CN108713406B - 拟南芥的嫁接方法及其在恢复拟南芥突变体育性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟南芥的嫁接方法及其在恢复拟南芥突变体育性中的应用。该嫁接方法采用隔离槽对接口进行隔离，使得防止接穗产生不定根。本发明的嫁接方法可使部分生长缓慢且自交不育的拟南芥突变体恢复育性，其应用可大大提高获得纯合突变体的效率，显著减少为研究以及保存相关突变基因而进行的杂交再自交分离的工作量。

Description

拟南芥的嫁接方法及其在恢复拟南芥突变体育性中的应用

技术领域

本发明涉及小型幼嫩植物嫁接及植物无菌培养领域，更具体地，涉及一种拟南芥的嫁接方法及其在恢复拟南芥突变体育性中的应用。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)是目前植物学研究领域的一种重要模式植物，对拟南芥的研究涉及到植物遗传、生理生化等各个方向。在拟南芥研究过程中，清晰纯合的遗传背景往往是研究者所必需的，拟南芥的自花授粉特性也为其保持纯合的遗传背景创造了良好的条件。然而部分拟南芥纯合突变体的不育特性给研究者带来极大的困扰，使研究者不得不通过杂交手段来保存突变基因，而在后续的研究过程中再通过自交分离的手段获得纯合突变体，该过程大大降低了研究者获得纯合突变体植株的效率，增加了研究者的工作量。

目前，现有技术中尝试使用拟南芥嫁接进行品种改良等应用，但上述嫁接技术皆不适用于上述不育的突变体与野生型拟南芥之间的植株嫁接。上述嫁接技术的缺点为：(1)接穗的接口接触培养基部分容易产生不定根，造成嫁接失败，突变体接穗无法恢复育性；(2)苗龄过大导致生长缓慢突变体与野生型下胚轴直径相差大，造成切口对接困难；(3)接穗和砧木切口部分套入细小塑料管的操作难度大，且容易损伤弯曲的幼苗下胚轴；(4)改变培养光周期条件导致嫁接体表型改变，无法恢复突变体育性。

因此，需要一种改进的拟南芥的嫁接技术，能够使得上述不育的突变体与野生型拟南芥之间的植株嫁接后，恢复突变体的育性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的拟南芥的嫁接技术，能够使得不育的拟南芥突变体与野生型拟南芥之间的植株嫁接后，恢复拟南芥突变体的育性。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的一种拟南芥的嫁接方法，步骤如下：

(1)获取野生型拟南芥苗和拟南芥突变体苗；

(2)嫁接：野生型拟南芥苗作为砧木苗，拟南芥突变体苗作为接穗苗；无菌条件下进行嫁接；

(3)嫁接体的放置：将灭菌后的隔离槽放置在嫁接培养基上，将步骤(2)中嫁接完成的接口放置在隔离槽内；

(4)嫁接体培养。

优选地，隔离槽包含底面和沿嫁接体生长方向设置的两个侧壁，两个侧壁和底面围成一个具有开口的空腔，底面嵌入嫁接培养基。

优选地，隔离槽是切取长度为1-1.5mm的10μl或200μl移液器吸头的尖端，然后纵向对剖(注意保证所有切口平滑)，形成两个具有开口的凹面空腔的隔离槽，取其中一个灭菌后备用。

上述移液器吸头尖端纵向对剖后得到的隔离槽的半圆底部放置于嫁接培养基上，略压入嫁接培养基中用于隔离嫁接培养基(将隔离槽略压入嫁接培养基可起到固定隔离槽且防止隔离槽移动的作用，但隔离槽侧壁的顶端要高于嫁接培养基表面，以防止嫁接培养基进入隔离槽空腔内)，防止嫁接体创伤面与嫁接培养基接触从而形成愈伤组织和不定根，造成嫁接失败；本发明隔离槽由移液器吸头改造，耗材获取比较容易，其他类似物也可以。植物不同于工业产品，不可能每一个植株下胚轴大小都完全相同，移液器吸头具有不同规格且粗细不同，这样可根据植株下胚轴粗细程度选择合适的规格的移液器吸头进行切取使用，以保证隔离槽跟嫁接体的大小相对吻合尺寸可根据嫁接苗大小进行调整，可以更好的固定嫁接体，防止对接部位移位导致嫁接失败。本发明隔离槽远离培养基的一面的开口使嫁接体两端容易从此开口放置于隔离槽中，不会导致嫁接体折断，使得嫁接体固定牢固、不容易造成移位或者嫁接创口对不齐，使得嫁接成功率大大增加。

