CN108697712A - 增强β细胞复制和/或存活 - Google Patents

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Abstract

在某些实施方案中，提供促进哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能的方法，其中所述方法包括将与GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)结合的GABA受体活化配体施用到哺乳动物，其中所述GABA受体活化配体在比当单独使用时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所使用的剂量低的剂量下使用并且/或者所述阳性变构调节剂在亚治疗剂量下使用。

Description

增强β细胞复制和/或存活
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年10月14日提交的USSN 62/241,566和2016年1月18日提交的USSN 62/279,908的权益和优先权，两者均出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
政府资助声明
本发明根据美国国立卫生研究院授予的授权号DK092480在政府资助下进行。政府享有本发明中的某些权利。
背景
β细胞(β-细胞)是位于胰腺中的郎格罕氏胰岛(islets of Langerhans)中的制造并分泌胰岛素的一类胰腺细胞，胰岛素是控制血液中的葡萄糖水平的激素。
胰腺具有两个主要功能：(i)产生消化酶，所述消化酶由外分泌腺泡细胞分泌并且通过分支导管网络引导至肠；以及(ii)调节血糖，这通过郎格罕氏胰岛的内分泌细胞实现。若干种单独的内分泌细胞类型包括胰岛。胰腺β细胞(还称为β-细胞或“β细胞”)最为突出，其根据种类代表总计细胞的约50％-80％。β细胞产生多种多肽，包括：胰岛素，它是控制血液中的葡萄糖水平的激素；C肽，它是胰岛素产生的副产物，帮助预防神经病和糖尿病的与血管退化相关的其他症状；以及胰淀素，还已知为胰岛淀粉样多肽(IAP或IAPP)，其作为内分泌胰腺的一部分来起作用并且有助于血糖控制。高血糖素产生α细胞是第二最常见的细胞类型。剩余的胰岛细胞(各自占总计细胞的很少数)包括：δ细胞，其产生促生长素抑制素；PP细胞，其产生胰多肽；以及ε细胞，其产生生长素释放肽。
β细胞的功能受损和/或数量减少牵涉到代谢疾病，包括糖尿病、肥胖症和其他病症。
概述
发现GABA可抑制T细胞介导的自身免疫疾病的不同模型中的自身免疫应答、增强Treg应答、抑制β细胞凋亡并且促进小鼠β细胞复制。将这些发现进行延伸，发现GABAA-受体(GABAA-R)和GABAB-R两者的活化可促进小鼠β细胞复制以及人类β细胞复制。然而，GABA对于其受体具有相对低的亲和力，在体内具有较快的解离速率(off-rate)和较短的半衰期，这可能需要患者为了治疗功效一天摄取若干克的GABA几次，这在一定程度上是麻烦的并且减少患者顺从性。
令人意外的发现是，与GABAA-R阳性变构调节剂(PAM)组合的GABA受体活化配体可促进哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能(例如，胰岛素产生、对血糖的敏感性等)。此外，特别令人意外的是，GABA受体活化配体和PAM的组合在对于β细胞的这些作用中是协同的。
本文设想的各种实施方案可包括但不需要限于以下中的一个或多个：
实施方案1：一种促进哺乳动物中β细胞的复制、生长、和/或存活和/或功能的方法，所述方法包括将GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)以足以促进所述哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或生长和/或质量和/或功能的量施用到所述哺乳动物。
实施方案2：如实施方案1所述的方法，其中所述GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)与GABA受体活化配体结合施用。
实施方案3：如实施方案2所述的方法，其中当与所述PAM结合使用时，所述GABA受体活化配体比当任一药剂单独施用时更有效于促进所述哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能。
实施方案4：如实施方案3所述的方法，其中当与PAM结合使用时，所述GABA受体活化配体比当任一药剂单独施用时至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少1.2倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少10倍更有效于促进所述哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能。
实施方案5：如实施方案2所述的方法，其中所述GABA受体活化配体在比当单独使用时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所使用的剂量低的剂量下使用，并且/或者所述阳性变构调节剂在比当所述PAM单独使用时实现所述PAM被设计和/或批准的活性所使用的剂量低的剂量下使用。
