CN108707548A - 无功能型垂体腺瘤检测装置和应用 - Google Patents

无功能型垂体腺瘤检测装置和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种无功能型垂体腺瘤检测装置，和应用。本发明装置针对待测样本的单核苷酸多态性位点rs2910200进行Massarray SNP分型检测。该位点和无功能型垂体瘤的发病具有显著相关性。此位点的不同遗传模型可以为无功能型垂体瘤的诊断提供一定的依据，具有较高的临床价值。本发明可以为无功能垂体瘤患者的早期诊断提供简便可靠的诊断方法。

Description

无功能型垂体腺瘤检测装置和应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种无功能型垂体腺瘤检测装置和应用。
背景技术
垂体瘤是常见的能导致垂体激素分泌失衡的神经内分泌性肿瘤之一，其发病率排在脑胶质瘤和脑膜瘤之后，居颅内肿瘤发病率的第三位。流行病学研究表明，在一般人群中垂体瘤的发病率高达16.7％，可发生在任何年龄，以30-50岁者居多。垂体瘤中无功能腺瘤约占15％-54％。由于无功能垂体腺瘤无法体现出激素相关症候群，缺乏明显的相关临床症状，因此临床中早期诊断相当困难。
垂体瘤患者可于起病后不同时期有轻重不等的临床表现。主要为肿瘤向鞍外、鞍上扩展压迫邻近组织出现头痛，以两颞部、额部、眼球后或鼻根部胀痛为主。视神经通路受压，引起不同类型的视野缺损，视力减退。由于垂体瘤许多症状和体征与一些常见疾病类似，因此许多患者常常被漏诊。发病隐匿，生长缓慢，当患者出现临床症状时，肿瘤已经呈侵袭生，压迫临近重要解剖结构，导致患者出现一系列的神经功能损害。除此之外，垂体瘤导致垂体前叶功能减退，在儿童期表现为身材矮小和性发育不全。成年人3/4的患者性腺功能减退，由于垂体促肾上腺皮质激素(Adreno Cortico Tropic Hormone，ACTH)储备不足，出现肾上腺皮质功能衰减。如肿瘤影响到下丘脑及垂体后叶可引起尿崩症。约5％～10％患者发生卒中，部分病人出现急性垂体功能衰竭。
随着手术方式的进步、新药的研制、放疗定位准确性的提高，术后并发症发生率逐渐降低，病情缓解率逐渐提高。但是垂体瘤的发病机制仍不清楚，早期诊断目前仍比较困难，如能在肿瘤发生初期做出明确的诊断，对于防止因肿瘤持续隐匿生长压迫所致的不可逆神经功能损害以及降低治疗风险均有着非常重要的意义。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)，是指在某一人群的正常个体基因组内特定核苷酸位置存在的单个不同碱基，且频率至少大于1％。由于SNP的低突变率、高密度、易于检测使SNP被认为是继第一代限制性片段长度多态性标记和第二代微卫星多态性标记之后的第三代遗传标记。人类目前已经发现了几百万个单核苷酸多态性位点，并且进一步研究了它在基因组上的频率和分布，利用SNP探索疾病的遗传基础也有了许多实例。最有代表性的是阿尔茨默氏病的遗传研究。利用SNP多态性的相关分析，研究人员发现APOE基因的ε4等位基因与阿尔茨海默病相关。除此以外是非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)，研究证明至少16个SNPs与NIDDM的发病密切相关，其中过氧化物酶体激活受体γ基因(PPARG)与NIDDM相关性最强。因此利用SNP找到确切造成疾病的突变基因，将以SNP为基础的研究应用于临床，这样才能提高疾病的漏检率，指导患者提前进行干预，减少疾病所带来的痛苦与经济负担。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种无功能型垂体腺瘤检测装置和应用。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“SNP”是指：单核苷酸多态性。
术语“PBS”是指：磷酸缓冲盐溶液。
术语“TE”是指：TE缓冲液，由Tris和EDTA配制而成。
术语“SBS”是指：十二烷基硫酸钠。
术语“PCR”是指：聚合酶链式反应。
术语“PTTG1”是指：垂体肿瘤转化基因1，又称TUTR1，由位于5号染色体长臂上的PTTG1基因编码的人源蛋白。
术语“rs2910200”是指：垂体肿瘤转化基因1(pituitary tumor-transforming 1,PTTG1)基因第2内含子rs2910200，其基因序列为：
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种无功能型垂体腺瘤检测装置，所述装置针对待测样本的单核苷酸多态性位点rs2910200进行Massarray SNP分型检测，该装置包括以下组成机构：
引物合成机构，优选地，所述引物为：正向引物序列为SEQ ID No:1，所述反向引物序列为SEQ ID No:2；
