Buffer)15min并摇动，溶解沉淀；或者小心吸出上清液，去除沉淀。

(2)制备激酶检测试剂

①使用前在室温平衡激酶检测缓冲液(Kinase Detection Buffe)和激酶检测底物(Kinase Detection Substrate)。

②将激酶检测缓冲液(Kinase Detection Buffer)全部倒进装有激酶检测底物(Kinase Detection Substrate)的棕色瓶中，使冻干粉底物溶解，制成激酶检测试剂。

③轻轻震荡、涡旋或颠倒混匀，成为均质溶液。

④激酶检测试剂配好后应立即使用，或分装在-20℃保存，以保留活性。

(3)制作ATP转化成ADP的标准曲线

①用1×激酶反应缓冲液(kinase reaction buffer)稀释试剂盒提供的ΜLtraPure ATP和ADP，制成900μL、50μM ATP和500μL、50μM ADP。

②将上一步配好的50μM ATP和50μM ADP溶液按表1所示配比在384孔板A1-A12中混合，模拟每个转化百分比的ATP和ADP的浓度。

表1. 50μM系列ATP+ADP标准品的制备配比

③每孔加入5μL的ADP-Glo^TM试剂来终止激酶反应，室温孵育40min。

④每孔加入10μL激酶检测试剂(Kinase Detection Reagent)将ADP转化成ATP，并引进萤光素酶和萤光素来检测ATP。

⑤在室温孵育30-60min，用多功能酶标仪测量萤光并记录萤光值。

⑥绘制ATP转化成ADP的标准曲线。

(4)确定激酶抑制物的IC₅₀值

①按照promega试剂盒说明书配制1×激酶反应缓冲液(kinase reactionbuffer)：2.5×50ng/μL激酶、2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

②在无酶对照孔中加入3μL1×激酶反应缓冲液(kinase reaction buffer)，2μL2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP；在阴性对照孔中加入1μL 1×激酶反应缓冲液(kinasereaction buffer)，2μL2.5×50ng/μL激酶，2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP；在测试孔中加入1μL 5×待测药物，2μL 2.5×50ng/μL激酶，2μL2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

③混合好后，孵育60min。

④每孔加入5μL的ADP-Glo^TM试剂来终止激酶反应，室温孵育40min。

⑤每孔加入10μL激酶检测试剂(Kinase Detection Reagent)将ADP转化成ATP，并引进萤光素酶和萤光素来检测ATP。在室温孵育30-60min，用多功能酶标仪测量萤光并记录萤光值。

⑥结果分析，结果如表2所示。

实施例3.2抑制BTK高表达细胞生长实验(CCK-8检测法)

(1)细胞接种：收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔5×103个细胞，每孔体积100μL接种到96孔板，每组设3个复孔(边缘孔用无菌PBS填充)；

(2)细胞培养：细胞接种后，对照组用10％FBS RPMI-1640培养，实验组分别用10μL不同浓度梯度的依鲁替尼(Ibrutinib)(1.25-40μmol/L)、各不同药物(1.25-40μmol/L)干预，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养；

(3)呈色：三组细胞分别于培养72h后加入10μL CCK-8溶液(5mg/mL)，4h后终止培养，于摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解；

(4)比色：在酶联免疫检测仪上测定各孔光度值(OD值)，选择450nm波长，以无细胞的即培养液空白孔调零，测各孔的吸光度值。实验重复三次；

(5)记录结果：细胞生长抑制率＝(对照组吸光度值一实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100％，细胞增殖率＝(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100；