优选地，步骤(1)中获取野生型拟南芥苗和拟南芥突变体苗的过程分为无菌播种和无菌苗培养；

无菌播种是将野生型拟南芥种子和拟南芥突变体种子经过表面消毒后，播种至嫁接培养基表面；播种时种子的间隔距离为2厘米以上(为了切割操作方便)，播种后在种子周围的嫁接培养基表面留一圈无菌水。在种子周围的培养基表面留一圈无菌水的目的是保证湿度，无菌水的量为将培养皿竖立后不流动为宜；播种时注意保持培养基表面的完整性。

无菌苗培养是将接种后的嫁接培养基置于4℃春化处理3至4天，然后将嫁接培养基置于24℃、16小时光照和24℃、8小时黑暗的条件下，进行竖直培养3-5天，得到野生型拟南芥苗和拟南芥突变体苗。

优选地，步骤(4)培养嫁接体的过程为将嫁接体置于24℃、16小时光照和24℃、8小时黑暗的条件下，竖直培养9-15天。

优选地，步骤(2)中，嫁接过程为：选取株高2厘米，下胚轴直径1.0-2.0毫米的野生型拟南芥苗和拟南芥突变体苗，在嫁接培养基上，将野生型拟南芥苗和拟南芥突变体苗下胚轴靠近子叶节点1/3处均用锋利的双面刀片快速切断；使得野生型拟南芥苗保留下部2/3的下胚轴作为砧木，使得拟南芥突变体苗保留上部1/3的下胚轴作为接穗；将砧木和接穗的切口对接形成接口。

现有技术中通常使用剪刀剪断砧木和接穗，对幼嫩植株下胚轴来说，剪刀造成的伤口有挤压伤害容易导致在伤口处产生愈伤，另外剪刀剪切面不平整，不利于接穗和砧木对接后伤口的愈合。而使用锋利的双面刀片切割，伤口处无挤压伤害，伤口本身不易产生愈伤，伤口平齐对接后容易愈合。

更优选地，可以使用双面刀片快速切出方向一致的斜型刀口，以增大对接口接触面积。

优选地，嫁接培养基为在MS基本培养基中添加15g/L琼脂且嫁接培养基的pH为5.8-6.0；在MS基本培养基中添加低于15g/L的琼脂时，培养基过软，嫁接操作及嫁接体培养过程中，培养基容易进入隔离槽与嫁接体伤口接触导致嫁接失败；在MS基本培养基中添加高于15g/L的琼脂时，培养基太硬，幼苗及嫁接体根部会由于无法从培养基中吸收足够的水分导致培养失败；在MS基本培养基中添加15g/L琼脂的作用是1)为了切割操作方便，培养基有足够硬度能够承受嫁接时刀片切割时的力度，防止切割时把幼苗压入培养基导致幼苗无法快速切断造成嫁接失败；2)添加15g/L琼脂后的培养基硬度刚好适合隔离槽放置在培养基表面，略微压入培养基但不陷入培养基，既能保证隔离槽固定在指定位置不移动(琼脂过多培养基硬度太大会造成隔离槽无法压入培养基而移位)，又能防止隔离槽陷入培养基内或培养基进入隔离槽内(琼脂过少，培养基硬度小，会导致隔离槽陷入培养基内部或者培养基漫过隔离槽边缘进入隔离槽接触嫁接体伤口)。

优选地，所述方法还包含：嫁接体接口愈合并成活后，将其移栽入土中继续培养。

上述嫁接的方法中，所述种子的消毒、播种和嫁接过程均是在超净工作台无菌环境下操作。

上述拟南芥的嫁接方法在恢复拟南芥突变体育性中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明的嫁接方法可使部分生长缓慢且自交不育的拟南芥突变体恢复育性，其应用可大大提高获得纯合突变体的效率，显著减少为研究以及保存相关突变基因而进行的杂交再自交分离的工作量。