实施方案6：如实施方案5所述的方法，其中所述GABA受体活化配体在当所述GABA受体活化配体单独使用时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所使用的剂量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下使用。
实施方案7：如实施方案5-6中任一项所述的方法，其中所述阳性变构调节剂在当所述PAM单独使用时实现所述PAM被设计和/或批准的活性所使用的剂量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下使用。
实施方案8：如实施方案5-7中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体在比当单独使用时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所使用的剂量低的剂量下使用，并且/或者所述阳性变构调节剂在亚治疗剂量下使用。
实施方案9：如实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述施用促进β细胞的复制。
实施方案10：如实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述施用增加β细胞的质量。
实施方案11：如实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述施用促进β细胞的存活。
实施方案12：如实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述施用促进β细胞的功能。
实施方案13：如实施方案12所述的方法，其中所述施用增加胰岛素含量和/或由β细胞分泌的胰岛素的量。
实施方案14：如实施方案12所述的方法，其中所述施用通过增加胰岛素阳性β细胞的数量来促进功能。
实施方案15：如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
实施方案16：如实施方案15所述的方法，其中所述哺乳动物是诊断患有I型糖尿病的人类。
实施方案17：如实施方案15所述的方法，其中所述哺乳动物诊断为前驱糖尿病的。
实施方案18：如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是非人类哺乳动物。
实施方案19：如实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM协同作用来改善所述β细胞的复制和/或存活和/或生长和/或功能。
实施方案20：如实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述PAM包括选自由AP325和AP3组成的组的药剂。
实施方案21：如实施方案20所述的方法，其中所述PAM包括AP325。
实施方案22：如实施方案21所述的方法，其中所述AP325在比针对神经性疼痛或脊髓损伤所使用的剂量低的剂量下施用。
实施方案23：如实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述PAM包括选自由巴比妥酸盐、苯并二氮杂、喹唑啉酮、以及神经类固醇组成的组的药剂。
实施方案24：如实施方案23所述的方法，其中所述PAM包括巴比妥酸盐。
实施方案25：如实施方案24所述的方法，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的巴比妥酸盐：阿洛巴比妥(5,5-二烯丙基巴比妥酸盐)、异戊巴比妥(5-乙基-5-异戊基-巴比妥酸盐)、阿普比妥(5-烯丙基-5-异丙基-巴比妥酸盐)、烯丙苯巴比妥(5-烯丙基-5-苯基-巴比妥酸盐)、巴比妥(5,5-二乙基巴比妥酸盐)、溴烯比妥(5-烯丙基-5-(2-溴-烯丙基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-(1-甲基丁基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-苯基巴比妥酸盐)、司可巴比妥(5-[(2R)-戊-2-基]-5-丙-2-烯基-巴比妥酸盐)。
实施方案26：如实施方案23所述的方法，其中所述PAM包括苯并二氮杂。
实施方案27：如实施方案26所述的方法，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的苯并二氮杂：阿普唑仑、溴西泮、利眠宁、咪达唑仑、氯硝西泮、氯氮、地西泮、艾司唑仑、氟西泮、哈拉西泮、凯他唑仑、劳拉西泮、硝西泮、奥沙西泮、普拉西泮、夸西泮、替马西泮、以及三唑仑。
实施方案28：如实施方案26所述的方法，其中所述PAM包括阿普唑仑。
实施方案29：如实施方案28所述的方法，其中所述阿普唑仑在比治疗焦虑症、惊恐症和/或由抑郁导致的焦虑所使用的剂量小的剂量下施用。
实施方案30：如实施方案28所述的方法，其中所述阿普唑仑如下施用：作为立即释放片剂口服小于1.5mg/天或口服小于1.0mg/天、或口服小于0.5mg/天，或者作为延长释放片剂口服小于0.5mg/天、或口服小于约0.4mg/天或口服小于约3mg/天。
