CN108721611A - 一种疏水性蛋白酶油制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种疏水性蛋白酶油制剂及其制备方法和应用，属于蛋白酶油制剂技术领域。本发明所述疏水性蛋白酶油制剂包含以下重量百分比浓度的组分：蛋白酶脂质复合物0.1～10％，抗菌中药提取物0.1～30％和油相60～99％。经过6个月的稳定性实验，本发明所述疏水性蛋白酶油制剂的酶活性保留率大于95％，稳定性良好；蛋白酶几乎全存在于油相中，8h时释放到鲜牛奶中的蛋白酶量小于10％。本发明蛋白酶油制剂对金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均大小为19.36mm，抑菌效果良好；且对奶牛乳房炎的总有效率达到了100％，总治愈率为85.83％。

Description

一种疏水性蛋白酶油制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白酶油制剂领域，具体涉及一种疏水性蛋白酶油制剂及其制备方法和应用。
背景技术
奶牛乳房炎是奶牛最常见、防治最难、花费最多的第一大疾病，给奶牛业生产造成了严重的危害，严重影响牛奶的品质，间接影响人体健康。病原微生物感染是引起奶牛乳房炎的主要原因，其中以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，约占奶牛乳房炎病例的90％以上。其中金黄色葡萄球菌则是引起乳房炎的最主要病原菌，也是临床上最难治疗造成经济损失最大的致病菌，可致人或动物的各种化脓性疾病、乳腺炎、败血症等。
目前世界上治疗奶牛乳房炎以抗生素为主，抗生素可快速杀死或抑制细菌的繁殖，但因牛奶中有抗生素残留，弃奶周期长使治疗成本增大。另外，奶牛乳房炎炎症坏死组织无法去除干净而覆盖乳腺，既阻止了抗生素进入奶牛乳腺内杀死细菌，延缓乳房炎治疗时间，同时又因炎症组织的存在导致抗生素治疗奶牛乳房炎易复发。由于抗生素的大量使用，耐药菌株不断出现，尤其是金黄色葡萄球菌对多种抗生素产生耐药性，且耐药性呈明显上升趋势，奶牛乳房炎越来越难以治疗。
近年，针对奶牛乳房炎的治疗现状及问题，国内外科学家逐渐采用一些安全、有效的生物疗法，通过一些细胞因子、溶菌酶以及疫苗等生物制剂用来防治奶牛乳房炎及子宫内膜炎，既能治疗疾病，又没有抗生素残留的问题。中国专利ZL 200510028617.5及201010579869.8公开了一种溶葡萄球菌酶冻干粉剂可用于治疗奶牛子宫内膜炎及乳房炎。溶菌酶在奶牛疾病中的治疗主要以注射用粉剂，现配酶水溶液局部灌注的给药方式，溶菌酶在局部组织中迅速释放，但由于酶的生物体内半衰期比较短，容易在短时间内失活，达不到预想的治疗效果。另外由于局部灌注环境存在大量的体液，水溶性的制剂很快分散于体液中，不能充分渗透进入炎症的组织中去，严重影响酶的治疗效果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种稳定的疏水性蛋白酶油制剂，可以有效的漂浮于奶液上表面，粘附于奶牛乳腺表面，能更好的与炎症组织接触进渗透炎症组织内部，将炎症坏死组织水解去除干净，同时又能有效杀灭奶牛乳房中细菌，提高奶牛乳房炎的治疗治疗效果及缩短治疗时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种疏水性蛋白酶油制剂，包含以下重量百分比浓度的组分：疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物0.1～10％，抗菌中药提取物0.1～30％，油相调节剂0～10％，稳定剂0～0.5％和油相60～99％。
优选的，所述疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物的制备用原料包括蛋白酶和阴离子脂质；所述疏水性蛋白酶脂质-阴离子复合物的制备方法包括：提供蛋白酶水溶液和阴离子脂质水溶液；在10～40℃的条件下，将所述蛋白酶水溶液与阴离子脂质水溶液磁力搅拌混合，固液分离所述混合得到的料液，收集沉淀，冷冻干燥所述沉淀得到疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物。
优选的，所述阴离子脂质包括油酸钠、棕榈酸钠、月桂酸钠、十二烷基磺酸钠、多库酯钠、胆酸钠或脱氧胆酸钠。