样本检测定量机构；
PCR反应机构；
单碱基延伸反应机构；和
计算机检测和分析机构。
根据本发明第一方面的装置，其中，所述装置还包括选自以下的一种或多种组成机构：
单核苷酸多态性位点rs2910200序列分析机构；
引物设计机构；
SAP纯化反应机构；和
树脂纯化机构。
优选地，所述引物合成机构包括但不限于：固相亚磷酰胺三酯合成机构，BioRP/OPC纯化机构，HPLC纯化机构，和/或PAGE纯化机构；
所述样本检测定量机构包括但不限于：紫外分光光度机构，电泳机构；
所述PCR反应机构包括但不限于：热启动PCR机构，降落PCR机构，和/或巢式PCR机构；
所述SAP纯化反应机构包括但不限于：去磷酸化处理机构；
所述单碱基延伸反应机构包括但不限于：SNaPshot机构；
所述计算机检测和分析机构包括但不限于：统计学分析机构；
所述单核苷酸多态性位点rs2910200序列分析机构包括但不限于：电泳机构；
所述引物设计机构包括但不限于：基因序列获取机构；
所述树脂纯化机构包括但不限于：离子交换树脂机构。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的检测装置的操作方法，所述方法包括：
(1)通过引物合成机构合成引物；优选地，在引物合成前通过单核苷酸多态性位点rs2910200序列分析机构对序列进行分析，并通过引物设计机构进行引物设计；
(2)通过样本检测定量机构进行DNA提取及质量检测；
(3)通过PCR反应机构对利用步骤(1)合成的引物对步骤(2)提取的DNA进行扩增；优选地，在所述PCR反应后通过SAP纯化反应机构对产物进行碱性磷酸酶处理；
(4)通过单碱基延伸反应机构对步骤(3)所得的产物进行单碱基延伸反应；优选地，在所述单碱基延伸反应后对产物进行树脂纯化；
(5)通过计算机检测和分析机构对步骤(4)所得产物进行检测和分析。
本发明的第三方面提供了一种单核苷酸多态性rs2910200的PCR引物和/或单碱基延伸引物，所述正向引物序列为SEQ ID No:1，所述反向引物序列为SEQ ID No:2。
本发明的第四方面提供了一种检测无功能型垂体腺瘤试剂盒，所述试剂盒中包括：单核苷酸多态性rs2910200的多态性或基因型的物质；和
基因分型试剂。
根据本发明第四方面的试剂盒，其中，所述单核苷酸多态性rs2910200的多态性或基因型的物质为权利要求5所述的PCR引物和/或单碱基延伸引物。
根据本发明第四方面的试剂盒，其中，所述基因分型试剂包括：dNTPMix，HotStarTaq，iPLEX Termination mix，iPLEX Enzyme。
本发明的第五方面提供了单核苷酸多态性rs2910200的多态性或基因型的物质、第一方面所述的检测装置、第三方面所述的引物或第四方面所述的试剂盒在制备用于检测无功能型垂体腺瘤易感性或用于筛查无功能型垂体腺瘤的产品中的应用。
本发明的第六方面提供了单核苷酸多态性rs2910200的多态性或基因型的物质、第一方面所述的检测装置、第三方面所述的引物或第四方面所述的试剂盒在制备用于无功能型垂体腺瘤早期诊断的产品中的应用。
随着医学技术的进步和分子生物学的发展，研究基因在肿瘤发生发展中所起的作用具有重要的意义。利用分子生物学筛选无功能性垂体腺瘤差异SNP位点，可以有助于垂体瘤的早期发现和诊断，为垂体瘤的治疗和研究提供分子手段和理论基础。了解遗传因素在疾病中的作用是将有利于疾病的诊断、治疗和预防，也有助于了解环境因素在疾病发生中的作用。
早期诊断，早期预防，早期治疗对于无功能型垂体瘤的治疗具有十分重要的意义。然而由于无功能垂体腺瘤无法体现出激素相关症候群，缺乏明显的相关临床症状，在临床中很难及时发现。当肿瘤继续生长为大或巨大垂体瘤时，会压迫垂体周围的神经组织，引起相关症状，如视力视野的改变、垂体功能低下等等。同时由于垂体的特殊解剖结构，巨大的垂体腺瘤会出现占位效应，产生神经功能障碍。因此迫切需要寻找一种对患者创伤小，简便廉价检的测方法。
目前临床上用于确诊垂体腺瘤的核磁共振检查，不仅费用昂贵难以用于临床病例的大规模筛检，且由于受到分辨率的限制，难以发现直径<0.5cm的微腺瘤。且无功能垂体腺瘤无法体现出激素相关症候群，缺乏明显的相关临床症状，在临床中很难及时发现。因此为解决上述现实问题，本发明采用MALDI-TOF MS对垂体瘤患者和健康对照样本的rs2910200位点进行了检测，本发明人发现这个位点和无功能型垂体瘤的发病具有显著相关性。本发明可以为无功能垂体瘤患者的早期诊断提供简便可靠的诊断方法。
本发明的无功能型垂体腺瘤检测装置可以具有但不限于以下有益效果：
该位点和无功能型垂体瘤的发病具有显著相关性。此位点的不同遗传模型可以为无功能型垂体瘤的诊断提供一定的依据，具有较高的临床价值。本发明可以为无功能垂体瘤患者的早期诊断提供简便可靠的诊断方法。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明Massarray SNP分型实验流程。
