CN108697731A

CN108697731A - 用于治疗窦疾病和病症的组合物和方法

Info

Publication number: CN108697731A
Application number: CN201780014521.4A
Authority: CN
Inventors: S·巴巴拉特
Original assignee: Ent Technology Co Ltd
Current assignee: Ent Technology Co Ltd
Priority date: 2016-02-17
Filing date: 2017-02-17
Publication date: 2018-10-23
Also published as: BR112018016651A2; IL261134A; ZA201806103B; EP3416655A1; EP3416655A4; WO2017139854A1; CA3013942C; SG11201806835SA; AU2017220396B2; CA3013942A1; US20200276226A1; US11357791B2; AU2017220396A1; JP2019505538A; KR20180108811A; IL261134B; HK1258884A1; IL261134B2

Abstract

一种包含κ‑角叉菜胶和载体溶液的组合物及其在治疗上呼吸道疾病或病状中的用途，其中所述载体溶液是等渗溶液。

Description

用于治疗窦疾病和病症的组合物和方法

技术领域

包含κ角叉菜胶的用于鼻和窦的组合物，及其使用方法。

背景技术

以下对背景技术的论述仅旨在便于理解本发明。该论述并非确认或承认，任一引用素材曾经是或现在是在申请优先权日期之时公知常识的一部分。

角叉菜胶是一组天然存在的直链硫酸化半乳糖基多糖，其衍生自特定类型的红海藻。角叉菜胶的传统用途是作为食品中的胶凝剂。然而，近来测试了角叉菜胶在制药工业和生物材料生产中的用途，在制药工业中角叉菜胶显示与改善的药物制剂(诸如持续释放制剂)有关。然而，它们也与不良反应有关，诸如抑制血液凝固以及对免疫系统有不利影响。因此，在制药工业中使用角叉菜胶存在一些风险，这限制了它们在药物组合物和制剂中的用途。

尽管据悉已从海藻中提取出至少十种不同类型的角叉菜胶，但在工业中主要使用三种类型，包括ι-角叉菜胶、κ-角叉菜胶和λ-角叉菜胶。这些角叉菜胶在结构和硫酸酯基团数量方面彼此不同。

食品级角叉菜胶已经使用了很长时间。由于角叉菜胶在与钾离子和钙离子接触时具有胶凝特性，因此已在许多食品中得到使用以改善产品的稠度。角叉菜胶在口服施用后不会被胃肠道显着吸收，因此通常被认为是安全的。然而，最近的研究已表明，在药品和生物材料(诸如药物递送系统或组织再生支架)中使用角叉菜胶可能引起对免疫系统和血液凝固不利的活动。最近的综述文章提供了关于角叉菜胶的不利生物学影响的论述(Liu等人，(2015)Carbohydrate Polymers 121:27-36)。

最近已考虑将ι-角叉菜胶用作治疗鼻病毒感染的抗病毒剂。然而，对κ-角叉菜胶单独使用抑或与其他角叉菜胶组合使用的了解甚少。

用于治疗上呼吸道疾病的产品，诸如鼻喷雾剂或滴剂通常对治疗窦病变无效，因为由这些装置递送的剂量不足以到达待治疗的区域。治疗窦疾病所遇到的另一个问题是药物与待治疗区域的接触时间不够长，无法达到治疗效果。

存在许多上呼吸道疾病和病状，包括鼻炎、过敏性鼻炎、非过敏性鼻炎、窦炎、鼻窦炎和慢性鼻窦炎。慢性鼻窦炎(CRS)的特征在于免疫紊乱，导致影响鼻子和鼻旁窦的慢性炎症。此病变症状表现为鼻塞、产生大量稠厚的绿色粘液、窦疼痛、头痛、嗅觉丧失、喉咙痛和咳嗽。

存在几种慢性鼻窦炎的表型，并且每种表型都具有优选的治疗方案。无论如何，所有表型都需要每天使用大容量的正压溶液进行鼻和窦冲洗，以从鼻腔和窦腔中清除多余的粘液和炎性介质，从而缓解症状。某些形式的疾病需要施用混入冲洗液中的局部药物。这些局部疗法包括局部类固醇，如布地奈德、或莫米松和/或局部抗生素。

CRS的特征还在于组织学异常，由此粘膜纤毛的功能和结构受到不利影响。这导致粘液停滞，使得粘液变得稠厚和浓缩，导致感染发生率增加。还存在粘膜的“渗漏”，由此炎性变化不利地影响粘膜和细菌的完整性，并且炎性物质可以穿过粘膜下层。

以上述方式递送局部疗法的问题在于冲洗后留在鼻旁窦中的药剂的浓度极低。发生这种情况是因为97.5％的冲洗液在治疗后会流失。因此，仅剩下2.5％，而此数量的流体仅能含有微量的局部治疗药物。

正是在这种背景下开发了本发明。本发明试图克服或至少改善上述现有技术的一个或多个缺陷，或试图为消费者提供有用的或商业的选择。

发明内容

本发明涉及包含在窦冲洗液中的治疗有效量的角叉菜胶的组合物及其使用方法。更具体地，角叉菜胶是κ-角叉菜胶。

在本发明的一方面，提供了一种包含在载体溶液中的κ-角叉菜胶的组合物，其中所述载体溶液是与细胞外液等渗的溶液。

在本发明的一个实施方案中，所述载体溶液包含NaCl和KCl。所述载体溶液还可包含以下组分中的一种或多种：五水合乳酸钙、碳酸氢钠、葡萄糖、木糖醇或任何其他五(5)碳糖分子(糖醇)，包括赤藓醇和其他多元醇-糖。载体溶液还可具有低离子强度。

在本发明的第二方面，提供了一种组合物，所述组合物包含在等渗载体溶液中的κ-角叉菜胶，还包含第二活性剂。所述第二活性剂可以是药剂、药物或剂的形式，用于治疗上呼吸道疾病或病状。

在本发明的第三方面，提供了一种用于治疗上呼吸道疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含在等渗载体溶液中的治疗有效量的κ-角叉菜胶的组合物。

在本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：治疗量的粉末形式的κ-角叉菜胶、待重构以制备载体溶液的粉末、以及它们的使用说明。本发明的试剂盒还可以包括正压冲洗装置或其他施用溶液以实现相同或相似治疗效果的装置。

在本发明的第五方面，提供了κ-角叉菜胶在制备用于治疗上呼吸道疾病或病状的药剂中的用途。

附图说明

下面是对本发明的几个非限制性实施方案的描述，在其中更全面地描述了本发明的其他特征。将此描述包括在内仅仅是为了对本发明进行举例说明。不应将此描述理解为对如上给出的本发明的宽泛概述、公开或描述的限制。将参考附图进行描述，其中：

图1A是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的角叉菜胶24小时后人鼻上皮细胞上清液中的乳酸脱氢酶表达的图。值表示为相比对照培养基的倍数变化(对照培养基＝1)；误差条表示标准偏差。

图1B是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的角叉菜胶24小时后人鼻上皮细胞上清液中的乳酸脱氢酶表达的图。值表示为相比仅媒介物对照的倍数变化(媒介物对照＝1)；误差条表示标准偏差。

图2A是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的角叉菜胶24小时后人鼻上皮细胞上清液中的基质金属肽酶-2表达的图。值表示为总(ng/ml)；误差条表示标准偏差。

图2B是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的角叉菜胶24小时后人鼻上皮细胞上清液中的基质金属肽酶-2表达的图。值表示为相比仅媒介物对照的百分比(％)(仅媒介物＝100％)；误差条表示标准偏差。

图3A是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的角叉菜胶24小时后人鼻上皮细胞上清液中的白细胞介素-6表达的图。值表示为总IL-6(pg/ml)；误差条表示标准偏差。

图3B是以仅媒介物对照示出的，示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的角叉菜胶24小时后人鼻上皮细胞上清液中的白细胞介素-6表达的图。值表示为总IL-6(pg/ml)；误差条表示标准偏差

图4A是示出在细胞缓冲液中测量的，在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶和ι角叉菜胶24小时后空气液体界面人鼻上皮细胞的初始跨上皮电阻的百分比的图

图4B是示出暴露于FLO Sinus Care中的κ角叉菜胶和ι角叉菜胶的空气液体界面人鼻上皮细胞培养物的跨上皮电阻变化的图。在基线、12小时和24小时时间点在细胞培养基和角叉菜胶溶液中进行测量

图4C是示出暴露于FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶和ι角叉菜胶的空气液体界面人鼻上皮细胞培养物的跨上皮电阻变化的图。在基线、12小时和24小时时间点在细胞培养基和角叉菜胶溶液中进行测量

图5A是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶24小时后空气液体界面人鼻上皮细胞培养物的细胞旁渗透性的图，值表示为相比对照培养基的倍数变化(对照培养基＝1)

图5B是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶24小时后空气液体界面人鼻上皮细胞培养物的细胞旁渗透性的图，值表示为相比媒介物对照的倍数变化(媒介物对照＝1)

