CN108721304B

CN108721304B - 用于治疗肿瘤的药物组合物及其用途

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Publication number: CN108721304B
Application number: CN201710247814.9A
Authority: CN
Inventors: 周田彦; 葛泽梅; 姚庆宇; 李润涛
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2017-04-17
Filing date: 2017-04-17
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2037-04-17
Also published as: CN108721304A

Abstract

本发明的目的是提供一种用于治疗肿瘤的、包含4‑甲基哌嗪‑1‑二硫代甲酸‑(3‑氰基‑3,3‑二苯基)丙酯盐酸盐和地塞米松的药物组合物。本发明还涉及该药物组合物在治疗肿瘤方面的用途。

Description

用于治疗肿瘤的药物组合物及其用途

技术领域

本发明属于药物领域，具体而言涉及一种用于治疗肿瘤的、包含4-甲基哌嗪-1-二硫代甲酸-(3-氰基-3,3-二苯基)丙酯盐酸盐和地塞米松的药物组合物。本发明还涉及该药物组合物在治疗肿瘤方面的用途。

背景技术

4-甲基哌嗪-1-二硫代甲酸-(3-氰基-3,3-二苯基)丙酯盐酸盐(TM208)具有如下通式(I)的结构，是一种哌嗪基二硫代甲酸酯类化合物。现有技术中已经报道了TM208具有良好的体内抗肿瘤作用，且毒性较低。例如，李润涛等人在发明专利公开号为CN1328999A的中国发明专利中已经对TM208的制备方法以及在抗肿瘤药物中的应用进行了描述，以引用的方式将其整体内容并入本文。

在现有技术水平的基础上，为了进一步研究TM208的应用、为TM208的临床试验提供依据，本领域中对于TM208与其它肿瘤抑制药物联用能否提高疗效并降低毒性的探索仍存在实际需求。

发明内容

本发明人进行了大量实验研究，出人意料地发现通过提供TM208与地塞米松的药物组合物，可有效提高抗肿瘤效果，其联合用药效果明显高于单药作用，从而完成了本发明。

在一个方面，本发明提供了一种用于治疗肿瘤的、包含4-甲基哌嗪-1-二硫代甲酸-(3-氰基-3,3-二苯基)丙酯盐酸盐和地塞米松的药物组合物。

在优选的实施方式中，本发明的药物组合物中，4-甲基哌嗪-1-二硫代甲酸-(3-氰基-3,3-二苯基)丙酯盐酸盐和地塞米松的重量比为1:50至100:1。

在本发明的实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

在另一方面，本发明还提供了上述药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物方面的用途。在优选的实施方式中，所述肿瘤优选选自于由肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、结肠癌、白血病、卵巢癌、胰腺癌和上皮癌所组成的组。在进一步优选的实施方式中，所述肿瘤为非小细胞肺癌(NSCLC)或胰腺癌(PDAC)。

发明人通过实验验证发现，本发明的药物组合物不仅在体外具有优异的抑制肿瘤细胞集落形成的效果，而且在体内也能够显著抑制肿瘤生长，与单独的TM208和地塞米松相比表现出显著的协同作用，并且具有良好的器官安全性，具有较好的应用前景。

附图说明

图1示出了使用SRB法考察TM208对A549和H1299两种NSCLC细胞系的细胞毒作用的结果。

图2分别以显微镜照片(a)和柱状表(b)的形式示出了不同剂量的TM208、地塞米松(DEX)、以及TM208和DEX联用对A549细胞集落形成的抑制作用。

图3分别以显微镜照片(a)和柱状表(b)的形式示出了不同剂量的TM208、地塞米松(DEX)、以及TM208和DEX联用对H1299细胞集落形成的抑制作用。

图4分别以肿瘤生长曲线图(a)和给药结束时肿瘤照片(b)的形式示出了与吉西他滨(GEM)和他莫昔芬(TAM)两个阳性对照组相比，不同剂量的TM208(TM)、地塞米松(DEX)、以及TM208和DEX联用对A549移植肿瘤模型(Xenograft模型)中肿瘤生长的抑制作用。

图5示出了图4所示的A549移植肿瘤模型中，与他莫昔芬(TAM)阳性对照组相比，不同剂量的TM208(TM)、地塞米松(DEX)、以及TM208和DEX联用组的给药方案下裸鼠的淋巴结大小。