本发明的嫁接方法采用隔离槽对嫁接后的接口处进行隔离，防止接穗产生不定根，造成嫁接失败。

附图说明

图1示出了适于嫁接的幼苗状态的示意图；

图2示出了采用本发明的嫁接过程完成后的嫁接体及隔离槽的示意图；

图3示出了采用本发明的嫁接方法嫁接后8天的嫁接体的示意图；

图4示出了采用本发明的嫁接方法的嫁接体育性恢复后的示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以拟南芥突变体exo70a1实生苗为接穗与拟南芥Columbia-0(Col-0)实生苗为砧木进行嫁接为实例，种子消毒、实生苗培养、嫁接以及嫁接体培养均在无菌环境下完成。

本发明的实施例所用的：

MS基本培养基：市售产品；

嫁接培养基：在MS基本培养基中添加15g/L琼脂，调节pH为5.8-6.0。

具体地，拟南芥的嫁接方法的步骤是：

(1)无菌播种：将拟南芥突变体exo70a1种子和拟南芥Columbia-0(Col-0)种子无菌条件下进行表面消毒后，分别播至嫁接培养基表面，然后竖直培养。注意：播种时不要戳破嫁接培养基，保持嫁接培养基表面的完整性；播种时单粒种子的间隔距离为2厘米或2厘米以上；播种后在每一粒种子周围的嫁接培养基表面留一圈无菌水以保证湿度，无菌水的量为将培养皿竖立后不流动为宜；

(2)无菌苗培养：将无菌播种后的嫁接培养基封好口，置于4℃春化处理3至4天，然后将嫁接培养基置于24℃、16小时光照和24℃、8小时黑暗的条件下，进行竖直培养，种子萌发3-5天时，选取株高2厘米，下胚轴直径1.4-1.6毫米左右的幼苗备用(如图1所示)；

(3)嫁接和嫁接体的放置：切取10μl或200μl移液器吸头尖端1-1.5mm，纵向对剖，形成两个具有开口的凹面空腔的隔离槽，取其中一个灭菌备用(注意保证所有切口平滑)；选择好备用幼苗，在嫁接培养基上原地不动进行切割处理，将作为接穗的拟南芥突变体exo70a1幼苗及作为砧木的拟南芥Columbia-0(Col-0)幼苗下胚轴靠近子叶节点1/3处，分别用锋利的双面刀片快速切出方向一致的斜型刀口(注意保持伤口平滑)，并将幼苗切断，然后保持拟南芥Columbia-0(Col-0)幼苗伤口下部的植株部分不动，用拟南芥突变体exo70a1幼苗伤口上部的植株部分置换拟南芥Columbia-0(Col-0)幼苗伤口上部的植株部分；同时将前期制备好的隔离槽的凹面空腔的开口向上放置于嫁接接口与嫁接培养基之间，隔离槽的半圆底部放置于嫁接培养基上，略压入嫁接培养基中用于隔离嫁接培养基。

如图2所示的将接口固定于隔离槽的凹面空腔中，并将接口处紧密对接；根据植株下胚轴粗细程度选择的移液器吸头制成的隔离槽，保证了隔离槽跟嫁接体的大小相对吻合尺寸，可以更好的固定嫁接体。注意：操作过程中严格防止嫁接培养基接触隔离槽内表面，严格防止隔离槽上边缘低于嫁接培养基表面，以免导致嫁接培养基进入隔离槽内。这是因为嫁接伤口若接触嫁接培养基，会产生愈伤组织导致接口处无法愈合，嫁接失败。接穗靠近伤口附近的下胚轴若接触嫁接培养基，会产生不定根，造成嫁接失败。嫁接后若接穗和砧木位置有所移动，伤口愈合不好，会造成嫁接失败。

(4)嫁接体培养：嫁接完成后，将嫁接体置于24℃、16小时光照和24℃、8小时黑暗的条件下，竖直培养9-15天，接口愈合前严禁震动培养皿。如图3所示，嫁接后8天，嫁接体伤口愈合，接口处无愈伤组织，接穗无不定根生成，接穗长出新叶。嫁接体接口愈合并成活后，将其移栽入土中继续培养。