(6)绘制细胞生长曲线：以时间为横坐标，抑制率/增殖率为纵坐标绘制细胞生长曲线。

(7)在GraphPad软件中的GraphPad Prism作图软件中针对抑制剂浓度做图，以便由log[抑制剂]相对于反应，可变斜率模型估算出IC₅₀。

测试结果如表2所示，表2显示了所获得的化合物在抑制BTK酪氨酸激酶和抗肿瘤细胞增殖中的活性效果。

表2.抑制BTK酪氨酸激酶和抗肿瘤细胞增殖中的活性结果

a：IC₅₀：半数有效抑制浓度；

b：Ramos、Raji、NAMALWA为典型B-淋巴细胞白血病细胞，HL60、U937为典型急性髓细胞白血病细胞。

结果显示，本发明中的分子对BTK激酶有较强的抑制效果，大部分化合物达到纳摩尔水平的活性级别。而且抗细胞增殖活性结果揭示，大部分化合物对淋巴细胞白血病细胞(Ramos、Raji、NAMALWA)、急性髓细胞白血病(HL60、U937)有非常有效的抑制作用。

实施例4吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色(AO/EB)

(1)细胞培养：常规扩大培养NAMALWA细胞和Ramos细胞，取对数生长期的细胞以2×105cells/孔的密度接种于6孔板中；

(2)药物处理：于次日用不同浓度的药物(抑制剂)处理状态良好的细胞48小时；具体药物及使用浓度如下表3：

表3.药物及使用浓度

(3)AO/EB染色：弃去培养液，用PBS洗两次，每孔以20μL AO/EB溶液(1μg/mL AO+1μg/mL EB in PBS)染色，倒置荧光显微镜下观察细胞各期凋亡、死亡等变化，拍照，结果如图1所示。

结果表明I-1作用于淋巴细胞白血病细胞NAMALWA细胞、Ramos细胞，可引起细胞凋亡的形态学改变，染色质高度浓缩使其细胞核着色不均匀，并且随着用药浓度的增加，细胞数量明显减少。

实施例5细胞毒性试验(PBMC检测法)

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)包含淋巴细胞、单核细胞，树突状细胞和其他少量细胞(造血干细胞等)。对其进行毒性试验可以证明本发明的药物是否对正常免疫细胞具有杀伤力。目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法，实验步骤如下：

(1)采血并稀释：静脉取血2mL，加入含ACD抗凝溶液的试管中，混匀，使血液抗凝。用PBS将抗凝血稀释一倍；

(2)加样：吸取2mL淋巴细胞分层液(天津TBD)置于刻度离心管中，将离心管倾斜45°角，用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰；

(3)离心：在18-20℃下，用水平离心机以2000r/min离心20min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层；

(4)回收：用毛细吸管轻轻插入浑浊带，沿管壁轻轻吸出此细胞层，移入另一只离心管中。既要吸取所有单个核细胞，又要避免吸入过多的分层液和血浆，以免混入其他细胞成分；

(5)洗涤：用PBS洗涤细胞三次。第一次用2000r/min，10min；第2～3次1500r/min，10min，可去掉大多数混杂的血小板；

(6)将沉淀细胞悬于培养基中备用；

(7)计数铺板：调整细胞悬液的浓度，以每孔2.5×105个细胞，每孔体积500μL接种在24孔板，每组设两个复孔；

(8)细胞培养：细胞接种后，对照组用10％FBS RPMI-1640培养，实验组分别用50μL不同浓度梯度的依鲁替尼(Ibrutinib)(1-5μmol/L)，活性药物(1-5μmol/L)干预，37℃，5％CO2培养箱中继续培养24h；

(9)染色：培养24h后加入20μL的1μg/μL AO(吖啶橙)，20μL的1μg/μL PI(碘化丙啶)染色5min，倒置荧光显微镜下观察并拍照；

测试结果如图2所示，图2是化合物I-1对PBMC的毒性数据。结果显示化合物I-1对正常人外周血单个核细胞细胞具有较低的细胞毒性。

实施例6细胞凋亡实验

(1)细胞培养：常规扩大培养Ramos细胞，取对数生长期的细胞以2x105cells/孔的密度接种于6孔板中；

(2)药物处理：于次日用不同浓度的药物(抑制剂)处理状态良好的细胞48小时，具体药物及使用浓度如表4：

表4药物及使用浓度

(3)细胞收集：将药物处理后的细胞收集，PBS洗涤细胞两次，每一处理组收集细胞总数不少于1×105个；

(4)凋亡检测：于收集好的细胞中加入5μLAnnexinV-FITC混匀后，再加入5μLPI；避光、室温反应10min；用流式细胞仪检测(Ex＝488nm；Em＝530nm)细胞凋亡情况，所得结果如图3所示。