优选的，所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、舍雷肽酶、枯草杆菌蛋白酶、黑曲霉蛋白酶、无花果蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶、溶菌酶、溶葡萄球菌酶、几丁质酶和β-葡聚糖酶中的一种或多种。
优选的，所述油相包括辛酸三甘油酯、癸酸三甘油酯、辛酸丙二醇二酯、癸酸丙二醇二酯、油酸三甘油酯、单月桂酸甘油酯、单辛酸甘油酯、单癸酸甘油酯、辛酸丙二醇二酯、癸酸丙二醇二酯、硅油、大豆油、橄榄油、芝麻油、玉米油、花生油、棕榈油和蓖麻油中的一种或多种。
优选的，所述抗菌中药提取物包括迷迭香提取物、肉桂油、丁香油、当归油、川芎油、牛至油、大蒜油、厚朴油和百里香油中的一种或多种。
优选的，所述油相调节剂包括：疏水性气相二氧化硅、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油和聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯中的一种或多种。
优选的，所述稳定剂包括：维生素E、维生素E醋酸酯、维生素A、维生素A棕榈酸酯、维生素A醋酸酯和维生素D3中的一种或多种。
优选的，所述疏水性蛋白酶油制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将抗菌中药提取物、稳定剂与油相在30～80℃下混合，形成混合油相；
2)将步骤1)得到的混合油相与疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物和油相调节剂在10～40℃下混合，球磨均质或高压均质形成疏水性蛋白酶油制剂。
本发明提供了一种利用上述的疏水性蛋白酶油制剂或上述制备方法制备得到的疏水性蛋白酶油制剂在制备预防和/或治疗奶牛乳房炎药物中的应用。
本发明提供了一种疏水性蛋白酶油制剂，与水不互溶，可以漂浮并铺展于水或鲜奶表面，利于蛋白酶接触乳房炎炎症组织；蛋白酶可以水解炎症坏死组织与中草药抗菌功能产生协调增效，蛋白酶去除炎症坏死组织的同时更利于中草药抗菌成分进入乳腺组织抗菌；可以避免抗生素治疗，从而解决牛奶抗生素存在的问题，具有较高的治疗效果。疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物改变了蛋白酶的亲水性，增加了蛋白酶的疏水性，阻止了蛋白酶从油制剂中释放到鲜奶中，也阻止了乳房中自然存在的蛋白酶对本油制剂中疏水性蛋白酶的水解，增加了蛋白酶的稳定性，延长了蛋白酶的半衰期。中草药抗菌为脂溶性，不溶于鲜奶中，同样可以漂浮于鲜奶表面，更能充分与乳房炎炎症组织，杀灭细菌。
具体实施方式
本发明提供了一种疏水性蛋白酶油制剂，包含以下重量百分比浓度的组分：疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物0.1～10％，抗菌中药提取物0.1～30％，油相调节剂0～10％，稳定剂0～0.5％和油相60～99％。
在本发明的疏水性蛋白酶油制剂中，所述疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物的重量百分比浓度优选的为0.3～5％，更优选的为0.5～3％，最优选的为1％。本发明所述疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物的制备用原料包括蛋白酶和阴离子脂质；制备方法优选的包括：提供蛋白酶水溶液和阴离子脂质水溶液；在10～40℃的条件下，将所述蛋白酶水溶液与阴离子脂质水溶液磁力搅拌混合，固液分离所述混合得到的料液，收集沉淀，冷冻干燥所述沉淀得到疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物。
在本发明中，蛋白酶水溶液与阴离子脂质水溶液优选以相同的体积混合。在本发明中，所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的摩尔浓度优选的为0.01～0.05mM，更优选的为0.015～0.03mM，最优选的为0.02mM。本发明所述蛋白酶水溶液的pH优选的为4.5～6，更优选的为4.8～5.5，最优选的为5。本发明对所述蛋白酶水溶液的pH调节方法并没有特殊限定，利用本领域的常规手段即可。