实施方案31：如实施方案26所述的方法，其中所述PAM包括咪达唑仑。
实施方案32：如实施方案31所述的方法，其中所述咪达唑仑在比减少焦虑、或在医疗程序或手术之前产生睡意或麻醉、或维持镇静或麻醉所使用的剂量小的剂量下施用。
实施方案33：如实施方案31所述的方法，其中所述咪达唑仑在小于1mg的剂量下IV施用、或在小于约0.8mg的剂量下IV施用、或在小于约0.5mg的剂量下IV施用、或在小于约0.01mg/kg的剂量下IV施用、或在小于约0.07mg/kg的剂量下IM施用、或在小于约0.05mg/kg的剂量下IM施用、或在小于约0.03mg/kg的剂量下IM施用、或在小于约0.01mg/kg的剂量下施用。
实施方案34：如实施方案26所述的方法，其中所述PAM包括氯硝西泮。
实施方案35：如实施方案34所述的方法，其中所述氯硝西泮在比治疗癫痫病症(包括失神癫痫或伦-加综合征)所使用的剂量小或比治疗成年人中的惊恐症(包括广场恐怖症)所使用的剂量小的剂量下施用。
实施方案36：如实施方案34所述的方法，其中所述氯硝西泮在小于约0.5mg/天的剂量下口服施用、或在小于约0.25mg/天的剂量下口服施用、或在小于约0.01mg/kg/天的剂量下施用、或在小于约0.005mg/kg/天的剂量下施用。
实施方案37：如实施方案23所述的方法，其中所述PAM包括神经类固醇。
实施方案38：如实施方案37所述的方法，其中所述PAM包括选自由别孕烷醇酮(3α-羟基-5α-孕烷-20-酮)和孕烷醇酮组成的组的神经类固醇。
实施方案39：如实施方案2-38中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体包括GABA。
实施方案40：如实施方案2-38中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体包括选自由以下组成的组的药剂：巴马鲁唑、gabamide、GABOB、加波沙朵、鹅膏蕈氨酸、异去甲槟榔次碱、异哌啶甲酸、蝇蕈醇、非尼布特、匹卡米隆、氟柳双胺、quisqualamine、氟柳双胺酸(SL 75102)、硫代蝇蕈碱、普加巴林、氨己烯酸、6-氨基烟酸、高牛磺酸、以及XP13512[(±)-1-([(α-异丁酰氧基乙氧基)羰基]氨基甲基)-1-环己烷乙酸]。
实施方案41：如实施方案1-40中任一项所述的方法，其中所述方法在胰岛移植之后增加β细胞存活。
实施方案42：如实施方案1-41中任一项所述的方法，其中所述方法在胰岛移植之后增加胰岛中的β细胞复制。
实施方案43：如实施方案1-40中任一项所述的方法，其中所述方法在胰岛植入之后进行以便减少由于低氧和压力造成的β细胞损失。
实施方案44：如实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述方法在植入后进行多至3天、或植入后进行多至1周、或植入后进行多至2周、或植入后进行多至3周、或植入后进行多至4周、或植入后进行多至5周、或植入后进行多至6周、或植入后进行多至7周、或植入后进行多至8周、或植入后进行多至3个月、或植入后进行多至4个月、或植入后进行多至5个月、或植入后进行多至6个月。
实施方案45：如实施方案2-44中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体不是醇。
实施方案46：如实施方案2-45中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体不是麻醉椒内酯。
实施方案47：如实施方案2-46中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体不是黄芩或黄芩成分。
实施方案48：如实施方案2-47中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体不是缬草或缬草成分。
实施方案49：如实施方案2-48中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体不是挥发性气体。
实施方案50：如实施方案1-49中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物不针对选自由以下组成的组的一种或多种病状进行治疗：神经性疼痛、脊髓损伤、焦虑症、惊恐症、由抑郁导致的焦虑、癫痫病症(包括失神癫痫或伦-加综合征)、以及月经性癫痫。
实施方案51：如实施方案1-50中任一项所述的方法，其中不施用所述PAM来在医疗程序或手术之前产生睡意或麻醉或维持镇静或麻醉。
实施方案52：如实施方案1-51中任一项所述的方法，其中是BBB可透过的所述PAM在低于针对CNS适应症所使用的剂量的剂量下施用。
实施方案53：一种药学制剂，其包含GABA受体活化配体和GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)。
实施方案54：如实施方案53所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体比在包含单独的GABA受体活化配体的治疗制剂中在更低的单位剂量下存在，并且/或者所述PAM比在包含单独的所述PAM的治疗制剂中处于更低的单位剂量下。