图6是肌动蛋白细胞质染色的照片，示出了暴露于FLO Sinus Care中的0.12％κ角叉菜胶或ι角叉菜胶24小时对空气液体界面人鼻上皮细胞培养物的肌动蛋白细胞骨架的影响。F-肌动蛋白用鬼笔环肽(绿色)显现，细胞核用DAPI(蓝色)显现

图7是示出暴露于FLO CRS溶液中的0.12％κ角叉菜胶或ι角叉菜胶24小时对空气液体界面人鼻上皮细胞培养物的肌动蛋白细胞骨架的影响的照片。F-肌动蛋白用鬼笔环肽(绿色)显现，细胞核用DAPI(蓝色)显现

图8A是示出暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶的空气液体界面人鼻上皮细胞培养物的纤毛摆动频率的图。测量值表示以下时间点的平均值(Hz)：5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、6小时和12小时

图8B是示出暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶的空气液体界面人鼻上皮细胞培养物的纤毛摆动频率的图。测量值表示以下时间点相对基线的平均变化(％；CBF_t＝x/CBF_基线)：5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、6小时和12小时

图9是暴露于FLO Sinus Care溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶的人鼻上皮细胞培养物的扫描电子显微照片(10000x)，示出了纤毛表面结构

图10是暴露于FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶的人鼻上皮细胞培养物的扫描电子显微照片(10000x)，示出了纤毛表面结构

图11是优选冲洗装置的一个实例

图12A是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶24小时后来自CRS患者的HNEC-ALI培养物的乳酸脱氢酶释放的图。值表示为细胞活力(P>0.05)

图12B是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶24小时后来自非CRS患者的HNEC-ALI培养物的乳酸脱氢酶释放的图。值表示为细胞活力(P>0.05)

图13A是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的角叉菜胶24小时后来自CRS患者的HNEC上清液中基质金属肽酶-2分泌的图。值显示为平均值±SEM，n＝3，ANOVA，接以HSD post hoc检验

图13B是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的角叉菜胶24小时后来自非CRS患者的HNEC上清液中基质金属肽酶-2分泌的图。值显示为平均值±SEM，n＝3，ANOVA，接以HSD post hoc检验

图14A是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶24小时后来自CRS患者的人鼻上皮细胞上清液中的白细胞介素-6水平的图。值表示为总IL-6(pg/ml)；误差条表示标准偏差

图14B是示出在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶24小时后来自非CRS患者的人鼻上皮细胞上清液中的白细胞介素-6水平的图。值表示为总IL-6(pg/ml)；误差条表示标准偏差。

图15A是示出在来自CRS患者的细胞缓冲液中测量的，在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶24小时后人鼻上皮细胞的跨上皮电阻(TEER)的图

图15B是示出在来自非CRS患者的细胞缓冲液中测量的，在暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶24小时后人鼻上皮细胞的跨上皮电阻(TEER)的图

图16A是示出源自CRS患者的HNEC-ALI单层的细胞旁渗透性的图。在应用κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLO CRS、ι-角叉菜胶/FLO Sinus Care、ι-角叉菜胶/FLOCRS、FLO Sinus Care、FLO CRS、阴性对照(培养基)和阳性对照(0.5％Triton X-100)24小时后测量来自CRSwNP患者的HNEC单层中的FITC-葡聚糖通过。值显示为平均值±SEM，n＝3。ANOVA，接以HSD post hoc检验。^*＝p<0.05

图16B是示出源自CRS患者的HNEC-ALI单层的细胞旁渗透性的图。在应用κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLO CRS、ι-角叉菜胶/FLO Sinus Care、ι-角叉菜胶/FLOCRS、FLO Sinus Care、FLO CRS、阴性对照(培养基)和阳性对照(0.5％Triton X-100)24小时后测量来自非CRS对照患者的HNEC单层中的FITC-葡聚糖通过。值显示为平均值±SEM，n＝3。ANOVA，接以HSD post hoc检验。^*＝p<0.05

图17A示出κ角叉菜胶/FlO Sinus Care、κ角叉菜胶/FlO CRS、ι-角叉菜胶/FLOSinus Care、ι-角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care和FLO CRS、阴性对照(培养基)和阳性对照(0.5％Triton X-100)对CRS患者的HNEC单层中闭合小环蛋白-1(Zona Occludens-1，ZO-1)免疫定位的影响。使用DAPI对细胞核染色(蓝色染色)，白条为20μm。使用共聚焦激光扫描显微镜检查，20X放大率

图17B示出κ角叉菜胶/FlO Sinus Care、κ角叉菜胶/FlO CRS、ι-角叉菜胶/FLOSinus Care、ι-角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care和FLO CRS、阴性对照(培养基)和阳性对照(0.5％Triton X-100)对CRS患者的F-肌动蛋白的影响。使用DAPI对细胞核染色(蓝色染色)，白条为20μm。使用共聚焦激光扫描显微镜检查，20X放大率

图18是示出暴露于FLO Sinus Care或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶的空气液体界面人鼻上皮细胞的纤毛摆动频率的图。测量值表示以下时间点的平均值(Hz)：5分钟、10分钟、20分钟、6小时和24小时。值显示为平均值±SEM，n＝3。

图19A是示出处理对细胞迁移的影响的图。在应用κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO CRS和阴性对照(培养基)后24小时，在来自CRSwNP患者的HNEC单层中测量伤口愈合迁移测定。值显示为平均值±SEM，n＝3。ANOVA，接以Tukey HSD post hoc检验。^*＝p<0.05

图19B是示出处理对细胞迁移的影响的图。在应用κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO CRS和阴性对照(培养基)后24小时，在来自非CRS对照患者的HNEC单层中测量伤口愈合迁移测定。值显示为平均值±SEM，n＝3。ANOVA，接以Tukey HSD post hoc检验。^*＝p<0.05

图20A是示出在FLO CRS和FLO Sinus Care中递送的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶对抑制促炎反应的影响的图。示出了在CRS患者中在用Poly(I:C)LMW刺激的同时角叉菜胶κ/FLOSinus Care、角叉菜胶κ/FLO CRS、角叉菜胶ι/FLO Sinus Care、角叉菜胶ι/FLO CRS、FLOSinus Care和FLO CRS对HNEC/ALI的影响。使用布地奈德作为护理控制的抗炎标准。阴性对照是未处理的细胞(培养基)。数据显示为平均值±SD(n＝3)

图20B是示出在FLO CRS和FLO Sinus Care中递送的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶对抑制促炎反应的影响的图。示出了在非CRS患者中在用Poly(I:C)LMW刺激的同时角叉菜胶κ/FLO Sinus Care、角叉菜胶κ/FLO CRS、角叉菜胶ι/FLO Sinus Care、角叉菜胶ι/FLO CRS、FLO Sinus Care和FLO CRS对HNEC/ALI的影响。使用布地奈德作为护理控制的抗炎标准。阴性对照是未处理的细胞(培养基)。数据显示为平均值±SD(n＝3)

具体实施方式

发明概括说明

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或诸如“包括”或“含有”的变体将被理解为暗示包括所述整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。

本领域技术人员将理解，本文描述的发明易于作出与具体所述内容不同的变化和修改。本发明包括所有此类变化和修改。本发明还包括说明书中提及或指出的单独的或以集合形式存在的所有步骤、特征、制剂和化合物，以及所述步骤或特征中的任意两个或更多个的任意和全部组合。

本文中引用的每篇文献、参考文献、专利申请或专利均明确地以引用的方式整体并入本文中，这意味着读者应将上述文献作为本文的一部分来阅读并考虑。仅仅为了简明起见，本文中引用的文献、参考文献、专利申请或专利在本文中不再重复。

本文提及的任何产品的或以引用的方式并入本文中的任何文献中的任何制造商的说明书、描述、产品说明书和产品单特此以引用的方式并入本文中，并且可以用于本发明的实践中。

本发明不限于本文描述的任何具体实施方案的范围。这些实施方案仅出于举例说明的目的。功能等同的产品、制剂和方法显然在本文描述的本发明的范围内。

本文描述的发明可包括一个或多个值范围(例如，尺寸、位移和场强等)。值范围将被理解为包括该范围内的所有值，包括限定该范围的值，以及与该范围相邻的值，所述与该范围相邻的值导致与紧邻限定该范围的边界的值的值相同或基本相同的结果。

本文使用的所选术语的其他定义可以在发明具体说明中找到并贯穿全文。除非另外定义，否则本文使用的所有其他科学和技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。术语“活性剂”可以指一种活性剂，或者可以包括两种或更多种活性剂。

术语“活性剂”是指可用于在施用的受试者中实现一些有益变化的化合物。例如，此定义范围内的“活性剂”包括κ角叉菜胶、类固醇、抗生素、抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂和抗炎剂。

术语“有效量”或“治疗量”是指足以在受试者中实现所需变化的量。确定活性剂的有效量在本领域技术人员的知识和技能范围内。

如本文所用的术语“治疗”涵盖动物(包括人)疾病的任何治疗，并且包括：(i)预防疾病发生；(ii)抑制疾病，诸如阻止其发展；(iii)减轻疾病，例如导致疾病消退；和/或(iv)改变正常的生物活性。