图2a示出了实施例1中获取基因序列的网站的NCBI网页，图2b示出了实施例1中将SNP位点所在序列发送到My agena网站注册的邮箱中。
图3示出了实施例1中将产生的结果复制在新的文本文件.txt中。
图4示出了实施例1中对反应重数设置。
图5示出了实施例1中DNA质量检测结果。
图6示出了实施例1中SNP分型检测散点图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
PBS，TE，SDS，蛋白酶K购自北京普利莱基因技术有限公司；
饱和酚，氯仿，异戊醇，NaAC，乙醇均购自北京化学试剂公司；
树脂，PCR Buffer，MgCl2，dNTP Mix，HotStar Taq，SAP，iPLEX Buffer Plus，iPLEX Termination mix，iPLEX Enzyme均购自Agena公司；
DNA提取试剂盒，上样缓冲液购自BioTeKe公司；
琼脂糖(含EB)凝胶购自BIOWEST公司；
PCR反应板，Dimple板，购自Axygen公司；
EDTA抗凝采血管，购自BD公司。
仪器：
超微量分光光度计，购自Thermo Scientific、型号NanoDrop2000；
PCR仪，购自美国ABI公司、型号ABI veriti-384PCR仪；
点样仪，购自MassARRAY Nanodispenser，型号RS1000。
实施例1
病例组79例，于首都医科大学附属北京天坛医院就诊且手术的垂体腺瘤患者。所有垂体腺瘤患者均经临床表现，内分泌实验室检查，影像学检查为无功能性垂体腺瘤患者。所有患者均排除其他恶性疾病(如脑膜瘤，胶质瘤，淋巴瘤等)；健康对照组144例，均来自本院同期健康体检人员。所有纳入研究的人群均为未患有垂体腺瘤且无垂体腺瘤家族史的正常健康人。研究对象一般资料如表1所示。
表1研究对象一般资料
对照 患者
性别(男/女) 142(69/73) 79(41/38)
年龄 42.12±11.63 41.37±11.63
体重 69.04±14.35 72.26±13
吸烟情况(％)
是 17.6％ 24.5％
否 82.4％ 75.9％
饮酒情况(％)
是 16.8％ 13.9％
否 83.2％ 86.1％
1.Massarray SNP分型实验流程
如图1所示，Massarray SNP分型实验流程包括以下步骤：
(1)整理SNP序列信息成标准格式；(2)输入到软件进行SNP未点引物设计，确定目的位点；(3)合成引物；(4)样本检测定量；(5)PCR反应；(6)SAP纯化反应；(7)单碱基延伸反应；(8)树脂纯化；(9)上机检测；(10)收集数据。
2.Massarray SNP分型实验具体流程
2.1引物设计及合成、稀释
2.1.1.基因序列的获取
(1)在My agena网站中注册成用户。
(2)在NCBI网页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)中输入SNP位点的名称,按照dbSNP batch reportor格式显示，如图2a所示。
(3)将SNP位点所在序列aaaatgacta ttggcatcat cctacgtagc tttcttccctctgagtagaagggaaataga ggttagcaag cagagtagtg gaggagactc agattgtcct tgtggacttcttggtacctt发送到My agena网站注册的邮箱中，如图2b所示。
(4)在My agena网站的TOOLS工具栏中选择Genotyping。
(5)点击RS format，在Browse按钮中选择NCBI网站发送到邮箱的文件。
(6)网站对序列的格式化完成后在Sent to栏中，选择ProxSNP。
(7)开始ProxSNP，点击Begin Start。
(8)上述步骤完成后，在Sent to栏中选择PreXTEND。
(9)开始ProxSNP，点击Begin Start。
(10)在产生的结果中，选择OUTPUT，并把文件内容复制在新的文本文件.txt中，如图3所示。
2.1.2.结合文献并采用AssayDesigner3.1软件进行引物设计PCR反应和单碱基扩展引物，并交由华大基因公司进行合成。rs2910200引物序列如下：
正向引物F:ACGTTGGATGTTGGCATCATCCTACGTAGC
反向引物R：ACGTTGGATGATCTGAGTCTCCTCCACTAC
2.1.3引物稀释
1)PCR master mix引物配置：用纯水对引物进行稀释，使单管PCR master至浓度100μM，加入去离子水混合所有单管PCR master使最终反应PCR master mix浓度为0.5μM。