图6示出了图4所示的A549移植肿瘤模型中，不同给药方案下裸鼠的体重变化。

图7示出了图4所示的A549移植肿瘤模型中，不同给药方案下裸鼠主要组织器官H&E染色结果。

图8示出了SW1990移植瘤模型中，与吉西他滨(GEM)组相比，使用TM208、DEX和TM208和DEX联用的不同给药方案下SW1990移植瘤模型的生存期。

图9示出了图8所示的SW1990移植瘤模型中，不同给药方案下肿瘤的生长动力学。

图10分别以肿瘤生长曲线图(a)和给药三周后时肿瘤照片(b)示出了源于病人PDAC肿瘤的人源化肿瘤移植瘤模型(PDX)中，TM208、DEX和TM208和DEX联用的不同给药方案对肿瘤生长的影响。

图11示出了图10所示的PDX模型中，不同给药方案下NOD/SCID小鼠的体重变化。

图12示出了依据定量药理学建立的TM208单药治疗NSCLC的PK/PD模型框图。

图13示出了依据定量药理学建立的TM208和DEX联合治疗NSCLC的PK/PD模型框图。

具体实施方式

本发明中使用的药物组合物可包含药学上可接受的载体，包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、多羟基乙氧基化的蓖麻油、花生油、橄榄油、明胶、乳糖、石膏粉、蔗糖、糊精、碳酸镁、糖、环糊精、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸或纤维素低烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸醚、聚氧乙烯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。该药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的辅助剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、渗透压调节剂、缓冲剂、甜味剂、矫味剂、着色剂或上述的任意组合。

本发明的药物组合物可以制成任何形式的制剂，例如胶囊剂、片剂、气雾剂、溶液剂、悬浮剂、糖衣剂、锭剂、糖浆剂、乳剂、软膏剂、膏剂、注射剂、散剂、颗粒剂、糊剂、缓释剂、泡沫剂。根据给药途径，本发明的药物可以制成口服给药制剂、鼻部给药制剂、肺部给药制剂、口腔含化制剂、皮下给药制剂、皮内给药制剂、经皮给药制剂、胃肠外给药制剂、直肠给药制剂、储库式给药制剂、静脉内给药制剂、尿道内给药制剂、肌内给药制剂、鼻内给药制剂、眼部给药制剂、硬膜外给药制剂或局部给药制剂。

本发明中的“肿瘤”包括本领域中已知的各种癌症，包括但不限于：由肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、结肠癌、白血病、卵巢癌、胰腺癌和上皮癌所组成的组。在进一步优选的实施方式中，所述肿瘤为非小细胞肺癌(NSCLC)或胰腺癌(PDAC)。

实施例

接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不仅限于这些实施例。

以下各实施例中，所使用的实验动物为SPF级Nu/Nu雌性裸鼠或Balb-c裸鼠或NOD/SCID小鼠，体重18～20g，4周龄，均购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，在北京大学医学部实验动物中心饲养。所有动物实验严格遵照北京大学生物医学伦理委员会的规定。

各给药方案以及实验方法参照以下记载：

体外克隆实验：将A549和H1299细胞加入到6孔板后(1mL/孔，2×10³个细胞/孔)，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。细胞接种24h后，弃去原培养基，加入含有不同浓度药物的培养基，给药后继续孵育7天后，弃去培养基，加入2mL甲醇，室温下固定10min；弃去甲醇，用0.5％结晶紫溶液染色5min；弃去结晶紫，用自来水沿6孔板边缘清洗4次，在空气中自然晾干；在显微镜下观察细胞局部生长情况，选取“上、下、左、右、中”五个方位，拍照计数(细胞数大于50的细胞群作为一个集落)，并根据各实验组的集落形成情况，采用Graphpadprism5.01软件作图，比较显著性。

A549异种移植瘤模型的建立：取对数生长期的A549细胞，经胰蛋白酶消化成单细胞悬液，1000rpm离心5min，弃去上清液，PBS洗涤沉淀细胞两次，加入无血清RPMI-1640培养基，制成单细胞悬液，调整细胞密度为2.5×10⁷/ml。在无菌条件下，于Nu/Nu裸鼠右侧腋窝处的皮下注射0.2ml的细胞悬液，大约4天后，接种处形成肉眼可见的肿瘤。每隔两天，用游标卡尺测量肿瘤组织的长径和短径，按照以下式(I)计算肿瘤体积。肿瘤平均体积达到约100mm³时开始给药。