结果显示，与对照组相比，加药组早期凋亡及晚期凋亡细胞数均有明显的增高。随着药物浓度的增加，发生早期凋亡和晚期凋亡的细胞数量也随之增加，并且在达到一定浓度时，细胞出现大量坏死。

实施例7细胞周期实验

(1)细胞培养：常规扩大培养Ramos细胞，取对数生长期的细胞以2×105cells/孔的密度接种于6孔板中；

(2)药物处理：于次日用不同浓度的药物(抑制剂)处理状态良好的细胞48小时，具体药物及使用浓度如表5：

表5药物及使用浓度

(3)细胞收集：将药物处理后的细胞收集，PBS洗涤细胞两次，每一处理组收集细胞总数不少于1×105个；

(4)周期检测：取固定好的细胞于染色前用PBS洗去固定液(1000rpm/min，5min)加入500μL染液(PI:RNase A＝1:9)，4℃避光孵育30min。以标准程序将样本上机检测，汞激发波长488nm，计数10000个细胞，结果用软件WinMDI Version 2.9分析，所得结果如图4所示。

结果显示，细胞明显被阻滞在G2/M期，化合物I-1能使DNA的复制受到阻碍，细胞难以继续增殖，并且效果优于依鲁替尼(Ibrutinib)。

实施例8蛋白质印迹法(Western Blotting)

实施例8.1细胞总蛋白提取

1、Ramos细胞扩大培养后，分别给予如表6常规药物处理，处理48小时：

表6药物及使用浓度

2、48小时后PBS洗细胞两次，加入150μL蛋白裂解液，涡旋仪上涡旋8～10次，冰上裂解35-40min；

3、裂解完成后，于4℃下12000rpm离心15min；

4、测定蛋白质浓度：采用碧云天Bradford蛋白浓度测定试剂盒；

5、将离心后的上清加入上样缓冲液，100℃5min，然后放于-80℃保存、备用。

实施例8.2细胞总蛋白定量(Bradford法)

1、制作标准曲线

(1)从-20℃取出1mg/mL BSA，室温融化后，备用。

(2)取6个1.5mL离心管，分别标记为0μg、2.5μg、5.0μg、10.0μg、20.0μg、40.0μg。

(3)按下表7在各管中加入各种试剂。

表7标准曲线制作的试剂用量

(4)混匀后，室温放置2min。在96孔板中加入以上每组样品，每孔200μL，每个浓度设三个复孔，于酶标仪595nm测定OD值，制备标准曲线。

2、检测样品蛋白含量

(1)取足量的1.5mL离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1mL。室温放置30min后即可用于测蛋白。

(2)取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100μL，混匀放置2min可做为空白样品，同上法测定OD值，实验重复三次，取均值。

(3)取一管考马斯亮蓝加95μL 0.15mol/L NaCl溶液和5μL待测蛋白样品，混匀后静置2min，同上法测定OD值，实验重复三次，取均值。

(4)根据标准曲线和样本吸光度换算得到待测样品蛋白质浓度。

实施例8.3十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

测定完蛋白含量后，计算含100μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5mL离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×(上样总体积一般不超过15μL，加样孔的最大限度可加20μL样品)。上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性，然后置于冰上，备用。

1、灌胶：在灌胶之前首先清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸取洗涤剂轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水反复冲洗干净至不挂水，最后用蒸馏水冲洗干净后站立晾干。

(1)玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。)

(2)配制10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10mL

移液枪吸取5mL胶沿玻璃以一定速度放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后在胶面上加一层水，液封后的胶凝速度大大提高。(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，以避免胶中出现气泡。加水液封时速度要慢，否则分离胶会被冲散、变形。)