如本文使用的术语“疾病”、“病症”或“病状”涵盖任何医学疾病/病症/病状，诸如但不限于慢性鼻窦炎以及可导致鼻通道和鼻旁窦腔中过多粘液积聚的其他疾病。其他疾病/病症/病状包括非过敏性鼻旁窦疾病、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病和囊性纤维化。在鼻通道和鼻旁窦腔中积聚的粘液也可能是由诸如内窥镜窦手术的手术所引起。

术语“等渗”是指与细胞外液等渗的载体溶液。

含有一种或多种盐的任何溶液都具有离子强度或电荷。溶液中盐或不同盐的量可以通过其浓度(mM或mMol)来定义。例如，10mM磷酸钠缓冲溶液的离子强度为21mM。生理盐水具有9g/L浓度的氯化钠，且离子强度为154mM。市售冲洗液通常由许多不同的盐组成，并且估计其离子强度范围为130mM至大于500mM。当用作递送溶液时，0至35mM之间的离子强度被认为是超低或极低离子强度溶液。极低的离子强度意味着溶液的离子强度小于约31mM。

可以将本发明的药物制剂施用于任何哺乳动物。优选地，哺乳动物是人。

发明具体说明

本发明的组合物和方法可用于治疗上呼吸道，包括鼻孔、鼻腔和鼻旁窦。鼻旁窦通过口与鼻腔连接。由于术后手术、并发症、感染或疾病，鼻旁窦、鼻腔和口可能会被阻塞。本领域技术人员将了解可以通过本发明的组合物来治疗的与上呼吸道相关的其他疾病和病状。

本发明的组合物包含在等渗载体溶液中的κ-角叉菜胶。所述组合物优选以大(例如100-200ml)体积的载体溶液施用。另外的药剂、药物或活性剂也可以包括在κ-角叉菜胶组合物中，以帮助治疗与上呼吸道相关的疾病或病状。

κ-角叉菜胶

迄今为止，据信，κ-角叉菜胶尚未在没有其他角叉菜胶存在的情况下单独在药物制剂中使用。也就是说，虽然ι角叉菜胶和/或λ角叉菜胶均已在制药工业中作为研究对象研究了它们递送活性剂的效果，但是没有相应的研究表明κ-角叉菜胶在没有其他角叉菜胶存在的情况下使用。

κ-角叉菜胶可以从任何商业来源获得。例如，可以从供应商获得天然级或过滤的角叉菜胶。κ-角叉菜胶可以是粉末、凝胶或液体的形式。优选地，κ-角叉菜胶为粉末形式。

研究表明，ι角叉菜胶可以诱导出血，而λ角叉菜胶促炎作用强，并且在疼痛模型实验中用于诱导严重疼痛。另一方面，κ-角叉菜胶是这三种角叉菜胶中唯一一种没有负面影响并且可以在局部药物的递送中提供显着优势的角叉菜胶。

不受理论束缚，使用κ-角叉菜胶的益处至少部分归因于其强粘膜粘附特性。已经证明，使用κ-角叉菜胶和等渗载体溶液在用于鼻和窦粘膜时无促炎作用且非常安全。此外，与使用简单盐水溶液携带药剂/药物的情况相比，本发明的组合物可有助于将药剂或药物在粘膜表面上保留显着更长的时间。

不受理论束缚，本申请人认为在本发明的窦溶液中使用κ-角叉菜胶导致粘液层的水合，改善了先天免疫功能和纤毛运动性。此外，由于冲洗液和局部药剂保留在粘膜层上，因此治疗方案的临床结果得到改善。

此外，κ-角叉菜胶是吸湿性的并且可非常有效地保留水。因此，本发明的组合物对于治疗上呼吸道疾病或病状是理想的。

在载体溶液中提供治疗有效量的κ-角叉菜胶。载体溶液中存在的κ-角叉菜胶的量为约0.01％wt/v至约15％wt/v，且更优选为约0.05％wt/v至约0.5％wt/v。在本发明的一个实施方案中，载体溶液中存在的κ-角叉菜胶的量为约0.12％wt/v。

κ-角叉菜胶可以作为粉末或液体溶液提供添加到载体溶液中。在一个实施方案中，提供一定量的κ-角叉菜胶以添加到粉末形式的载体溶液中。载体溶液可以根据说明书由粉末制备，然后在使用之前可以添加κ-角叉菜胶。或者，κ-角叉菜胶以粉末形式与粉末形式的载体溶液一起提供，并用水补足至适当的体积。

因此，在一个高度优选的实施方案中，本发明提供了包含在窦冲洗液中的κ-角叉菜胶的组合物，用于在窦手术(窦冲洗)的术后即刻阶段以及正在进行的所有鼻旁窦炎性疾病的窦冲洗治疗中控制患者，其中治疗包括简单冲洗或包含治疗剂以控制鼻旁窦炎症或感染。

本发明的组合物可以在伴有或不伴有上呼吸道继发感染的任何炎性病状的存在下用于鼻和窦用途。

此外，本发明的组合物可以与其他局部治疗剂、药剂或药物，诸如但不限于抗生素、抗真菌剂或抗炎剂联合使用。

在本发明的一个优选实施方案中，κ角叉菜胶以100至200ml体积的窦溶液递送。优选地，窦溶液是低离子强度溶液。窦溶液还可含有木糖醇或赤藓醇(或任何其他5碳糖或多元醇)以及一些低浓度的KCl和NaCl。

载体溶液

可以通过将治疗有效量的κ-角叉菜胶在等渗载体溶液(也称为“等渗溶液”)中混合来制备本发明的组合物。适合与κ-角叉菜胶一起使用的窦溶液包括本领域技术人员已知的任何稀释剂或载体。尽管任何等渗载体溶液都可以与κ-角叉菜胶组合使用，但是使用包含NaCl和KCl的等渗溶液可以获得最佳结果。

优选地，可以与κ-角叉菜胶组合使用的等渗溶液是市售的，包括SinusCare和CRS溶液。

Sinus Care是一种等渗溶液，包含NaCl、KCL、五水合乳酸钙、碳酸氢钠和葡萄糖。所述溶液可以粉末形式提供，并按照制造商的说明书补足至一定体积，然后与治疗量的κ-角叉菜胶混合。或者，可以将κ-角叉菜胶添加到粉末形式的载体溶液中，并补足至所需体积，以确保递送治疗量的κ-角叉菜胶。

在优选的实施方案中，将粉末形式的κ-角叉菜胶与等渗载体的粉末混合，然后用水补足至所需体积。可以以粉末形式制备和包装混合的组分。

在一些情况下，例如对于患有慢性鼻窦炎的患者，低离子强度溶液是优选的，因为低离子强度溶液不会不利地影响这些患者的先天免疫功能。在这种情况下，优选使用具有低离子强度，且包含木糖醇、KCl和NaCl的CRS溶液。

优选地，FLO Sinus Care具有以下组成：0.772％w/v NaCl、0.042％w/v KCl、0.032％w/v乳酸钙、0.015％w/v NaHCO3、0.085％w/v无水葡萄糖，并且FLO CRS具有以下浓度：NaCl＝0.75mg/L，KCl＝0.9mg/mL且木糖醇＝370mg/mL。

施用于有需要治疗的患者的组合物的体积足以将治疗有效量的κ-角叉菜胶递送至上呼吸道。在一个实施方案中，载体溶液的体积范围为50ml至350ml。在高度优选的实施方案中，体积为100ml至200ml之间。在高度优选的实施方案中，体积为100mL至250mL之间。

本发明的组合物可以应用于面部任一侧或两侧的鼻或窦通道。治疗鼻通道和窦腔所需的载体溶液的体积可以通过使用正压冲洗装置来施用。可以施用任何正压冲洗装置来递送本发明的组合物。在高度优选的实施方案中，所述装置是软的挤压LDPE塑料瓶、汲取管和特殊设计的锥形顶部–使得终止点不与鼻中隔接触。所述装置的图像在图11中示出。

正压装置的操作方式为：简单地挤压瓶子，直到约100mL的溶液经由一个鼻孔进入鼻腔和鼻旁窦腔中并从另一个鼻孔排出。然后可以对另一个鼻孔重复此过程。

本发明的方法和组合物能够治疗由急性或慢性疾病过程引起的组织炎症和/或粘液积聚，或清除由鼻和窦手术引起的粘液、干血、切除的组织和血凝块，所述手术是在患有急性或慢性窦疾病、伴有或不伴有相关息肉病的患者中进行以促进鼻旁窦通气。

额外的药剂、药物或治疗剂

此外，本发明的组合物还可包含一种或多种局部药物，包括但不限于类固醇和抗生素。对于窦疾病的局部治疗，可能需要额外的局部药物。

可用于制备本发明的组合物的其他化合物包括抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂或抗炎剂和抗氧化剂。