2)EXTEND Mix引物配置：用纯水稀释单管延伸引物至终浓度500μM，加入引物混合后使得各引物浓度8μM、10μM、15μM。按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。将混合好的单管延伸引物根据分子量大小，分别取(小于6300Da)1倍，(6300Da至7200Da)1.2倍，(大于7200Da)1.5倍体积量进行混合待用。
2.2DNA提取及质量检测
2.2.1DNA提取
蛋白酶K-酚氯仿抽提基因组DNA的方法来抽提血标本中的基因组DNA。详细步骤见下：
A.取200微升EDTA抗凝血液加入500微升PBS洗涤，2500g离心5min。
B.弃掉上清，向沉淀中加500微升PBS进行第二次洗涤，2500g离心5min。
C.弃掉上清，向沉淀中加500微升TE，25微升20％SDS和4微升10mg/ml的蛋白酶K。
D.55℃温育3小时，不定期地摇匀。
E.加入700微升饱和酚，上下颠倒混匀10min，直至两相形成。
F.12000g高速离心10min，取上清液。
G.加700微升Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，上下颠倒混匀10min。
H.12000g高速离心15min，取上清液。
I.加700微升氯仿：异戊醇(24：1)，上下颠倒混匀10min。
J.12000g高速离心，15min，取上清液。
K.加入1/10体积的3M NaAC(PH4.8)和2.5倍体积0℃预冷无水乙醇。
L.12000g，4℃高速离心15min。
M.弃上清，加200微升0℃预冷70％乙醇。
N.12000g，4"C高速离心15min。
O.去掉70％乙醇，室温风干。
P.加入20微升无菌去离子水，-20℃保存备用。
2.2.2DNA质量检测
使用试剂盒(BioTeKe公司)提取血样中的DNA。使用NanoDrop2000仪器进行OD值检测。取5微升按照2.2.1方法提取的DNA样品和1微升上样缓冲液(6X)混匀，于0.8％的琼脂糖(含EB)凝胶上电泳，120V电压电泳30分钟左右，紫外灯下观察电泳结果。经分析DNA度达到实验要求，电泳结果显示所有样本均得到完整清晰的DNA条带，表明DNA无断裂或严重降解。所有DNA样本均-20℃储存备用。。
2.3Agena MassArray系统基因分型步骤
2.3.1分型原理：
通过PCR反应扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用SAP酶去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,再加入单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，且与目的片段上的碱基完全互补，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基。
2.3.2PCR扩增反应
(1)取1.5mlEP管中配置PCR master mix，并振荡低速离心。反应组分如表2所示。
表2 PCR master mix反应相关试剂配制组分
(2)选用8道或12道移液器，在384孔板的每个加样孔中加入4μl PCR master mix，最后加入1μl模板DNA(20ng/μl)混匀，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。1000rpm离心1minute。
(3)设置如表3所示的PCR扩增反应程序，将PCR反应板放置于PCR仪上，启动程序。
表3 PCR扩增反应程序
2.3.3产物碱性磷酸酶处理
(1)在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase,虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。
(2)在新1.5mlEP管中配制碱性磷酸酶处理反应液，SAP Mix反应组分如表4所示。
表4 SAP反应组分
SAP mix试剂 浓度 体积(1rxn)
纯水(HPLC grad) NA 1.53μl
SAP Buffer 10x 0.17μl
SAP Enzyme 1U/μl 0.30μl
总体积 - 2.00μl
(3)将SAP mix加入384孔PCR反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAP mix 2μl。
(4)移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序。
(5)设置SAP反应程序：37℃20min；85℃5min；4℃∞。并将384孔反应板放置于PCR仪上，启动程序。
2.3.4单碱基延伸反应
(1)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。
(2)在新1.5mlEP管中配制单碱基延伸反应液，EXTEND Mix反应组分如表5所示。