SW1990移植瘤模型的建立：SW1990细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％二氧化碳的环境下培养。接种时，将对数生长期的SW1990细胞先用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，1000rpm离心5min，弃去上清液，PBS洗涤沉淀细胞两次，用无血清的DMEM培养基重新混悬得到细胞悬液。将细胞悬液皮下注射到Balb-c裸鼠右侧腋下部位，每只裸鼠接种5*10⁶个细胞。肿瘤平均体积达到约100mm³时开始给药。

PDX动物模型的建立：用于PDX动物模型建立的肿瘤组织由北京大学肿瘤医院肝胆胰外科郝纯毅主任实验室馈赠(源于病人PDAC肿瘤)。实验所用的动物为4周龄的雌性NOD/SCID小鼠。接种前，用剃毛器将小鼠背部的鼠毛剪除，使其裸露出接种部位的皮肤。肿瘤组织从第二代PDX动物体内取出，当天接种。将肿瘤组织置于无血清DMEM培养基中，剪碎成约10mm³的小块，用镊子将其置于灭菌后的骨穿针中。用骨穿针将肿瘤组织接种到小鼠背部的皮下，并用镊子进行止血。肿瘤平均体积达到约50mm³时开始给药。

给药方案：上述研究中不同药物的配制和给药途径如下：GEM溶于生理盐水，尾静脉注射给药(iv)；TAM溶于丙二醇，灌胃给药(ig)；TM208溶于20％的2-羟丙基-β-环糊精，灌胃给药(ig)；DEX溶于10％的2-羟丙基-β-环糊精，灌胃给药(ig)。其中GEM组每3天给药1次，其他给药组均每天给药1次。

给药过程中，继续测量并记录各组肿瘤体积。一定时间天后，脱颈处死裸鼠，剥除肿瘤进行拍照，并收集其他重要器官用于病理学检查。并按照以下式(II)计算各给药方案的肿瘤抑制率。

体重：在药效学研究期间，每隔两天测定并记录裸鼠的体重，且观察各组裸鼠的生存状态和活动能力，比较药物的耐受性，从而初步考察各组给药方案的安全性。

淋巴结的检测：当上述药效学研究结束，在解剖摘取肿瘤的同时，也摘取裸鼠右侧腋窝处的淋巴结，包括空白对照组，TAM 50mg/kg组，TM208 100mg/kg组，TM208 150mg/kg组，DEX 2mg/kg组和TM208 50mg/kg+DEX 0.5mg/kg组。拍照，对比各组淋巴结大小，初步考察药物对于肿瘤转移的抑制潜能。

器官的病理学检查(H&E染色分析)：眼眶取血后，脱颈处死裸鼠，解剖得到各组裸鼠的主要器官，包括心、肝、脾、肺、肾，均浸泡在10％福尔马林固定液中。2周后送至北京大学第三医院病理科进行H&E染色分析，在电镜下观察病理切片并拍照记录。

实施例1：TM208与地塞米松联合治疗非小细胞肺癌的体外研究

首先，对于TM208单药，针对A549和H1299两种非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系，利用SRB法考察了TM208的细胞毒作用，如图1所示。两种癌细胞的最低生存率近于20％，TM208在A549和H1299的IC₅₀值分别为25.29μM，55.97μM，说明A549细胞对TM208更为敏感；相比于本领域中常见的细胞毒药物，TM208在体外降低细胞生存率的作用并不显著(通常来说，细胞毒药物的IC₅₀值小于1μM，比如GEM单用于胰腺癌细胞的IC₅₀值约为0.04μM)。

其次，为了进一步考察TM208在体外对于NSCLC细胞的影响，利用集落形成实验着重考察了TM208单药抑制集落形成的作用，同时也考察了TM208联用地塞米松(DEX)的药效情况。图2a是A549细胞的镜下视野，b是统计学分析结果，结果显示，TM208可以抑制A549的集落形成，这种抑制作用具有浓度依赖性；当低浓度TM208与特定浓度DEX联用时，抑制A549集落形成的作用明显强于高浓度TM208单药的作用(p<0.01)。图3是H1299细胞的结果，和A549细胞结果具有相似性。实施例2：TM208与地塞米松联合治疗非小细胞肺癌的体内研究

根据上文所述方法，在雌性Nu/Nu裸鼠上成功建立A549移植肿瘤模型，考察了不同剂量的TM208及其与DEX联用对肿瘤生长的抑制作用。肿瘤的生长曲线以及给药结束时的肿瘤拍照结果分别如图4a和4b所示。与空白给药组相比，TM208 150mg/kg和DEX 2mg/kg两个单药治疗组的肿瘤生长受到抑制(p<0.05)，联药组的肿瘤生长受到更为明显的抑制(p<0.001)；与阳性对照吉西他滨(GEM)组相比，仅有联药组的肿瘤生长受到显著性抑制(p<0.05)；与阳性对照他莫昔芬(TAM)组相比，亦仅有联药组的肿瘤生长受到显著性抑制(p<0.05)。