疾病或病状

本发明的组合物可用于治疗与上呼吸道相关的任何数量的疾病或病状。可用本发明的组合物治疗的疾病或病状包括但不限于：非过敏性鼻炎、过敏性鼻炎、急性窦炎、过敏性和非过敏性病因引起的鼻窦炎、慢性鼻窦炎。

如上所述，这些疾病或病状可以通过向有治疗需要的患者施用治疗有效量的本发明的组合物来治疗。

例如，可以通过正压装置将大体积(例如100ml至200ml)的本发明的组合物经由鼻孔施用至患者的上呼吸道。提供足够量的κ-角叉菜胶以保留在上呼吸道中以使患病组织水合并使局部药物与粘膜表面接触较长时间。

实施例

设计实验以确定角叉菜胶作为上呼吸道疾病和病状的治疗的安全性。此外，进行了实验以研究用κ角叉菜胶和ι角叉菜胶处理后的纤毛功能和结构。

就对窦组织的作用而言，κ角叉菜胶的作用包括：研究了纤毛安全性、紧密连接作用、抗炎作用和胶凝作用。含有角叉菜胶的递送溶液是FLO Sinus Care(LactatedRingers)或FLO CRS(与细胞外液等渗，具有木糖醇、NaCl和KCl)。

此时的结果表明，κ角叉菜胶是用于窦组织的非常安全的产品，并且它不会干扰任何正常的生理过程。下面讨论这些实验和结果。

1.实验设计

1.1原代人鼻上皮细胞培养物

从伊丽莎白女王医院人类道德委员会(Queen Elizabeth Hospital HumanEthics Committee)获得从健康志愿者收集细胞学鼻刷的道德批准。从同意的参与者收集鼻刷，排除标准包括主动吸烟、年龄小于18岁、全身性疾病、近期上呼吸道感染以及慢性鼻窦炎或过敏性鼻炎的症状/体征。

使用无菌细胞学刷子从志愿者的鼻腔取出鼻刷，立即转运到支气管上皮细胞生长培养基(BEGM)(Lonza，Basel)中，然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中离心(1700rpm，5分钟)洗涤并重悬于Clonetics^TMB-ALI^TM生长培养基(Lonza，Basel)中。然后在涂有抗CD68(Dako，California)的100mm直径培养板中消除细胞样品中的巨噬细胞，持续20分钟(Malik等人，(2015)Forum Allergy Rhinol.5(6):551-556)。

从培养板中取出细胞样品，并直接接种到涂有1型胶原的T25烧瓶(Corning，NY)上。使细胞生长至80％汇合，然后收获以便接种到涂有胶原的具有0.4μm孔的6.5mm可渗透Transwell插入物(Corning，NY)上，密度为每孔5×104个细胞(Lonza ScientificSupport，2011)。

将细胞培养物在细胞培养箱中在37℃，5％CO2下，用B-ALI^TM生长培养基维持3-4天。然后除去顶部培养基并用B-ALI^TM分化培养基替换基础培养基，每隔一天更换培养基。将空气液体界面处的人鼻上皮培养物(HNEC-ALI)维持至少14天以发展紧密连接并且维持28天以生成纤毛(Lee M-K等人，(Drug Deliv.12(5):305-311；Fulcher等人，(2005)HumanCell culture Protocols.Springer第183-206页)。

1.2角叉菜胶鼻及窦(sinonasal)溶液

按照Marinomed Biotechnologies GmbH的指导，通过在80℃下加热2小时，将κ-角叉菜胶角和ι-角叉菜胶溶解于无菌MilliQ(Millipore，Billerica，MA)水中至浓度为0.24％。将FLO Sinus Care和FLO CRS以2倍浓度悬浮于无菌MilliQ中。将每种溶液过滤灭菌，然后以1:1的比例混合，以得到：含0.12％κ角叉菜胶的FLO Sinus Care，含0.12％ι角叉菜胶的FLO Sinus Care，含0.12％κ角叉菜胶的FLO CRS和含0.12％ι角叉菜胶的FLO CRS。

然后将溶液在室温下储存。然后将鼻及窦溶液应用至细胞培养物的顶部隔室中持续长达24小时，以确定(i)对细胞活力和炎症的影响，(ii)对粘膜屏障的影响以及(iii)对纤毛功能和结构的影响。

2.细胞活力和炎症

2.1方法

在暴露24小时后从处理的HNEC-ALI的基底外侧隔室收集上清液，并在-20℃下储存直至测量细胞活力和炎性标记物。使用细胞毒性检测试剂盒(Roche，CA)测量乳酸脱氢酶(LDH)以确定细胞活力。在490nm波长下记录制备的样品的吸光度，并使用阴性对照(未处理的细胞)的LDH计算相对活力。使用MMP-2人ELISA(Invitrogen，CA)计算总基质金属肽酶-2(MMP-2)分泌，最小可检测水平<0.1ng/ml。用微量滴定板读数器在450nm下读取制备的样品。结果以ng/ml表示，并表示为相比媒介物对照的百分比(参见等式1)。使用大鼠抗人IL-6抗体(BD Biosciences，New Jersey)测量白细胞介素-6(IL-6)，并与人IL-6标准品(BDBiosciences，New Jersey)进行比较。在微量滴定板读数器中在450nm下测量样品，结果表示为总IL-6(pg/ml)并与对照培养基或仅媒介物对照比较。

等式1：

2.2.结果：乳酸脱氢酶测定

LDH测量值表示为相对于作为阴性对照的对照培养基的倍数变化，显示以下平均值(±SD)：FLO Sinus Care(FLO)1.122(±0.1283)，FLO加0.12％κ角叉菜胶(FLO+κ)0.9512(±0.1679)，FLO加0.12％ι角叉菜胶(FLO+ι)1.003(±0.1582)，FLO CRS 0.946(±0.1526)，FLO CRS加0.12％κ角叉菜胶(CRS+κ)1.001(±0.1585)，FLO CRS加0.12％ι角叉菜胶(CRS+ι)0.9731(±0.154)，如图1A所示)。

当与仅媒介物对照(FLO或CRS)比较时，LDH倍数变化平均值(±SD)为：FLO+κ0.8652(±0.2314)，FLO+ι0.9115(±0.2304)，CRS+κ1.058(±0.01793)以及CRS+ι1.029(±0.01218)，如图1B所示。

2.3结果：基质金属肽酶-2 ELISA

基础MMP-2ELISA测量显示以下平均值(±SD)(ng/ml)：对照培养基6.531ng/ml(±5.138)，FLO 7.924ng/ml(±7.513)，FLO+κ7.907ng/ml(±6.974)，FLO+ι5.247ng/ml(±4.503)，CRS 6.3ng/ml(±6.961)，CRS+κ4.626ng/ml(±3.836)，CRS+ι4.054(±3.309)，如图2A所示。

当与仅媒介物对照比较时，MMp-2变化百分比平均值(±SD)为：FLO+κ104.7％((±12.64)，FLO+ι71.75％(±6.092)，CRS+κ93.17％(±24.18)以及CRS+ι86.5％(±38.51)，如图2B所示。

2.4结果：白细胞介素-6 ELISA

基础IL-6 ELISA测量显示以下平均值(±SD)(pg/ml)：对照培养基31.42pg/ml(±27.89)，FLO 50.28pg/ml(±33.39)，FLO+κ5.626pg/ml(±9.745)，FLO+ι90.39pg/ml(±17.04)m CRS 41.12pg/ml(±71.21)m CRS+κ87.16pg/ml(±87.9)，CRS+ι63.49pg/ml(±58.69)，如图3A和图3B所示。

总之，与仅媒介物对照相比，暴露于角叉菜胶后炎性标记物MMP-2(明胶酶)和IL-6(细胞因子)的表达没有增加，这表明角叉菜胶无促炎作用。

此外，κ角叉菜胶和ι角叉菜胶都没有降低细胞活力。

最后，因为所使用的细胞培养物是以健康的人鼻上皮为模型，所以需要基于本研究的设计，进行另外的实验来确认角叉菜胶是否具有抗炎作用。未来的研究将计划对正常细胞培养物进行炎性刺激或限定一组体外维持的炎性标记物可测量增加的新的患者。

3.粘膜屏障功能

3.1.方法

使用EVOM2上皮伏特欧姆计(World Precision Instruments，FL)测量跨上皮电阻(TEER)，并将结果以Ohm为单位表示为原始值，或表示为相对初始读数的变化。仅取显示>400ohm/cm²(相当于在0.33cm2 transwell膜中>1200ohm)的培养物的TEER值。最初在利用细胞培养基的所有HNEC-ALItranswell样品的顶部和基部上测量TEER，之后除去顶部培养基并用相应的对照或处理替换。

测量的时间点包括0、12和24小时，然后在24小时进行另外的测量，除去顶部处理并用细胞培养基替换以调整由于CRS FLO溶液的低电解质浓度导致的导电性问题。所有测量均在37℃阶段进行。在暴露于角叉菜胶24小时后评定HNEC-ALI培养物的细胞旁渗透性。将4kDa异硫氰酸荧光素(FITC)葡聚糖(Sigma-Aldrich，Saint Louis)添加到顶部隔室中至浓度为3mg/ml，然后在2小时后从基底外侧隔室取样。使用Fluostar Optima 96孔荧光微板读数器，分别使用485nm激发波长和520nm发射波长测量通过的葡聚糖的量。结果假设FITC葡聚糖转移的渗透条件(sink conditions)并根据以下等式进行计算(参见等式2)。(3)