嫁接成功率统计：

嫁接成功的拟南芥突变体接穗可恢复育性，产生正常种荚。

嫁接失败的拟南芥突变体接穗死亡；或者虽然能成活，但不能恢复育性，不能产生正常种荚及种子。

采用本发明的嫁接方法，20株嫁接体中有16～19株恢复育性，即嫁接成功(如图4所示的嫁接成功的植株，育性恢复，有饱满的种荚)。

本发明中隔离槽作用:1.是为了固定嫁接的砧木和接穗对接后伤口愈合前相对位置不移动；2.是为了在嫁接后伤口完全愈合之前这段时间里隔离培养基。本发明中类半管状隔离槽的优点：1.操作方便，幼苗从半管状大开口处放入，容易操作，不易折断幼苗；2.易观察，半管状隔离槽可直接从开口上方观察到嫁接伤口是否对齐，培养基是否进入隔离槽，幼苗是否受损，培养过程中有无愈伤或不定根发生，可根据观察情况及时进行纠正。另外现有技术中有不使用隔离槽的情况，这样无法完全隔绝培养基与嫁接体在伤口附近的接触，更无法很好的固定嫁接体以防止移位。

对比例：

本对比例所用的：

MS基本培养基：市售产品；

嫁接培养基：在MS基本培养基中添加10g/L琼脂，调节pH为5.8-6.0。

采用如上实施例的嫁接方法进行拟南芥的嫁接，区别在于使用如上的嫁接培养基，以及在步骤(3)的嫁接体放置中不使用隔离槽进行接口和培养基的隔离，20株嫁接体中有0～7株恢复育性。

综上，本发明的嫁接方法的使用可大大提高嫁接成功率和拟南芥突变体的恢复育性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (7)

1.一种恢复拟南芥突变体育性的嫁接方法，其特征在于，步骤如下：

（1）获取野生型拟南芥苗和拟南芥突变体苗；

（2）嫁接：野生型拟南芥苗作为砧木苗，拟南芥突变体苗作为接穗苗；无菌条件下进行嫁接；

（3）嫁接体的放置：将灭菌后的隔离槽放置在嫁接培养基上，将步骤（2）中嫁接完成的接口放置在隔离槽内；其中，所述嫁接培养基为在MS基本培养基中添加15g/L琼脂；

（4）嫁接体竖直培养；

其中，所述隔离槽包含底面和沿嫁接体生长方向设置的两个侧壁，所述两个侧壁和所述底面围成一个具有开口的空腔，所述底面嵌入所述嫁接培养基；其中，所述隔离槽是切取长度为1-1.5mm 的10μl或200μl移液器吸头的尖端，然后纵向对剖，形成的具有开口的凹面空腔的隔离槽。

2.如权利要求1所述的嫁接方法，其特征在于，所述步骤（1）中获取野生型拟南芥苗和拟南芥突变体苗的过程分为无菌播种和无菌苗培养；

所述无菌播种是将野生型拟南芥种子和拟南芥突变体种子经过表面消毒后，播种至嫁接培养基表面；播种时种子的间隔距离为2厘米以上，播种后在种子周围的嫁接培养基表面留一圈无菌水；

所述无菌苗培养是将播种后的嫁接培养基置于4℃春化处理3至4天，然后将嫁接培养基置于24℃、16小时光照和24℃、8小时黑暗的条件下，进行竖直培养3-5天，得到野生型拟南芥苗和拟南芥突变体苗。

3.如权利要求1所述的嫁接方法，其特征在于，所述步骤（4）培养嫁接体的过程为将嫁接体置于24℃、16小时光照和24℃、8小时黑暗的条件下，竖直培养9-15天。

4.如权利要求1所述的嫁接方法，其特征在于，步骤（2）中，嫁接过程为：选取株高2厘米，下胚轴直径1.0-2.0毫米的野生型拟南芥苗和拟南芥突变体苗，在嫁接培养基上，将野生型拟南芥苗和拟南芥突变体苗下胚轴靠近子叶节点1/3处均用双面刀片快速切断；使得野生型拟南芥苗保留下部2/3的下胚轴作为砧木，使得拟南芥突变体苗保留上部1/3的下胚轴作为接穗；将砧木和接穗的切口对接形成接口。

5.如权利要求1所述的嫁接方法，其特征在于，嫁接培养基的pH为5.8-6.0。

6.如权利要求1所述的嫁接方法，其特征在于，所述方法还包含：嫁接体接口愈合并成活后，将其移栽入土中继续培养。

7.根据权利要求1-6任一项所述的嫁接方法在恢复拟南芥突变体育性中的应用。

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