表5延伸反应组分
延伸反应试剂 9μl浓度 体积(1rxm)
纯水(HPLC grade) NA 0.619μl
iPLEX Buffer Plus 0.222x 0.200μl
iPLEX Termination mix 1x 0.200μl
Primer Mix(7μM:14μM) 0.625uM:1.25uM 0.940μl
iPLEX Enzyme 1x 0.041μl
体积 - 2μl
(3)将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系如表6所示。
表6单碱基延伸反应体系
(4)移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序。
(5)设置延伸反应程序，如表7所示。
表7单碱基延伸反应体系延伸反应程序
2.3.5树脂纯化
(1)在384/6MG Dimple板里均匀填充阴离子交换树脂，并放置10分钟使其晾干。
(2)在384样本板的每个孔中加16μL水。
(3)将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。
(4)将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。
2.3.6芯片点样
启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384-well SpectroCHIP bioarray上。
2.3.7质谱检测及数据输出
将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存入相应存储媒介。
2.3.8统计学分析
对于符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示其平均水平，不符合正态分布则用中位数(四分位数间距)来表示其平均水平；计数资料用频数和构成比来表示。计量资料如果符合正态分布，两组间差异比较采用t检验，如不符合正态分布，采用秩和检验；计数资料比较用卡方检验。采用卡方检验分析SNP位点基因频率分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，P≥0.01认为样本来自遗传平衡的群体，具有较好的代表性。采用Logistic回归模型分析不同遗传模型下SNP83基因多态性与卒中后联合终点事件发生(复发、死亡等联合终点事件)和预后不良(mRS＞1分)的关联，并计算比值比(odds ratio，OR)及95％可信区间(confidence interval，CI)。所有统计学分析用P-link和SPSS17.0软件进行分析，P＜0.05表示差异有显著性。
3、SNP分型检测散点图：
聚类图也称散点图：是根据DNA产物峰面积大小计算得到SNP位点所有分型点状图。正常聚类图中2个纯合子分型根据产物峰高分别在靠近横、纵轴聚类，在二者之间单独聚类的一组为杂合子。从图6可见，本次分型成功，结果可信。
通过信息分析发现rs2910200在无功能型垂体瘤患者血液中呈差异化表达rs2910200(PTTG1C>T)位于5号染色体长臂，共有4例样本未检测出基因型，检出率为98.21％。采用P-link对所得到的数据进行分析，rs2910200在本研究中的MAF为0.1644，HWE检验(Hardy-Weinberg)为0.716(P>0.05)。结果显示样本具有较好的群体代表性。
通过卡方检验对rs2910200的不同基因型进行统计分析，我们发现健康对照组和病例组之间等位基因(p＝0.0219)，显性遗传模型(CT+TT vs.CC)之间存在显著性差异(p＝0.03078)，如表8所示。
表8对照组和病例组rs2910200不同基因型卡方检验
同时通过Logistic回归分析，垂体瘤患者rs2910200位点三种基因型之间未发现显著性差异，如表9所示。
表9 rs2910200三种基因型的Logistic回归
*校正性别、年龄、体重、吸烟、饮酒
通过对等位基因模型(C vs.T)，显性遗传模型和隐性遗传模型(TT vs.CT+CC)进行回归分析，我们发现rs2910200等位基因模型(p＝0.02336，OR＝1.808，95％CI：1.084-3.017)和显性遗传模型(p＝0.02796，OR＝1.951，95％CI：1.075-3.542)能显著增加无功能型垂体瘤的发病风险，通过校正性别、年龄、体重、吸烟、饮酒后差异仍具有显著性，如表10所示。
表10 rs2910200不同遗传模型的Logistic回归
*校正性别、年龄、体重、吸烟、饮酒
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京天坛医院
<120> 无功能型垂体腺瘤检测装置和应用
<130> YZDI-180027