本发明所述蛋白酶优选的包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、舍雷肽酶、枯草杆菌蛋白酶、黑曲霉蛋白酶、无花果蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶、溶菌酶、溶葡萄球菌酶、几丁质酶和β-葡聚糖酶中的一种或多种。本发明对所述蛋白酶的来源没有特殊限定，可以来源于动植物提取，也可以来源于微生物发酵或通过基因重组表达纯化制备得到。
本发明所述阴离子脂质水溶液的摩尔浓度优选的为1.5～5mM，更优选的为2～3.5mM，最优选的为3mM。本发明所述阴离子脂质优选的包括油酸钠、棕榈酸钠、月桂酸钠、十二烷基磺酸钠、多库酯钠、胆酸钠或脱氧胆酸钠。本发明所述磁力搅拌混合的时间优选的为1～60min，更优选的为20～40min，最优选的为30min。
本发明磁力搅拌混合时的温度优选的为15～38℃，更优选的为20～30℃，最优选的为25℃。磁力搅拌混合完成后，固液分离所述混合得到的料液，收集沉淀，冷冻干燥得到疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物。本发明所述固液分离优选的为离心，所述离心的离心力优选的为6000～12000g，更优选的为7500～8500g，最优选的为8000g；所述离心的时间优选的为1～30min，更优选的为10～20min，最优选的为15min。本发明对所述冷冻干燥的仪器及条件没有特殊限定，利用本领域的常规手段即可。本发明所述疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物，可增加蛋白酶的疏水性，以便蛋白酶与炎症组织接触并渗透炎症组织内部，将炎症坏死组织水解去除干净。
本发明所述抗菌中草药提取物的重量百分比浓度优选的为1～20％，更优选的为5～15％，最优选的为8～10％。本发明所述抗菌中药提取物包括迷迭香提取物、肉桂油、丁香油、当归油、川芎油、牛至油、大蒜油、厚朴油和百里香油中的一种或多种。本发明对所述抗菌中药提取物的来源并没有特殊限定，优选的来源于市售产品。
本发明所述油相的重量百分比浓度优选的为65～95％，更优选的为70～90％，最优选的为75～85％。本发明所述油相优选的包括辛酸三甘油酯、癸酸三甘油酯、辛酸丙二醇二酯、癸酸丙二醇二酯、油酸三甘油酯、单月桂酸甘油酯、单辛酸甘油酯、单癸酸甘油酯、辛酸丙二醇二酯、癸酸丙二醇二酯、硅油、大豆油、橄榄油、芝麻油、玉米油、花生油、棕榈油和蓖麻油中的一种或多种。
本发明所述疏水性蛋白酶油制剂还包括重量百分比浓度为0～10％的油相调节剂和0～0.5％的稳定剂。在本发明中，所述油相调节剂在疏水性蛋白酶油制剂中的质量百分比浓度更优选为0.5～5％，最优选为2.5％。本发明所述油相调节剂优选的包括：疏水性气相二氧化硅、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油和聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯中的一种或多种。本发明所述油相调节剂可以调节油相的表面张力，利于油相在乳房奶液表面铺展，并能充分与乳房乳腺炎症组织充分接触。
在本发明中，所述稳定剂在疏水性蛋白酶油制剂中的质量百分比浓度优选为0.1～0.4％，更优选为0.2～0.3％，最优选为0.25％。本发明所述稳定剂优选包括：维生素E、维生素E醋酸酯、维生素A、维生素A棕榈酸酯、维生素A醋酸酯和维生素D3中的一种或多种。本发明所述稳定剂可以稳定蛋白酶不被氧化，提高蛋白酶的稳定性。
本发明还提供了一种上述技术方案所述疏水性蛋白酶油制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将抗菌中药提取物与油相和稳定剂在30～80℃下混合，形成混合油相；
2)将步骤1)得到的所述混合油相与疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物和油相调节剂在10～40℃下混合，球磨均质或高压均质形成疏水性蛋白酶油制剂。
本发明在制备疏水性蛋白酶油制剂时，将抗菌中药提取物与油相和稳定剂在30～80℃下混合，形成混合油相。本发明所述混合的温度优选为35～60℃，更优选为40-50℃，最优选为45℃。本发明所述混合的时间优选为10～60min，更优选为20～40min，最优选为30min。