进一步地，不同给药方案下裸鼠的淋巴结大小如图5所示。由图可知，与空白对照组相比，TAM组的淋巴结大小几无改变，TM208的两个剂量组、DEX 2mg/kg单药组、以及两药均为更低剂量的联用组中，淋巴结均明显变小，说明这些治疗方案对NSCLC引起的炎症及肿瘤转移有一定抑制作用。

以下进一步对于TM208单药及其与DEX联用的安全性进行了评价。如图6所示，各给药组的体重变化差异并不明显。在相当长的一段时间内，GEM 20mg/kg组的体重明显低于空白给药组。在实验过程中，GEM20mg/kg组中的裸鼠活动能力比其他组的裸鼠差很多，而其他给药组与空白给药组的活动能力以及体重变化均差别不大。该结果说明TM208单药具有较好的全身安全性，优于细胞毒类药物GEM。

进一步地，病理结果如图7所示，TM208 150mg/kg组的肝小叶结构存在，肝板排列稍紊乱，汇管区少量炎细胞浸润，少数肝细胞水肿。其他给药组的胞核、胞浆形态均无明显异型性，细胞数量无明显减少，细胞未出现明显水肿，炎细胞浸润情况亦相似。这一结果说明在20天的实验时间内，高剂量TM208安全性较差，然而低剂量TM208与DEX联用时的器官安全性良好。

根据上述实施例1和实施例2的体内外结果可知，TM208单药对NSCLC细胞增殖以及异种移植瘤模型的肿瘤生长均有一定程度的抑制，但高剂量的TM208具有一定的肝毒性或肝损伤。和低剂量的DEX联合用药后，可以减少TM208的用量，而且对肿瘤生长的抑制作用明显增强，具有显著协同作用，而且安全性良好。

实施例3：TM208与地塞米松联合治疗胰腺癌(PDAC)结果

在本实施例中，首先根据上述方法，建立了人源胰腺癌SW1990细胞接种的异种移植(Xenograft)模型，由于SW1990异种移植模型中对照组和化疗药吉西他滨(GEM)组的生存期很短，因此该模型可用于评价药物对生存期的影响，结果如图8所示。可见GEM单药组与GEM与DEX联药组的生存期短于对照组，而TM208及其与DEX的联药组的生存期都远远大于对照组。与此同时，各组的肿瘤生长曲线如图9所示，可见高剂量的TM208(150mg/Kg)单用时对肿瘤生长的抑制作用较小，而低剂量TM208(50mg/Kg)与DEX(0.5mg/Kg)联用组中的肿瘤生长抑制最为显著，远远好于其余各组的效果。上述结果表明，对于SW1990异种移植瘤模型，TM208和DEX联用具有很好的协同增效作用。

同时，本实施例中还建立了源于病人PDAC肿瘤的人源化肿瘤移植瘤模型(Patientderived xenograft，PDX)，考察了不同给药方式对PDX模型中肿瘤生长的影响，结果如图10所示。根据图10结果可知，较高剂量的DEX单药(2mg/Kg)对肿瘤生长有显著抑制作用，而高剂量的TM208对肿瘤抑制没有作用，同时值得注意的是，低剂量TM208(50mg/Kg)与DEX(0.5mg/Kg)联用后能明显抑制肿瘤生长，效果好于两个单药组，这种联用效应与SW1990模型相似。此外，不同给药方案下小鼠体重随时间的变化曲线如图11所示，可见除了DEX单药组(2mg/Kg)在中期有较明显的体重下降外，其余各组的体重无明显下降，也说明联药组的系统安全性较好。

实施例4：TM208和DEX联用治疗NSCLC的PK/PD模型的建立

为了定量对TM208和DEX联用时的药效学相互作用进行研究，本实施例中采用了定量药理学中PK/PD模型的方法来对这一药效相互作用属于协同、加和还是拮抗进行具体考察。

首先，根据如图12所示的模型框图建立了TM208单药的PK/PD模型，具体模型参数如表1所示。表1中，K_t表示肿瘤的自然生长速率常数，k₂则是最主要的药效学参数，反映药物对肿瘤的杀伤作用，k₂越大，药物的药效越强。