<141> 2018-06-14
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg ttggcatcat cctacgtagc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg atctgagtct cctccactac 30
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaatgacta ttggcatcat cctacgtagc tttcttccct ctgagtagaa gggaaataga 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggttagcaag cagagtagtg gaggagactc agattgtcct tgtggacttc ttggtacctt 60

Claims (10)

1.一种无功能型垂体腺瘤检测装置，其特征在于，所述装置针对待测样本的单核苷酸多态性位点rs2910200进行Massarray SNP分型检测，该装置包括以下组成机构：
引物合成机构，优选地，所述引物为：正向引物序列为SEQ ID No:1，所述反向引物序列为SEQ ID No:2；
样本检测定量机构；
PCR反应机构；
单碱基延伸反应机构；和
计算机检测和分析机构。
2.如权利要求1所述的检测装置，其特征在于，所述装置还包括选自以下的一种或多种组成机构：
单核苷酸多态性位点rs2910200序列分析机构；
引物设计机构；
SAP纯化反应机构；和
树脂纯化机构。
3.如权利要求1或2所述的检测装置，其特征在于：
所述引物合成机构包括但不限于：固相亚磷酰胺三酯合成机构，BioRP/OPC纯化机构，HPLC纯化机构，和/或PAGE纯化机构；
所述样本检测定量机构包括但不限于：紫外分光光度机构，电泳机构，；
所述PCR反应机构包括但不限于：热启动PCR机构，降落PCR机构，和/或巢式PCR机构；
所述SAP纯化反应机构包括但不限于：去磷酸化处理机构；
所述单碱基延伸反应机构包括但不限于：SNaPshot机构；
所述计算机检测和分析机构包括但不限于：统计学分析机构；
所述单核苷酸多态性位点rs2910200序列分析机构包括但不限于：电泳机构；
所述引物设计机构包括但不限于：基因序列获取机构；
所述树脂纯化机构包括但不限于：离子交换树脂机构。
4.权利要求1-3任一项所述的检测装置的操作方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)通过引物合成机构合成引物；优选地，在引物合成前通过单核苷酸多态性位点rs2910200序列分析机构对序列进行分析，并通过引物设计机构进行引物设计；
(2)通过样本检测定量机构进行DNA提取及质量检测；
(3)通过PCR反应机构对利用步骤(1)合成的引物对步骤(2)提取的DNA进行扩增；优选地，在所述PCR反应后通过SAP纯化反应机构对产物进行碱性磷酸酶处理；
(4)通过单碱基延伸反应机构对步骤(3)所得的产物进行单碱基延伸反应；优选地，在所述单碱基延伸反应后对产物进行树脂纯化；
(5)通过计算机检测和分析机构对步骤(4)所得产物进行检测和分析。
5.一种单核苷酸多态性rs2910200的PCR引物和/或单碱基延伸引物，其特征在于，所述正向引物序列为SEQ ID No:1，所述反向引物序列为SEQ ID No:2。
6.一种检测无功能型垂体腺瘤试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：单核苷酸多态性rs2910200的多态性或基因型的物质；和
基因分型试剂。
7.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述单核苷酸多态性rs2910200的多态性或基因型的物质为权利要求5所述的PCR引物和/或单碱基延伸引物。
8.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述基因分型试剂包括：dNTP Mix，HotStar Taq，iPLEX Termination mix，iPLEX Enzyme。
9.单核苷酸多态性rs2910200的多态性或基因型的物质、权利要求1-3任一项所述的检测装置、权利要求5所述的引物或权利要求6-8任一项所述的试剂盒在制备用于检测无功能型垂体腺瘤易感性或用于筛查无功能型垂体腺瘤的产品中的应用。
10.单核苷酸多态性rs2910200的多态性或基因型的物质、权利要求1-3任一项所述的检测装置、权利要求5所述的引物或权利要求6-8任一项所述的试剂盒在制备用于无功能型垂体腺瘤早期诊断的产品中的应用。
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