等式2：

Papp是表观渗透系数(cm/s)，dQ/dt(mg/s)是FITC葡聚糖向基底外侧隔室转移的速率，A(cm3)是transwell膜的表面积，C0(mg/ml)是顶部隔室的起始药物浓度。根据Papp值计算倍数变化(参见等式3)。

等式3：

将角叉菜胶处理的样品的Papp与对照培养基或媒介物对照进行比较。

通过将样品固定在2％的多聚甲醛中15分钟进行F-肌动蛋白细胞骨架的免疫细胞化学，然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤样品，干燥并在-4℃下储存。将固定的样本用含0.1％Triton X-100的PBS透化，同时在冰上保持15分钟，在PBS中洗涤三次，并应用蛋白质块(Dako，California)。将样品再次在PBS中洗涤三次，并用1:100的Alexa Fluor 488鬼笔环肽(Life Technologies，California)孵育45分钟，然后在PBS中洗涤三次。添加DAPI(Sigma，St Louis)持续10分钟，接着进行三次PBS洗涤，然后固定在载玻片上。使用ZeissLSM 700倒置显微镜进行共聚焦显微镜检查。鬼笔环肽和DAPI分别以495nm和364nm激发，且以518nm和454nm发射。

3.2结果：跨上皮电阻(TEER)

经处理的HNEC-ALI培养物的跨上皮电阻(TEER)表示为24小时处初始TEER的百分比，显示以下平均值(·}SD)：对照培养基116.9％(·}14.59)，FLO 106.5％(·}19.14)，FLO+κ133.5％(·}29.58)，FLO+ι103.6％(·}25.23)，CRS 137.3％(·}56.16)，CRS+κ184.3％(·}133.9)，CRS+ι122.3％(·}48.59)(图4A)。在相同的细胞缓冲液中进行初始和24小时测量，并如下进行计算(参见等式4)。

等式4：TEER(变化％)＝(TEER(24小时))/(TEER(初始))×100

还展示了取自顶部处理溶液的TEER测量值(参见图4B和图4C)，但这些测量值显示出更大的可变性，这可能是由于FLO CRS溶液的低离子浓度阻碍了阻力而产生的假象。TEER表示为原始值(Ohm)。

在暴露于FLO或FLO CRS溶液中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶24小时后测量表观细胞旁渗透性(Papp)。当与暴露于对照培养基的HNEC-ALI的Papp比较时，平均(±SD)倍数变化值为：FLO 0.6562(±0.6905)，FLO+ι(±0.3961)，CRS 0.5751(±0.4978)，CRS+κ0.3913(±0.0384)，CRS+ι0.2756(±0.1691)，如图5A所示。

当与仅媒介物对照比较时，HNEC-ALI的Papp显示以下平均(±SD)倍数变化值：FLO+κ1.0023(±0.3718)，FLO+ι0.6605(±0.3397)，CRS+κ1.205(±1.067)，CRS+ι0.7638(±0.5211)，如图5B所示。

3.3结果：肌动蛋白细胞骨架免疫细胞化学

在暴露于κ角叉菜胶和ι角叉菜胶的培养物中评定HNEC-ALI特异性F-肌动蛋白定位的形态学特征。肌动蛋白细胞骨架在维持细胞极性、囊泡转运方面起重要作用且与细胞连接完整(包括紧密连接和粘附连接)密切相关。共聚焦成像未显示出肌动蛋白索缺失、分布或细胞形状变化。如图6和图7所示，肌动蛋白的细胞质染色并未特异性增加。

总之，暴露于角叉菜胶不会降低粘膜屏障功能，且通过测量健康人上皮细胞中的TEER或Papp未显示出明显的正常屏障破坏。然而，在来自患病患者的组织中，暴露于FLOCRS的组织中的TEER增加，且暴露于FLO CRS加角叉菜胶的组织中的TEER也增加，但没有显示出对正常屏障的破坏。这些结果显示在下文第6节中。

有一种趋势是ι角叉菜胶将HNEC-ALI的Papp降低至4kDa葡聚糖，这可能与对连接屏障、肌动蛋白细胞骨架的组分的直接作用有关或者是由于大分子尺寸化合物存在由此限制了渗透性。

尽管未定量F-肌动蛋白染色，但是暴露于角叉菜胶(主要是ι角叉菜胶)的样本的顶部F-肌动蛋白链复杂性似乎增加。

4.纤毛功能和结构

4.1方法

在倒置显微镜(Olympus，Tokyo)上使用20×物镜和1.5×放大率评定HNEC-ALI培养物的纤毛摆动频率(CBF)。使用Model Basler acA645-100μm USB3相机(Basler AG，Ahrensburg，Germany)以每秒100帧的速度以640×480像素的分辨率录制视频。使用Sisson-Ammons视频分析(SAVA)系统分析录制的视频样品(Sisson等人，(2003)211(2):103-111)。所有测量均在22℃的室温下进行。

在添加实验条件之前采集基线CBF，最初用100μl PBS洗涤HNEC-ALI培养物，然后将40μl室温PBS添加到顶部隔室中。从每种培养物的两个独立区域进行基线测量。除去顶部PBS并添加对照培养基、仅媒介物对照或含角叉菜胶的溶液。在前20分钟每5分钟取连续读数，以评定CBF的任何早期刺激/减慢，另外在第6和24小时取读数。

结果表示为平均CBF(Hz)以及与基线相比较的变化百分比。将扫描电子显微镜检查(SEM)样本固定在含4％多聚甲醛和1.25％戊二醛的磷酸盐缓冲溶液中，并在4℃下储存。将样品在缓冲液中洗涤并用乙醇连续脱水，随后浸入六甲基二硅氮烷(HMDS)的1:1混合物中，然后浸入100％的HMDS中。将样本固定在铝短柱上并涂覆碳。使用Philips XL30场发射枪SEM(Philips，the Netherlands)在5kV的加速电压下在真空下拍摄图像(Mallants等人，(2009),J.Pharm.Pharmacol.161(7):883-890)；Murphy等人，(2015)Ophthal PlatReconstr Surg.31(5):396-400)。

4.2.结果：纤毛摆动频率-初步：基于两次重复

纤毛摆动频率测量显示以下原始值(图8A)：FLO基线(8.06，8.67Hz)，5分钟(7.93，5.98Hz)，10分钟(7.42，6.87Hz)，15分钟(8.22，6.32Hz)，20分钟(7.46，7.57Hz)，6小时(6.82，6.80Hz)，24小时(8.15，6.56Hz)；FLO+κ基线(8.37，9.05Hz)，5分钟(8.16，7.78Hz)，10分钟(7.88，7.36Hz)，15分钟(8.08，7.66Hz)，20分钟(7.86，7.79Hz)，6小时(6.6，7.59Hz)，24小时(7.27，6.94Hz)；FLO+ι基线(8.17，6.72Hz)，5分钟(8.94，6.7Hz)，10分钟(8.43，7.15Hz)，15分钟(8.17，7.56Hz)，20分钟(9.14，8.23Hz)，6小时(8.0，7.04Hz)，24小时(7.9，7.11Hz)；CRS基线(7.1，8.05Hz)，5分钟(7.18，7.58Hz)，10分钟(6.64，7.23Hz)，15分钟(7.32，7.99Hz)，20分钟(7.32，7.34Hz)，6小时(6.05，7.32Hz)，24小时(6.35，7.29Hz)；CRS+κ基线(6.98，7.69Hz)，5分钟(6.65，6.84Hz)，10分钟(6.89，6.19Hz)，15分钟(6.36，6.43Hz)，20分钟(6.93，7.21Hz)，6小时(6.53，6.65Hz)，24小时(7.11，6.79Hz)；CRS+ι基线(7.75，6.42Hz)，5分钟(7.15，7.21Hz)，10分钟(7.16，7.1Hz)，15分钟(7.55，8.08Hz)，20分钟(7.09，7.39Hz)，6小时(6.95，7.23Hz)，24小时(8.55，6.78Hz)。

将CBF随时间的变化与基线测量值进行比较，显示出ι角叉菜胶在20分钟内和长达24小时内刺激纤毛的趋势，如图8B所示。这些溶液对CRS患者细胞的纤毛摆动频率的影响表明，FLO CRS最初在5分钟时导致CBF降低，在24小时时恢复正常(参见下文第6节)。通过添加κ角叉菜胶可以防止这种影响。FLO Sinus Care对患病组织培养物的CBF具有类似的影响，添加κ角叉菜胶可再次逆转这种影响。这表明κ角叉菜胶对纤毛生理有保护作用。结果显示在图18中，并在下文第6.17节中提到)。

