CN108707605A - 一种受外源糖添加诱导表达的gsm2启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种受外源糖添加诱导表达的GSM2启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明克隆到了拟南芥中与番茄ToTAL1同源的基因GSM2的启动子，并对其进行了序列分析及功能的验证。证实GSM2启动子序列可由ATG上游1.5kb的序列组成，该启动子不仅能够启动外源基因GUS在拟南芥和烟草中表达，并且其启动的强度可被外源糖信号所增强。本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，获得诱导型启动子的双元表达载体；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得可诱导表达目的基因的转基因植株。

Description

一种受外源糖添加诱导表达的GSM2启动子
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种受外源糖添加诱导表达的启动子。
背景技术
启动子是基因的一个组成部分，启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。诱导型启动子不同于组成型的启动子，其只在某些信号的刺激下才启动外源基因的转录，能使目的基因的表达产物在一定时空积累，增加区域表达量，提高植株的抗逆性。一定程度上解决转基因应用中食品安全性问题，是应用植物转基因技术进行基因工程育种的理想启动子。
糖不仅作为能量和碳骨架的来源，也是调控植物生长和发育的重要信号分子。糖响应基因对于植物逆境适应具有重要意义。Caillau等人证实番茄中ToTAL1基因表达于植物中的各组织，并且能被多种信号所诱导，但未克隆ToTAL1的启动子。周勇等人发现水稻中TAL-like的蛋白大量积累于维管束中的韧皮部，推测其对维管束的发育具有重要作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种新的收外源糖添加诱导表达的启动子。
本发明的技术方案为：一种受外源糖添加诱导表达的GSM2启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
扩增SEQ ID No.1所示GSM2启动子的引物对，引物对的前向引物序列如SEQ IDNo.2所示，引物对的后向引物序列如SEQ ID No.3所示。
一种重组载体，其特征在于，含有SEQ ID No.1所示的GSM2启动子。
进一步地，所述重组载体为融合有权利要求1所述的GSM2启动子和报告基团GUS的两元表达载体。
SEQ ID No.1所示的GSM2启动子在转基因植物上的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明克隆到了拟南芥中与番茄ToTAL1同源的基因GSM2的启动子，并对其进行了序列分析及功能的验证。证实GSM2启动子序列可由ATG上游1.5kb的序列组成，该启动子不仅能够启动外源基因GUS在拟南芥和烟草中表达，并且其启动的强度可被外源糖信号所增强。本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，获得诱导型启动子的双元表达载体；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得可诱导表达目的基因的转基因植株。
附图说明
图1GSM2启动子片段电泳图；
图2GSM2启动子序列，灰色背景标注为起始密码子ATG，灰色字体为部分GSM2基因序列。
图3GSM2启动子序列分析；
图4AtGSM2-GUS2转基因拟南芥植株，野生型(Col-0)与-1.5kb-AtTRA2-GUS转基因植株的表型。图片所示生长于MS培养基上7d大的幼苗。
图5AtGSM2-GUS转基因拟南芥糖处理后GUS染色分析；
图6烟草中瞬时表达AtGSM2-GUS糖处理后GUS染色分析。
具体实施方式
1.启动子克隆
从TAIR(https://www.arabidopsis.org/)数据库中下载GSM2基因DNA序列，选择ATG上游1.5kb长度作为GSM2启动子区域，设计引物(表1)。通过PCR获得GSM2启动子片段，其核苷酸序列见图2，(GSM2启动子片段电泳图如图1所示，片段长度为1500bp)，连入T-vector，通过测序获得正确无突变的GSM2启动子片段，转接入含有报告基因GUS的二元表达载体中。
表1GSM2启动子扩增所用的引物序列。
Primer name Primer sequences(5`-3`)
TRA2pro-F GGTACCTCAGGCGAAGAACAGAAGATG(SEQ ID No.2)
TRA2pro-R GTCGACTTTTTTCGTCGAGGGAAATACG(SEQ ID No.3)
下划线所标注的序列为引入的限制性内切酶识别位点。
2.GUS染色
GUS检测试剂盒(LEAGENE)进行GUS表达分析。将需染色的植物材料用GUS染色液浸泡，37℃温育，然后用75％酒精脱色后，观察拍照。
3.转基因拟南芥植株
将构建成功的含AtGSM2-GUS的二元载体转入农杆菌中，通过花絮浸染法转入野性型拟南芥(Col-0)。收取T0种子，通过筛选，拥有潮霉素抗性的为转基因拟南芥植株，见图4。进一步进行GUS染色鉴定(图5)。转基因拟南芥植株表型上与野生型无明显差异，并且可检测到GUS基因的表达，证明GSM2启动子序列是具有启动子功能的，并能启动外源基因的表达。
4.烟草瞬时表达
将构建成功的含AtGSM2-GUS的二元载体转入农杆菌，菌检鉴定阳性克隆。将阳性克隆扩大培养，用MS培养液将菌液稀释至OD600＝0.1。用1ml注射器将菌液注射入烟草叶片中，22℃，黑暗条件下培养三天。
5.糖诱导实验
将进行瞬时表达的烟草叶片及转基因拟南芥植株分别放入糖及MS培养液中，120rpm进行培养。收取材料进行GUS染色。结果见图6。