形成混合油相后，本发明将上述混合油相与蛋白酶脂质复合物和油相调节剂在10～40℃下混合，球磨均质或高压均质形成疏水性蛋白酶油制剂。本发明所述含抗菌成分的油相与蛋白酶脂质复合物混合的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃，最优选为25℃。本发明所述混合的时间优选为10～50min，更优选为20～40min，最优选为30min。本发明所述球磨均质的转速优选的为300～1000rpm，更优选的为400～800rpm，最优选的为500～600rpm，所述球磨均质的时间优选的为10～30min，更优选的为15～25min，最优选的为20min。本发明所述球磨的粒径优选的为3～10μm，更优选的为4～8μm，最优选的为5～6μm。本发明所述高压均质的压力优选的为200～1200bar，更优选的为400～1000bar，最优选的为600～800bar，所述高压均质的循环次数优选的为1～8次，更优选的为2～6次，最优选的为3～5次。本发明对高压均质或球磨均质的仪器并没有特殊限定，球磨均质时优选的利用PM-100球磨仪，高压均质时优选的利用Niro NS1001L仪器。本发明在所述均质后，得到的疏水性蛋白酶油制剂的平均粒径优选的为3～6μm。
本发明提供了一种利用上述疏水性蛋白酶油制剂和上述制备方法制备得到的疏水性蛋白酶油制剂在制备预防或治疗奶牛乳房炎药物中的应用。本发明所述疏水性蛋白酶油制剂的使用体积优选的为5～20ml，所述药物的剂型包括油灌注剂，将油灌注剂注射器缓慢推入奶牛乳房内，并用手轻柔奶牛乳房利于油制剂迅速在乳房内铺展。
下面结合实施例对本发明提供的疏水性蛋白酶油制剂及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)10℃下，将10ml的2.5mM的十二烷基磺酸钠，在50rmp磁力搅拌条件下缓慢加入pH为5的10ml的0.02mM的糜蛋白酶溶液中，糜蛋白酶溶液变为浑浊状，8000g离心，收集沉淀，冷冻干燥脱除水分后得到糜蛋白酶十二烷基磺酸复合物；
2)在40℃条件下，将2g肉桂油加入到97g的大豆油中，搅拌均匀形成抗菌油相；
3)在20℃条件下，将1g糜蛋白酶油酸复合物加入步骤2制备的抗菌油相，置于PM-100球磨仪(德国RETSCH)中，转速为300r/min，球磨30min，得到平均粒径为5.2μm的均一糜蛋白酶油酸复合物油制剂。
实施例2
1)15℃条件下，将10ml的5mM的油酸钠，在100rmp磁力搅拌条件下缓慢加入pH为5.5的10ml的0.03mM的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶溶液变为浑浊状，8000g离心，收集沉淀，并将沉淀通过冷冻干燥脱除水分即可得到胰蛋白酶油酸复合物；
2)在60℃条件下，将1g丁香油加入到98.5g的辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌均匀形成油相；
3)在25℃条件下，将0.5g胰蛋白酶十二烷基磺酸复合物加入步骤2制备的油相，置于PM-100球磨仪(德国RETSCH)中，转速为500r/min，球磨20min，得到平均粒径为3.8μm的均一胰蛋白酶油酸复合物油制剂。
实施例3
1)18℃条件下，将10ml的2mM的多库酯钠，在50rmp磁力搅拌条件下缓慢加入pH为5的10ml的0.02mM的菠萝蛋白酶溶液中，菠萝蛋白酶溶液变为浑浊状，8000g离心，收集沉淀，并将沉淀通过冷冻干燥脱除水分即可得到菠萝蛋白酶多库酯复合物；
2)在80℃条件下，将5g迷迭香提取物加入到92g的辛酸/癸酸丙二醇二酯中，搅拌均匀形成油相；
3)在25℃条件下，将3g菠萝蛋白酶多库酯复合物加入步骤2制备的油相，置于PM-100球磨仪(德国RETSCH)中，转速为800r/min，球磨20min，得到平均粒径为3.1μm的均一菠萝蛋白酶多库酯复合物油制剂。
实施例4
1)22℃条件下，将10ml的2mM的多库酯钠，在50rmp磁力搅拌条件下缓慢加入pH为5的10ml的0.02mM的菠萝蛋白酶溶液中，菠萝蛋白酶溶液变为浑浊状，8000g离心，收集沉淀，并将沉淀通过冷冻干燥脱除水分即可得到菠萝蛋白酶多库酯复合物；
2)在30℃条件下，将10g丁香油、0.3g维生素A棕榈酸酯加入到88.2g的芝麻油中，搅拌均匀形成油相；
3)在25℃条件下，将0.5g菠萝蛋白酶多库酯复合物及1g糜蛋白酶油酸复合物加入步骤2制备的油相，置于PM-100球磨仪(德国RETSCH)中，转速为1000r/min，球磨20min，得到平均粒径为4.1μm的均一复合蛋白酶油制剂。