通过扫描电子显微镜检查在10,000x放大率下观察纤毛上皮细胞的形态学特征。如所示的，在所有实验条件下均观察到正常的纤毛细胞和周围的微绒毛(参见图9和图10)。由于处理期间细胞层的变形，在此情形下不进行大的场分析。

基于重复实验的结果，关于健康组织培养物的当前数据显示出这样的趋势：ι角叉菜胶可以增强CBF，使之高于FLO或FLO CRS溶液的CBF。在短时间暴露或长达24小时内不存在明显的纤毛停滞或纤毛毒性。

5.施用包含κ-角叉菜胶的组合物

包含在等渗载体溶液中的κ-角叉菜胶的组合物通过将市售粉末形式的κ-角叉菜胶溶解在水中以达到约0.12％wt/v的κ-角叉菜胶的最终浓度来制备。水的量可选自50ml、100ml或200ml。但是，根据所需用途，也可以使用其他量。可以在添加得到等渗载体溶液所需的组分之前或之后将粉末状κ-角叉菜添加到水中。

尽管任何等渗载体溶液都可以与κ-角叉菜胶组合使用，但是使用包含NaCl和KCl的等渗溶液可以获得最佳结果。例如，载体溶液可以由FLO Sinus Care或FLO CRS制成。载体溶液按照制造商的说明进行配制。

用上述组合物治疗的受试者可以在治疗期间站立或坐着。优选地，受试者位于水槽或碗上方以确保载体溶液在递送至鼻通道后在排出时可被接住。通过正压冲洗装置将溶液施加到鼻孔，该装置的操作方式为：简单地挤压瓶子，直到约100mL的递送溶液经由一个鼻孔进入鼻腔和鼻旁窦腔中并从另一个鼻孔排出。然后可以对另一个鼻孔重复此过程。为了帮助将溶液递送到鼻窦，受试者可以头部朝下，鼻子冲着地面以便冲洗鼻和窦通道。

当用于儿童时，每个鼻孔约50ml的体积应该足以同时清洁和治疗粘膜了。在成人中，70-90ml的体积通常足以清洁和治疗粘膜。

用于正压冲洗装置的瓶子的一个实例如图11所示。瓶子设计成确保将溶液递送到鼻和窦通道中。图1的瓶子具有宽的颈部，该颈部允许瓶子的部件可完全拆下，从而在使用后进行清洗并彻底干燥。这显着地限制了致病细菌的过度生长以及鼻通道(包括鼻旁窦)的后续再次侵染。

本文所述的组合物可以持续使用，特别是当用于治疗终身疾患慢性鼻窦炎时。因此，经指示治疗可以每天一次或最多每天两次。或者，可以按照医生的指示使用组合物。

6.与对照相比，角叉菜胶组合物在CRS患者中的影响

测试了含有角叉菜胶(ι或κ)的鼻喷雾溶液对纤毛摆动频率(CBF)、粘膜屏障功能以及对在空气-液体界面生长并从CRS患者的鼻息肉或者非CRS对照收获的原代人鼻上皮细胞的炎性反应的影响。

6.1人原代鼻上皮细胞

从伊丽莎白女王医院人类研究道德委员会获得从慢性鼻窦炎(CRS)患者和非CRS对照中收集细胞学鼻刷的道德批准。从同意的参与者收集鼻刷。排除标准包括主动吸烟、年龄小于18岁以及全身性疾病。

根据如Ramezanpour M等人，Th17 cytokines disrupt the airway mucosalbarrier in chronic rhinosinusitis.Mediators of inflammation；第2016卷,(2016)所述的方法通过温和刷洗从窦粘膜收获人鼻上皮细胞(HNEC)。将从患慢性鼻窦炎与鼻息肉木糖醇(CRSwNP)的患者和非CRS患者提取的细胞悬浮于支气管上皮生长培养基(BronchialEpithelial Growth Media，BEGM，CC-3170，Lonza，Walkersville，MD，USA)中，然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中离心(1700rpm，5分钟)洗涤，并重悬于Clonetics^TMB-ALI^TM生长培养基(Lonza，Walkersville，MD，USA)中。

然后在涂有抗CD68(Dako，Glostrup，Denmark)的100mm直径培养板中将细胞样品耗尽巨噬细胞，持续20分钟。从培养板中取出细胞样品，并接种在涂有I型胶原(ThermoScientific，Walthman，MA，USA)的烧瓶上。在第2代测试HNEC，并通过对泛细胞角蛋白和CD45抗体(均来自Abcam，Cambridge，MA，USA)的反应性确认其为上皮细胞系。

6.2空气液体界面培养物

根据如Ramezanpour M等人，Th17Cytokines Disrupt the Airway MucosalBarrier in Chronic Rhinosinusitis.Mediators of Inflammation,第2016卷(2016)所述的Lonza ALI培养方法(Lonza，Walkersville，USA)，将HNEC维持在空气液体界面(ALI)培养基中。使细胞生长至80％汇合，然后收获以接种到涂有胶原的6.5mm可渗透Transwells(BD Biosciences，San Jose，California，USA)上，密度为每孔7×10⁴个细胞。将细胞培养物在细胞培养箱中在37℃，5％CO2下，用B-ALI^TM生长培养基的维持3-4天。在气升步骤中，除去顶部培养基并用500μl的B-ALI^TM分化培养基替换基础培养基。每隔一天向培养物补料，方式为将B-ALI完全分化培养基添加到基室中。将空气液体界面的HNEC(HNEC-ALI)维持至少14天以发展紧密连接并且维持28天以生成纤毛。

6.3角叉菜胶鼻及窦溶液

按照Marinomed Biotechnologies GmbH的指导，通过在80℃下加热2小时，将κ角叉菜胶和ι角叉菜胶溶解在无菌MQ水(Millipore，Billerica，MA)中至浓度为0.24％。将FLOSinus Care和FLO CRS(ENT Technologies，Australia)以2倍浓度悬浮于无菌MQ水中。将每种溶液过滤灭菌，然后以1:1的比例混合，以得到：含0.12％κ角叉菜胶的FLO Sinus Care，含0.12％ι角叉菜胶的FLO Sinus Care，含0.12％κ角叉菜胶的FLO CRS和含0.12％ι角叉菜胶的FLO CRS。然后将溶液在室温下储存并应用至细胞培养物的顶部隔室中持续长达24小时。

6.4跨上皮电阻(TEER)

使用EVOM2上皮伏特欧姆计(World Precision Instruments，FL)测量跨上皮电阻(TEER)，结果以Ohm为单位表示为原始值，或表示为相对初始读数的变化。仅取显示>400Ω/cm²(相当于在0.33cm2transwell膜中>1200ohm)的培养物的TEER值。将100μl的B-ALI培养基添加到ALI培养物的顶室中以形成跨越细胞单层并进入基室的电路。在测量期间，使用加热平台将培养物维持在37℃。将相应的处理或对照(阴性对照B-ALI培养基和阳性对照2％Triton×100)添加到每个孔的底部室中，并在0和24h时间点获得TEER测量值。

6.5渗透性测定

在暴露于角叉菜胶24小时后评定HNEC-ALI培养物的细胞旁渗透性。将4kDa异硫氰酸荧光素(FITC)葡聚糖(Sigma-Aldrich，Saint Louis)添加到顶部隔室中至浓度为3mg/ml，然后在2小时后从基底外侧隔室取样。通过Fluostar Optima 96孔荧光微板读数器(FLUOstar Optima，BMG Labtech，Ortenberg，Germany)，分别使用485nm激发波长和520nm发射波长测量通过的葡聚糖的量。

6.6细胞毒性测定

对HNEC-ALI培养物应用所有处理并孵育24h。使用细胞毒性检测试剂盒(Roche，CA)测量乳酸脱氢酶(LDH)以确定细胞活力。简言之，将每个孔中50ml的培养基转移到新的板中，向上清液中添加50ml LDH试剂，并在室温下避光孵育30分钟。在FLUOstar OPTIMA读板仪(BMG Labtech，Ortenberg，Germany)上在490nm处记录制备的样品的吸光度，并且相对于阴性对照(未处理的细胞)的LDH水平计算相对活力。

6.7酶联免疫吸附测定(ELISA)

在暴露于处理24小时后，从处理的HNEC-ALI培养物的基底外侧隔室收集上清液。根据制造商的说明，用MMP-2(Invitrogen，CA，USA)和IL-6 ELISA试剂盒(BD Biosciences，New Jersey)测定总基质金属肽酶-2(MMP-2)和白细胞介素-6(IL-6)蛋白水平。所有测量均一式两份进行。从标准曲线计算组织样品浓度并校正蛋白浓度。