6.启动子序列分析
利用PLACE数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)进行启动子调控元件分析，结果见表2和图3。
表2 GSM2启动子所含有的启动子必需元件及响应环境胁迫的元件汇总表
N＝A/G/C/T,W＝A/T,R＝A/G.
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 申请人名称：西南大学
<120> 一种受外源糖添加诱导表达的GSM2启动子
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
tcaggcgaag aacagaagat gacatcaagc tggccaatag tgtggatgtt ggatccctga 60
gggacccaca agaagactcg gttagggtca agaatccaga atggttagtg gttgttggag 120
tgtgcactca tttggggtgc atccccttgc ctaatgctgg tgattatggt ggttggtttt 180
gtccgtgtca cggatcacat tacgatatat ctggaagaat taggaaaggt cctgcaccat 240
acaacctgga agtaccaacc tacagcttcc tggaagagaa taagttactc atcggttgat 300
taataaaagc acaacagtca agagtctgga tctgaatgat gatcttcact tgttcttttt 360
ttcttttaat taatattttc cggcatgtta gagcaagatt gacttgtttt tgctgaataa 420
tacaaacttg tgatttttgt ttgaagtata ctcaatcttc gtttatccat cgctagtaaa 480
agacgactat gttcatagtc tgtgtttatt atttaacatg cctatttgtc ctatgtatga 540
gtgagattcc tttcgtatct cataattcta aacatcgtca ttccaattaa aaagttgtat 600
ttacatttga gtttcgatag tatctcaacg ttcataaaag aaaaactaaa ggtatgagaa 660
aaaccaacgt agaaacaaac aacaaaaggt aatatatcag ctttgattga tagtttacag 720
gaagataacc gaataagttc aaactgtatt cgtaagacat cccgtgaatg aatattcaat 780
catccaaaag tggcatagct agattttttc tagattggct aagaacacaa aaacataata 840
ttttattctg tttaatcttt tttagttaag aaaaaatgtt tgacacacaa aagccaaagt 900
ttgatttggg taaaaaccat tgtgggagat gaaaatgtta aaatcttgtt tgttttggtc 960
accaacaacg gccatgaact atatgggaag tgacttatct cttgtaagtt gttttccttt 1020
tgggatatgg gaagtgactt ctccgaccct tgcaaactaa caacggccat tacacactaa 1080
ttacaagcca aaggtcctca ctaagcaacc tctcgtgttt atcataagac accgctctat 1140
ctcttattat tttattcatt gttttctaat ttcagactga ttaatcatac attagagaaa 1200
gtttattaaa accatctgat gtaaaaaatc acatttatct aaattaaata aatttgttat 1260
ctagtatata actatttatt gttttaacat ttggataaat tgtaagaaat tagaatgtaa 1320
aataagacag aaaatggtca actatgagca tctatcgcca tcatgatata gtttcgtcgt 1380
ttgcgttccc gacctaactc aaaacttcac caaccccatt tttaagcccc tttctttgtt 1440
tttatcctcc gatcgatcaa accaagaaaa aacactttcg tatttccctc gacgaaaaaa 1500
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtacctcag gcgaagaaca gaagatg 27
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgactttt ttcgtcgagg gaaatacg 28

Claims (5)

1.一种受外源糖添加诱导表达的GSM2启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.扩增权利要求1所述GSM2启动子的引物对，其特征在于，引物对的前向引物序列如SEQ ID No.2所示，引物对的后向引物序列如SEQ ID No.3所示。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述的GSM2启动子。
4.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为融合有权利要求1所述的GSM2启动子和报告基团GUS的两元表达载体。
5.权利要求1所述的GSM2启动子在转基因植物上的应用。
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