(3)当水和胶之间出现折射线时，提示分离胶已凝。再等3min使胶充分凝固，倾去胶上层液封水，并用滤纸将水小心吸干，注意不要接触胶面。

(4)配制4％浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免产生气泡。插梳子时要尽量使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边垂直向上轻轻将其拔出。

(5)用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。(小玻璃面向内，大玻璃面向外。)

2、加样

(1)向电泳槽中加入足够的电泳缓冲液，准备上样。(电泳液至少要浸没内侧小玻璃上沿)

(2)取出预处理好的蛋白样品，用微量进样器贴壁吸取样品，注意不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染)

3、电泳

(1)插好电源，注意接头电极方向。

(2)设置恒压，60V(6V/cm)，当指示染料溴酚蓝前沿进入分离胶后，时间约30min，将电压提高到100-120V(15V/cm)，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，关闭电源，终止电泳。

实施例8.4转膜

1、准备工作

(1)转一张膜需准备6张7.0-8.3cm的滤纸和1张7.3-8.6cm的PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，避免手部蛋白污染膜。将切好的PVDF膜做好标记，置于水中浸泡2小时。(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。

(2)将转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻璃棒、滤纸和浸湿的膜放入加有转移缓冲液的搪瓷盘里。

(3)将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上)，一手固定滤纸一手用玻璃棒擀去其中的气泡。

2、取胶

(1)于玻璃板两个边上轻轻将其撬开，小心取下玻璃板。将浓缩胶轻轻切去(浓缩胶影响操作)，避免把分离胶刮破，在分离胶的左上角切一个斜角作为标记。

(2)将分离胶浸于转移缓冲液中进行平衡。

3、转膜

(1)将平衡后的分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除去气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路(转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验空间保持空气流通)。

(2)将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，可以在槽的一边放置冰块降温(100V/100mA)。

(3)转膜完毕后将膜用1×丽春红染液染色5min(于脱色摇床上摇)，然后用水冲洗掉没染上的染液就可观察膜上的蛋白，将膜晾干备用。

实施例8.5免疫反应

1、封闭

(1)配制封闭液(5％脱脂牛奶in TBST)。

(2)将膜用TBST从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上缓慢摇动，室温封闭2小时。

2、一抗结合

(1)配制一抗稀释液：5％BSA in TBST，调整pH为7.4，以保证抗原抗体反应于适宜的pH条件下进行)。

(2)把膜从封闭液里取出，用TBST冲洗一遍后，浸没于含一抗(抗体稀释比例如下表8)的杂交盒里，置于4℃摇床上缓慢摇动，孵育过夜。磷酸化抗体至少孵育12小时。其他抗体也可室温孵育2-3h。

表8抗体稀释比例

3、二抗结合

(1)一抗孵育结束后，回收一抗，并于-20℃保存。将PVDF膜用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。

(2)根据一抗的来源选择相应的二抗，将二抗用封闭液进行一定比例的稀释(1:2000-1:5000)，室温孵育1-2h。

4、化学发光，显影，定影

(1)二抗孵育结束后，可进行二抗的回收再利用，使用两次后弃去。膜用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。

(2)准备好曝光盒、显色液及保鲜膜等。

(3)将ECL-A和ECL-B两种试剂在保鲜膜上进行等体积混合；1min后，将PVDF膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去除残余液体，包裹好，放入X-光片夹中。

(4)在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中；在红灯下取出X-光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)；打开X-光片夹，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能再移动，关闭X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以取得最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1-2min(20-25℃)，温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间；显影结束后，马上将X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5-10min，以胶片呈透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。(注意：显影和定影需移动胶片时，尽量拿取胶片的一角，手指甲不要划伤胶片，否则将会对结果产生影响。)

5、凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象分析软件(Quantity One)分析目标条带的分子量和光密度值，所得结果如图5所示。