6.8免疫荧光显微镜检查

将样品在含福尔马林的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定10min，用PBS洗涤，用含0.1％Triton X-100的PBS在冰上透化15分钟，然后用无血清阻断剂(SFB；Dako，Glostrup，Denmark)在室温下阻断60分钟。在4℃下添加在TBST-10％SFB中稀释至5μg/ml的小鼠单克隆抗人ZO-1抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)过夜。除去过量的一抗，添加2μg/ml的抗小鼠Alexa-Fluor 488偶联的二抗(Jackson ImmunoResearch Labs Inc.，West Grove，PA，USA)并在室温下孵育1小时。将膜在PBS中清洗并添加200ng/ml的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Sigma，Aldrich)以溶解细胞核。将膜转移到载玻片上，并在盖子滑动之前添加一滴抗褪色封固剂(Dako，Glostrup，Denmark)。通过使用LSM700共聚焦扫描激光显微镜(ZeissMicroscopy，Germany)显现样品。

6.9纤毛功能和结构

在倒置显微镜(Olympus IX70，Tokyo)上使用20X物镜和1.5×放大率评定HNEC-ALI培养物的纤毛摆动频率(CBF)。使用Model Basler ac A645-100μm USB3相机(BaslerAG，Ahrensburg，Germany)以每秒100帧的速度以640×480像素的分辨率录制视频。使用Sisson-Ammons视频分析(SAVA)系统分析录制的视频样品。所有测量均在室温下进行。在添加实验条件之前采集基线CBF。最初用100μl PBS洗涤HNEC-ALI培养物，然后向顶部隔室中添加40μl PBS。从每种培养物的两个独立区域进行基线测量。除去顶部PBS并添加对照培养基、仅媒介物对照或含角叉菜胶的溶液。在前20分钟每5分钟取连续读数，以评定CBF的任何早期刺激/减慢。另外在第6和24小时取读数。结果表示为平均CBF(Hz)以及与基线相比较的变化百分比。

6.10统计分析

数据表示为平均值±SEM。使用来自CRS患者和非CRS患者的三次重复结果进行TEER实验，它们的值相对于患者时间0处的平均值进行标准化。使用t检验进行TEER统计分析，并且使用ANOVA进行所有其他分析，随后使用SPSS(版本22)进行Tukey HSD post hoc检验。

结果

6.11结果：乳酸脱氢酶测定

通过测量HNEC-ALI培养物的LDH释放来评定细胞活力。暴露于FLO CRS或FLOSinus Care中的κ角叉菜胶和ι角叉菜胶24h显示：在CRS患者(图12A)和非CRS对照(图12B)中上述任何处理都未使LDH释放显着增加(P>0.05)。

参考图12A和图12B，这些图显示了如通过LDH测定所确定的，在应用κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLO Sinus Care、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO CRS阴性对照(培养基)和阳性对照(0.5％Triton X-100)后24h，来自CRS患者(图12A)和非CRS对照患者(图12B)的HNEC单层中相对于无处理对照的活力。相对于作为阴性对照的未处理的细胞计算细胞活力。值显示为平均值±SEM，n＝3。使用ANOVA，接以Tukey HSDpost hoc检验。^*＝p<0.05。

6.12结果：基质金属肽酶-2 ELISA

在CRS患者和非CRS对照患者中，应用κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLOCRS、ι角叉菜胶/FLO Sinus Care、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care和FLO CRS 24小时后未改变上清液中的MMP-2分泌。

暴露于κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLO SinusCare、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care、FLO CRS和阴性对照(培养基)24小时后，来自CRS患者(图13A)和非CRS对照患者(图13B)的HNEC单层中HNEC所分泌的基质金属蛋白酶-2(MMP2)表示为总MMP2水平(ng/ml)。值显示为平均值±SEM，n＝3。使用ANOVA，接以TukeyHSD post hoc检验。

6.13结果：白细胞介素-6 ELISA

应用Flo Sinus Care中的κ角叉菜胶24小时显着降低了源自CRS患者的HNEC单层的上清液中的IL-6蛋白质浓度(p＝0.037)。

暴露于κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLO SinusCare、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care、FLO CRS和阴性对照(培养基)24小时后，在来自CRS患者(图14A)和非CRS对照患者(图14B)的HNEC单层中HNEC上清液中的白细胞介素-6蛋白水平表示为总(pg/ml)。值显示为平均值±SEM，n＝3。使用ANOVA，接以Tukey HSD posthoc检验。^*＝p<0.05。

6.14结果：跨上皮电阻(TEER)

角叉菜胶κ/FLO CRS和FLO CRS使HNEC ALI培养物的TEER增加。从6个供体(3个CRSwNP和3个对照)建立HNEC-ALI培养物。κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLOCRS、ι角叉菜胶/FLO Sinus Care、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care、FLO CRS、阴性对照(培养基)和阳性对照(0.5％Triton X-100)的影响通过在24h后测量跨越来自CRSwNP患者和对照的HNEC单层的TEER来检查。在CRS患者中，孵育24h后κ角叉菜胶/Flo CRS(p＝0.04)和FLO CRS(p＝0.02)显着增加TEER。其他处理对CRS患者或对照中的TEER未显示出任何显着影响(图15A和图15B)。

来自CRSwNP患者(A)和非CRS对照患者(B)的HNEC单层中的按治疗前测量值标准化的TEER值(如图15A和15B中黑条所示)以及应用κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLO Sinus Care、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care、FLO CRS、阴性对照(培养基)和阳性对照(0.5％Triton X-100)后24小时的TEER值(灰条)。值显示为平均值±SEM，n＝3。使用t检验，^*＝p<0.05。

6.15结果：细胞旁渗透性-葡聚糖测定

FLO Sinus Care或FLO CRS中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶不增加HNEC-ALI培养物的细胞旁渗透性。应用κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLOSinus Care、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care和FLO CRS对源自CRS患者和对照的HNEC-ALI单层的细胞旁渗透性没有显着影响(图16A和图16B)(P>0.05)。阳性对照(0.5％Triton X-100)(低渗透性)和阴性对照(培养基)(高渗透性)显示出预期的渗透性值。

在应用κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLO SinusCare、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care、FLO CRS、阴性对照(培养基)和阳性对照(0.5％Triton X-100)24小时后测量HNEC单层中的FITC-葡聚糖通过，CRSwNP患者的值显示在(图16A)中，非CRS对照患者的值显示在图16B中。值显示为平均值±SEM，n＝3。使用ANOVA，接以Tukey HSD post hoc检验。^*＝p<0.05。

6.16结果：肌动蛋白细胞骨架免疫细胞化学

FLO Sinus Care或FLO CRS中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶不影响ZO-1和F-肌动蛋白在HNEC-ALI单层中的定位。通过使用免疫荧光和共聚焦激光扫描显微镜检查，在应用处理后24小时检查κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLO SinusCare、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care和FLO CRS对ZO-1和F-肌动蛋白定位的影响。如所预期的，在未处理的细胞中，ZO-1或F-肌动蛋白位于单层顶侧的外围。对FLO Sinus Care或FLO CRS中κ角叉菜胶和ι角叉菜胶的共聚焦成像显示，在CRS患者和非CRS对照患者中ZO-1或F-肌动蛋白的定位没有改变。

研究了CRS患者和对照的HNEC单层中ZO-1和F-肌动蛋白的免疫定位。κ角叉菜胶/FLO Sinus Care、κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLO Sinus Care、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO Sinus Care和FLO CRS、阴性对照(培养基)和阳性对照(0.5％Triton X-100)对CRS患者的HNEC单层中闭合小环蛋白-1(ZO-1)免疫定位的影响(图17A)以及对CRS患者的HNEC单层中F-肌动蛋白免疫定位的影响(图17B)。使用DAPI对细胞核染色(蓝色染色)，白条为20μm。使用共聚焦激光扫描显微镜检查，20X放大率。

6.17结果：纤毛摆动频率

FLO Sinus Care或FLO CRS中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶在24小时后不影响HNEC-ALI单层中的纤毛摆动频率。在HNEC-ALI培养物中在不同时间点(0、5min、10min、20min、6h和24h)评定纤毛摆动频率。暴露于FLO CRS或FLO Sinus Care中的κ角叉菜胶和ι角叉菜胶24h显示在任何处理下CRS患者和非CRS患者中的CBF并无显着差异。测量值表示以下时间点的平均值(Hz)：5分钟、10分钟、20分钟、6小时和24小时。值显示为平均值±SEM，n＝3(图18)。

6.18结果：处理对细胞迁移的影响-对照患者

研究了处理对对照患者的细胞迁移的影响。与阴性对照相比，处理κ(0.4mg/ml)+FLO CRS(p＝0.461)和FLO CRS(p＝0.095)的迁移率没有显着差异。利用处理κ(1.2mg/ml)+FLO CRS(p＝0.015)、ι(1.2mg/ml)+FLO CRS(p＝0.001)和ι(0.4mg/d)+FLO CRS(p＝0.003)，迁移率低于阴性对照。结果显示在图19A和图19B中。数据是平均值±SD，通过线性回归分析比较迁移率。当p≤0.05时，差异被认为是显着的。

在应用κ角叉菜胶/FLO CRS、ι角叉菜胶/FLO CRS、FLO CRS和阴性对照(培养基)后24小时，在来自CRSwNP患者(图19A)和非CRS对照患者(图19B)的HNEC单层中进行伤口愈合迁移测定。值显示为平均值±SEM，n＝3。使用ANOVA，接以Tukey HSD post hoc检验。^*＝p<0.05。