实施例5
1)25℃条件下，将10ml的2mM的多库酯钠，在50rmp磁力搅拌条件下缓慢加入pH为5的10ml的0.02mM的菠萝蛋白酶溶液中，菠萝蛋白酶溶液变为浑浊状，8000g离心，收集沉淀，并将沉淀通过冷冻干燥脱除水分即可得到菠萝蛋白酶多库酯复合物；
2)在40℃条件下，将20g当归油、0.5g维生素E及10g疏水气相二氧化硅加入到68g的硅油中，搅拌均匀形成油相；
3)在10℃条件下，将0.5g菠萝蛋白酶多库酯复合物、0.5g胰蛋白酶油酸及1g糜蛋白酶油酸复合物加入步骤2制备的油相，置于PM-100球磨仪(德国RETSCH)中，转速为500r/min，球磨20min，得到平均粒径为3.6μm的均一复合蛋白酶油制剂。
实施例6
1)28℃条件下，将10ml的2.5mM的十二烷基磺酸钠，在50rmp磁力搅拌条件下缓慢加入pH为5的10ml的0.02mM的糜蛋白酶溶液中，糜蛋白酶溶液变为浑浊状，8000g离心，收集沉淀，并将沉淀通过冷冻干燥脱除水分即可得到糜蛋白酶十二烷基磺酸复合物；
2)在40℃条件下，将2g肉桂油及2g疏水气相二氧化硅加入到95g的花生油中，搅拌均匀形成油相；
3)在20℃条件下，将1g糜蛋白酶油酸复合物加入步骤2制备的油相，置于PM-100球磨仪(德国RETSCH)中，转速为300r/min，球磨30min，得到平均粒径为5.8m的均一糜蛋白酶油酸复合物油制剂。
实施例7
1)32℃条件下，将10ml的5mM的油酸钠，在100rmp磁力搅拌条件下缓慢加入pH为5.5的10ml的0.03mM的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶溶液变为浑浊状，8000g离心，收集沉淀，并将沉淀通过冷冻干燥脱除水分即可得到胰蛋白酶油酸复合物；
2)在60℃条件下，将1g丁香油及0.5g聚氧乙烯氢化蓖麻油加入到98g的硅油中，搅拌均匀形成油相；
3)在25℃条件下，将0.5g胰蛋白酶十二烷基磺酸复合物加入步骤2制备的油相，置于PM-100球磨仪(德国RETSCH)中，转速为500r/min，球磨20min，得到平均粒径为3.9μm的均一胰蛋白酶油酸复合物油制剂。
实施例8
1)38℃条件下，将10ml的2mM的多库酯钠，在50rmp磁力搅拌条件下缓慢加入pH为5的10ml的0.02mM的菠萝蛋白酶溶液中，菠萝蛋白酶溶液变为浑浊状，8000g离心，收集沉淀，并将沉淀通过冷冻干燥脱除水分即可得到菠萝蛋白酶多库酯复合物；
2)在30℃条件下，将10g丁香油、0.3g维生素A棕榈酸酯及5g大豆卵磷脂加入到83.2g的油酸甘油三脂中，搅拌均匀形成油相；
3)在25℃条件下，将0.5g菠萝蛋白酶多库酯复合物及1g糜蛋白酶油酸复合物加入步骤2)制备的油相，置于PM-100球磨仪(德国RETSCH)中，转速为1000r/min，球磨20min，得到平均粒径为4.6μm的均一复合蛋白酶油制剂。
对实施例1～8制备得到的疏水性蛋白酶油制剂进行实验：
稳定性测试：
分别取实施例1～8所制备的蛋白酶油制剂20ml密封于西林瓶中，置于稳定性试验箱中，在温度40±2℃，湿度是75±5％的条件下保存6个月，然后分别对各样品进行酶活性检测，各实施例样品的酶活性保留率均大于95％。
酶活性测试：
分别选取实施例1～8制备的蛋白酶油制剂10ml加入90ml鲜牛奶，置于密闭的烧瓶中，50rmp磁力搅拌，分别在2h、4h及8h各取1ml溶液，4000rmp离心，分别检测上层油层及下层水层中蛋白酶活性，检测结果如表1所示：
表1.蛋白酶活性
从表1上层油层与下层水层中蛋白酶活性占比数据分析可知，通过疏水离子对技术形成蛋白酶油酸复合物后，蛋白酶复合物油制剂与鲜牛奶混合搅拌过程中，蛋白酶基本保留于油层中，而释放到鲜牛奶中的蛋白酶8h时小于10％。
抑菌活性测试：
参照WST 125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准采用纸片琼脂法测试了实施例1～8的疏水性蛋白酶油制剂对金黄色葡萄球球菌的抑菌作用，其抑菌圈大小如表2所示：
表2.抑菌圈大小(mm)
从表2的抑菌圈数据可知，本发明的蛋白酶油制剂具有抗菌作用。
治疗效果测试：
测试实施例1～8制备得到的疏水性蛋白酶油制剂用于奶牛乳房炎的治疗效果：选取15例自然发病的乳房炎的奶牛，乳房内灌注实施例制备的糜蛋白酶油制剂，治疗每天治疗1次，每次10ml，连续3天治疗效果如表3所示：