结果显示，化合物I-1能够显著抑制细胞中BTK通路相关蛋白的表达，p-BTK的水平则随着药物浓度的升高，受到了明显的抑制。

以上实施例结果表明，本发明中的唑类嘧啶衍生物对BTK激酶有较强的抑制效果，大部分化合物达到纳摩尔水平的活性级别，且有一些唑类嘧啶衍生物的有效抑制浓度IC₅₀值在10nmol左右，与依鲁替尼(Ibrutinib)相当。抗细胞增殖活性结果显示，化合物对淋巴细胞白血病细胞(Ramos、Raji、NAMALWA)、急性髓细胞白血病(HL60、U937)有非常有效的抑制作用，其中唑类嘧啶衍生物I-1、I-2、I-5对Raji、NAMALWA细胞显示出了优于依鲁替尼(Ibrutinib)的活性，I-1、I-2、I-3、I-4、I-5都对HL60、U937细胞显示出优于阿糖胞苷(Cytarabine)的活性，这些效果是本领域技术人员无法预料的。AO/EB荧光双染法结果表明唑类嘧啶衍生物I-1作用于淋巴细胞白血病细胞NAMALWA细胞、Ramos细胞，可引起细胞凋亡的形态学改变，并且随着用药浓度的增加，细胞数量明显减少，早期凋亡和晚期凋亡细胞数量明显增加，其作用优于依鲁替尼(Ibrutinib)。同时图2显示，唑类嘧啶衍生物I-1的细胞毒性也非常小，在保证药物活性的同时减轻药物的毒性，具有潜在的药用价值。流式凋亡分析结果显示唑类嘧啶衍生物I-1能使淋巴细胞白血病细胞Ramos细胞的凋亡率明显增加，呈剂量依赖性，并且在达到一定浓度时，细胞出现大量坏死，提示I-1通过诱导细胞发生凋亡从而达到抑制肿瘤的作用优于依鲁替尼(Ibrutinib)。同时流式周期结果显示，唑类嘧啶衍生物I-1能使Ramos细胞周期发生改变，将细胞阻滞在G2/M期，使其增殖收到抑制，效果优于依鲁替尼(Ibrutinib)。蛋白质印迹实验表明，I-1能够显著抑制BTK信号通路中相关蛋白的表达，随着给药浓度的逐渐增大，p-BTK表达水平下调，呈现出剂量依赖性。预示此类唑类嘧啶衍生物具有开发成新型高效BTK抑制剂的潜力，对治疗相关的恶性肿瘤疾病尤其是慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病和急性髓细胞白血病有较大的应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种如式(I)所述的化合物或者药学上可接受的盐：

其中，

R₁选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基；

R₂选自H、C1-C6烷基或C3-C8环烷基；

R₃选自卤素；

其中，R₁和R₂不能同时为H。

2.根据权利要求1所述的化合物或者药学上可接受的盐，其特征在于，R₁选自H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃或CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃；R₂选自H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃或CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃；R₃选自F、Cl、Br或I；其中，R₁和R₂不能同时为H。

3.根据权利要求1所述的化合物或者药学上可接受的盐，其特征在于，R₁选自H、CH₃或CH₂CH₃；R₂选自H、CH₃或CH₂CH₃；R₃选自F或Cl；其中，R₁和R₂不能同时为H。

4.根据权利要求1所述的化合物或者药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物选自式(I-1)-式(I-5)中的一种：

5.一种药物组合物，其特征在于，包括有效剂量的权利要求1所述的化合物或者药学上可接受的盐及药用载体。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括有效剂量的(I-1)-式(I-5)任一式所示的化合物或其药学上可接受的盐，及药用载体。

7.权利要求1所述的化合物或者药学上可接受的盐或权利要求5所述的药物组合物在制备布鲁顿氏酪氨酸激酶抑制剂中的应用。

8.权利要求1所述的化合物或者药学上可接受的盐或权利要求5所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病和急性髓细胞白血病中的一种或多种。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用通过抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶实现。

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