6.19结果：炎性反应

在CRS患者中，FLO Sinus Care或FLO CRS中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶不抑制HNEC/ALI中的IL-6的促炎反应。先前的研究表明，Poly(I:C)LMW始终诱导HNEC/ALI单层的炎性细胞因子(包括IL-6和TNF-α)分泌。为了确定ι角叉菜胶和κ角叉菜胶抑制促炎反应的可能性，在不存在或存在Poly(I:C)LMW(10μg/ml)的情况下，将FLO CRS和FLO Sinus Care中的这两种角叉菜胶应用于来自CRS患者和非CRS对照的HNEC/ALI单层。IL-6细胞因子的分析显示，用以下角叉菜胶κ/FLO Sinus Careκ/FLO Sinus Care、角叉菜胶κ/FLO CRS、角叉菜胶ι/FLO Sinus Care、角叉菜胶ι/FLO CRS、FLO Sinus Care和FLO CRS处理并未抑制CRS患者和非CRS患者中的促炎反应。

研究了在FLO CRS和FLO Sinus Care中递送的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶对抑制促炎反应的影响，并且结果显示在图20A和图20B中。在CRS患者(图20A)和非CRS患者(图20B)中，在用Poly(I:C)LMW刺激的同时角叉菜胶κ/FLO Sinus Care、角叉菜胶κ/FLO CRS、角叉菜胶ι/FLO Sinus Care、角叉菜胶ι/FLO CRS、FLO Sinus Care和FLO CRS对HNEC/ALI的影响。使用布地奈德作为护理控制的抗炎标准。阴性对照是未处理的细胞(培养基)。数据显示为平均值±SD(n＝3)。

讨论

已显示缺陷性上皮紧密连接(TJ)屏障功能是上呼吸道炎性疾病发展的致病因素。在上面讨论的本研究中，评定了FLO Sinus Care或FLO CRS中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶对自CRS患者和非CRS(对照)患者收获的原代人鼻上皮细胞的粘膜纤毛功能以及屏障结构和功能的影响。

该研究表明，这些处理无毒并且未对上皮屏障功能造成不利影响。相反，应用具有/不具有κ角叉菜胶的FLO CRS(等渗溶液)在24小时后显着增强源自CRS患者的人鼻上皮细胞单层的TEER。与阴性对照相比，TEER的变化与细胞旁渗透性的变化无关，证据为应用不同处理时荧光标记的珠子的细胞旁通过相同。这些发现表明，具有/不具有κ角叉菜胶的FLOCRS主要在炎性病状诸如在CRS患者中断续式地增强粘膜屏障功能。众所周知，溶液的离子强度直接影响TEER读数，另外还众所周知的是与阴性对照溶液相比，TEER读数增加可至少部分地归因于这些溶液的离子组成差异。无论如何，所观察到的影响是供体依赖性的这一观点表明，即使在发生多次体外细胞分裂后，CRS和对照HNEC的生理学也存在差异。

白细胞介素-6(IL-6)是重要的促炎细胞因子，并且在慢性过敏性呼吸道炎症中起重要作用。IL-6引起急性期反应，并触发调节炎症的细胞内信号传导级联反应。已知特定的角叉菜胶变体可诱导炎症，保护生物免受感染。然而，保护程度取决于不同类型的角叉菜胶之间不同的多糖结构。实际上，λ角叉菜胶可有效诱导IL-6分泌，而κ角叉菜胶诱导IL-6的作用极小。角叉菜胶的分子量(由硫酸酯基团的数量决定)在这些分子的免疫刺激特性中起到关键作用。欧盟委员会(European Commission)建议用作食品添加剂的角叉菜胶的分子量应大于50kDa，以避免任何安全风险。

在本研究中使用的κ角叉菜胶和ι角叉菜胶的分子量分别为约200kDa和500kDa。这些结果表明，在于FLO Sinus Care中稀释的κ角叉菜胶的存在下，来自CRS患者的HNEC-ALI单层的上清液中的IL-6蛋白水平降低。这些结果表明，当在FLO Sinus Care中稀释时，κ角叉菜胶可具有抗炎特性。尚不清楚上清液中IL-6蛋白水平降低是因为HNEC-ALI细胞产生和分泌IL-6，还是因为FLO Sinus Care中的κ卡拉胶可能部分复合上清液中的IL-6蛋白。无论如何，在本研究中已显示κ角叉菜胶具有抗炎特性。

确定所观察到的影响是否特定于IL-6，或者其他细胞因子，诸如FGF-2、趋化因子(Fractalkine)、GRO、G-CSF、IL-8、IL-1a、IP-10、IL-10和IFN-a2是否也可能受到FLO SinusCare中κ角叉菜胶存在的影响也将是令人关注的。

鉴于IL-6结果，研究了κ角叉菜胶对来自CRS患者和非CRS患者的HNEC/ALI培养物中的促炎反应的抑制的影响。在κ角叉菜胶存在下，用Poly(I:C)LMW刺激的HNEC/ALI培养物不抑制IL-6的促炎反应。FLO Sinus Care或FLO CRS中的另一种聚合物ι角叉菜胶未下调IL-6的产生。

基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在呼吸上皮细胞内的组织修复和重塑中起主要作用。先前已在鼻息肉病中发现MMP-2水平升高。在本研究中，发现MMP-2在源自CRS患者和非CRS患者的HNEC-ALI单层上清液中以低水平存在，并且κ角叉菜胶或ι角叉菜胶溶液不影响MMP-2蛋白水平。

肌动蛋白细胞骨架在维持细胞极性、囊泡转运中起重要作用，并且与包括紧密连接和粘附连接以及桥粒的细胞连接复合体密切相关。紧密连接用作围栏，将质膜区分为顶部区域和基底外侧区域，并且还用作控制相邻细胞之间离子和溶质的细胞旁通路的门。在紧密连接形成中，ZO-1是跨膜蛋白咬合蛋白(occlaudin)、闭合蛋白(claudin)和紧密粘附分子(Junction Adhesion Molecule，JAM)与细胞质组分之间的必要蛋白质，它在粘附处(Adherens)和紧密连接处(Tight junctions)之间形成带。目前的发现表明，FLO SinusCare或FLO CRS中的κ角叉菜胶和ι角叉菜胶不影响ZO-1或肌动蛋白的定位，这表示它们不会损害粘膜屏障结构。

总之，本研究的结果表明FLO Sinus Care或FLO CRS中的κ角叉菜胶或ι角叉菜胶对HNEC-ALI单层无细胞毒性，不诱导促炎反应且不损害粘膜屏障结构或功能。具有和不具有κ角叉菜胶的FLO CRS增加TEER，而当FLO Sinus Care中存在κ角叉菜胶时分泌的IL-6水平降低。总之，此数据表明在FLO CRS和FLO Sinus Care中稀释的ι角叉菜胶和κ角叉菜胶可对粘膜屏障结构和功能产生有益特性，并且在局部应用时可以减轻炎症。

Claims

1.一种包含κ-角叉菜胶和载体溶液的组合物，其中所述载体溶液是等渗溶液。

2.根据权利要求1所述的组合物，还包含第二活性剂。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中κ-角叉菜胶的量为约0.01％wt/v至约15％wt/v。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中κ-角叉菜胶的所述量为约0.12％wt/v。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述载体溶液的体积为约50ml至约350ml。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述载体溶液包含NaCl和KCl。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述载体溶液还包含五水合乳酸钙、碳酸氢钠、葡萄糖、木糖醇或赤藓醇中的一种或多种。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述载体溶液具有低离子强度。

9.根据权利要求2至8中任一项所述的组合物，其中所述第二活性剂是选自包含用于治疗上呼吸道疾病或病状的药剂、药物或剂的组。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述第二活性剂是选自包含以下的组：抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂、抗炎剂和抗氧化剂。

11.一种用于治疗上呼吸道疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的患者施用一种组合物，所述组合物包含在等渗载体溶液中的治疗有效量的κ-角叉菜胶。

12.根据权利要求11所述的方法，其中κ-角叉菜胶的所述量为约0.01％至约15％。

13.根据权利要求12所述的方法，其中κ-角叉菜胶的所述量为约0.12％。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述组合物还包含第二活性剂。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二活性剂是选自包含用于治疗所述上呼吸道疾病或病状的药剂、药物或剂的组。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述待治疗的疾病或病状是选自包含以下的组：非过敏性鼻炎、过敏性鼻炎、急性窦炎、过敏性和非过敏性病因引起的鼻窦炎、以及慢性鼻窦炎。

17.一种试剂盒，其包括：治疗量的粉末形式的κ-角叉菜胶、待重构以制备等渗载体溶液的粉末、以及它们的使用说明。

18.根据权利要求16所述的试剂盒，其还包括正压冲洗装置。

19.治疗有效量的κ-角叉菜胶在制备用于治疗上呼吸道疾病或病状的药剂中的用途。