表1TM208单药治疗NSCLC的PK/PD模型参数

模型建立后，通过多种方法(模型拟合结果、参数误差分析、模型可视化检验等)对模型进行了评价和验证，结果显示模型拟合值和实验观测值的变化趋势一致，其条件加权残差(CWRES)均落在+3到-3之间，并均匀分布在0位线上下，说明所建模型具有较好的准确性和精确性，误差较小；仿真1000次得到的可视化检验结果显示模型预测值的90％置信区间可以覆盖绝大多数观测值，且5％和95％分位线均匀分布在观测值中位线的两边，说明模型具有良好预测性和外推能，可用于给药方案的优化。

随后，在TM208单药模型的基础上，整合了DEX的PK和PD数据，根据如图12所示的模型框图建立了两药联用的PK/PD模型，具体模型参数如表2所示。表2中，参数ψ为协同系数，该参数可用于判断两药之间是否协同作用：如果ψ>1，则说明两药具有协同作用；如ψ＝1，则说明两药具有加和作用；如ψ<1，则说明两药具有拮抗作用。本研究中ψ为7.29，远大于1，说明TM208和DEX具有协同作用，DEX可以显著增加TM208的抗癌疗效。

表2TM208和DEX联合治疗NSCLC的PK/PD模型参数

同样地，通过对多种方法(比如模型拟合结果、参数误差分析，模型可视化检验等)对模型进行了评价和验证，结果显示模型拟合值和实验观测值的变化趋势一致，其条件加权残差(CWRES)均落在+3到-3之间，并均匀分布在0位线上下；仿真1000次得到的可视化检验结果显示模型预测值的90％置信区间可以覆盖绝大多数观测值，且5％和95％分位线均匀分布在观测值中位线的两边，说明所建立的两药联用的PK/PD模型同样具有较好的准确性和精确性，以及良好的预测性和外推性。

根据以上实施例1-4的结果可知，通过对上述两种癌症肿瘤模型进行研究，发现TM208单独使用时对肿瘤的抑制作用不很理想或无明显作用，即便是150mg/Kg的高剂量也是如此，然而TM208与DEX联用后，可明显降低给药剂量，且对非小细胞肺癌和胰腺癌都有明显抑制作用，且生存期延长，远好于单药结果，同时联用后安全性良好，好于较高剂量的TM208和DEX单用组。此外，通过采用PK/PD模型的方法，从模型参数ψ(7.29)也可以定量说明两药联用具有明显协同效应。根据上述结果可知，本发明的药物组合物具有较好的抗肿瘤应用前景。

Claims

1.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含4-甲基哌嗪-1-二硫代甲酸-(3-氰基-3,3-二苯基)丙酯盐酸盐和地塞米松。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中4-甲基哌嗪-1-二硫代甲酸-(3-氰基-3,3-二苯基)丙酯盐酸盐和地塞米松的重量比为1:50至100:1。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自于以下载体所组成的组：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、多羟基乙氧基化的蓖麻油、花生油、橄榄油、明胶、石膏粉、碳酸镁、糖、硬脂酸镁、滑石、琼脂、阿拉伯胶、硬脂酸或纤维素低烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、聚氧乙烯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述糖选自于由蔗糖、乳糖、直链淀粉、糊精、果胶所组成的组。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述糊精为环糊精。

7.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括季戊四醇脂肪酸醚。

8.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的辅助剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、渗透压调节剂、缓冲剂、矫味剂、着色剂或上述物质的组合。

9.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的甜味剂。

10.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物处于以下制剂形式中的一种或多种：胶囊剂、片剂、气雾剂、溶液剂、悬浮剂、糖衣剂、锭剂、糖浆剂、乳剂、膏剂、注射剂、散剂、颗粒剂、糊剂、缓释剂、泡沫剂。

11.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物处于软膏剂的形式。

12.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物处于以下制剂形式中的一种或多种：口服给药制剂、鼻部给药制剂、肺部给药制剂、口腔含化制剂、皮下给药制剂、皮内给药制剂、经皮给药制剂、胃肠外给药制剂、直肠给药制剂、储库式给药制剂、静脉内给药制剂、尿道内给药制剂、肌内给药制剂、眼部给药制剂、硬膜外给药制剂或局部给药制剂。

13.权利要求1-12任意一项所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药物方面的用途。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自于由肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、结肠癌、白血病、卵巢癌、胰腺癌和上皮癌所组成的组。

15.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为非小细胞肺癌或胰腺癌。