表3.疏水性蛋白酶油制剂的治疗效果
从表3的治疗效果可知，本发明的蛋白酶油制剂对奶牛乳房炎的总有效率达到了100％，总治愈率为85.83％。
由以上实施例可知，本发明提供了一种疏水性蛋白酶油制剂，6个月稳定性实验，酶活性保留率大于95％，稳定性良好；蛋白酶几乎全存在于油相中，8h时释放到鲜牛奶中的蛋白酶量小于10％；蛋白酶油制剂对金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均大小为19.36mm，抑菌效果良好；蛋白酶油制剂对奶牛乳房炎的总有效率达到了100％，总治愈率为85.83％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种疏水性蛋白酶油制剂，包含以下重量百分比浓度的组分：疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物0.1～10％，抗菌中药提取物0.1～30％，油相调节剂0～10％，稳定剂0～0.5％和油相60～99％。
2.根据权利要求1所述的疏水性蛋白酶油制剂，其特征在于，所述疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物的制备用原料包括蛋白酶和阴离子脂质；所述疏水性蛋白酶脂质-阴离子复合物的制备方法包括：提供蛋白酶水溶液和阴离子脂质水溶液；在10～40℃的条件下，将所述蛋白酶水溶液与阴离子脂质水溶液磁力搅拌混合，固液分离所述混合得到的料液，收集沉淀，冷冻干燥所述沉淀得到疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物。
3.根据权利要求2所述的疏水性蛋白酶油制剂，其特征在于，所述阴离子脂质包括油酸钠、棕榈酸钠、月桂酸钠、十二烷基磺酸钠、多库酯钠、胆酸钠或脱氧胆酸钠。
4.根据权利要求2所述的疏水性蛋白酶油制剂，其特征在于，所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、舍雷肽酶、枯草杆菌蛋白酶、黑曲霉蛋白酶、无花果蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶、溶菌酶、溶葡萄球菌酶、几丁质酶和β-葡聚糖酶中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的疏水性蛋白酶油制剂，其特征在于，所述油相包括辛酸三甘油酯、癸酸三甘油酯、辛酸丙二醇二酯、癸酸丙二醇二酯、油酸三甘油酯、单月桂酸甘油酯、单辛酸甘油酯、单癸酸甘油酯、辛酸丙二醇二酯、癸酸丙二醇二酯、硅油、大豆油、橄榄油、芝麻油、玉米油、花生油、棕榈油和蓖麻油中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的疏水性蛋白酶油制剂，其特征在于，所述抗菌中药提取物包括迷迭香提取物、肉桂油、丁香油、当归油、川芎油、牛至油、大蒜油、厚朴油和百里香油中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的疏水性蛋白酶油制剂，其特征在于，所述油相调节剂包括：疏水性气相二氧化硅、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油和聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的疏水性蛋白酶油制剂，其特征在于，所述稳定剂包括：维生素E、维生素E醋酸酯、维生素A、维生素A棕榈酸酯、维生素A醋酸酯和维生素D3中的一种或多种。
9.权利要求1～8任一项所述的疏水性蛋白酶油制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将抗菌中药提取物、稳定剂与油相在30～80℃下混合，形成混合油相；
2)将步骤1)得到的混合油相与疏水性蛋白酶-阴离子脂质复合物和油相调节剂在10～40℃下混合，球磨均质或高压均质形成疏水性蛋白酶油制剂。
10.权利要求1～3和权利要求5～8任一项所述的疏水性蛋白酶油制剂或权利要求9所述的制备方法制备得到的疏水性蛋白酶油制剂在制备预防和/或治疗奶牛乳房炎药物中的应用。
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