实施方案55：如实施方案54所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体比在包含单独的GABA或GABA类似物的治疗制剂中在更低的单位剂量下存在。
实施方案56：如实施方案55所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体在当所述GABA受体活化配体单独存在时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所提供的剂量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下存在。
实施方案57：如实施方案53-56的实施方案中任一项所述的制剂，其中所述PAM比在包含单独的所述PAM的治疗制剂中处于更低的单位剂量下。
实施方案58：如实施方案57所述的制剂，其中所述阳性变构调节剂在当所述PAM单独使用时实现所述PAM被设计和/或批准的活性所存在的量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下存在。
实施方案59：如实施方案53-58中任一项所述的制剂，其中所述GABA或GABA类似物和所述PAM以足以提供刺激表达GABAA受体的细胞的复制的协同活性的浓度存在。
实施方案60：如实施方案53-58中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM以足以提供刺激β细胞的复制和/或促进β细胞的存活和/或改善β细胞的功能的协同活性的浓度存在。
实施方案61：如实施方案53-60中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM以足以提供比当任一药剂单独施用时促进哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能的功效大至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少1.2倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少10倍的浓度存在。
实施方案62：如实施方案53-61中任一项所述的制剂，其中所述PAM包括选自由巴比妥酸盐、苯并二氮杂、喹唑啉酮、以及神经类固醇组成的组的药剂。
实施方案63：如实施方案62所述的制剂，其中所述PAM包括巴比妥酸盐。
实施方案64：如实施方案63所述的制剂，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的巴比妥酸盐：阿洛巴比妥(5,5-二烯丙基巴比妥酸盐)、异戊巴比妥(5-乙基-5-异戊基-巴比妥酸盐)、阿普比妥(5-烯丙基-5-异丙基-巴比妥酸盐)、烯丙苯巴比妥(5-烯丙基-5-苯基-巴比妥酸盐)、巴比妥(5,5-二乙基巴比妥酸盐)、溴烯比妥(5-烯丙基-5-(2-溴-烯丙基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-(1-甲基丁基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-苯基巴比妥酸盐)、司可巴比妥(5-[(2R)-戊-2-基]-5-丙-2-烯基-巴比妥酸盐)。
实施方案65：如实施方案62所述的制剂，其中所述PAM包括苯并二氮杂。
实施方案66：如实施方案65所述的制剂，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的苯并二氮杂：阿普唑仑、溴西泮、利眠宁、咪达唑仑、氯硝西泮、氯氮、地西泮、艾司唑仑、氟西泮、哈拉西泮、凯他唑仑、劳拉西泮、硝西泮、奥沙西泮、普拉西泮、夸西泮、替马西泮、以及三唑仑。
实施方案67：如实施方案65所述的制剂，其中所述PAM包括阿普唑仑。
实施方案68：如实施方案65所述的制剂，其中所述PAM包括咪达唑仑。
实施方案69：如实施方案65所述的制剂，其中所述PAM包括氯硝西泮。
实施方案70：如实施方案62所述的制剂，其中所述PAM包括神经类固醇。
实施方案71：如实施方案70所述的制剂，其中所述PAM包括选自由别孕烷醇酮和孕烷醇酮组成的组的神经类固醇。
实施方案72：如实施方案53-71中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体包括GABA。
实施方案73：如实施方案53-71中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体包括选自由以下组成的组的药剂：巴马鲁唑、gabamide、GABOB、加波沙朵、鹅膏蕈氨酸、异去甲槟榔次碱、异哌啶甲酸、蝇蕈醇、非尼布特、匹卡米隆、氟柳双胺、quisqualamine、氟柳双胺酸(SL 75102)、硫代蝇蕈碱、普加巴林、氨己烯酸、6-氨基烟酸、高牛磺酸、以及XP13512[(±)-1-([(α-异丁酰氧基乙氧基)羰基]氨基甲基)-1-环己烷乙酸]。
实施方案74：如实施方案53-73中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体不是醇。
实施方案75：如实施方案53-74中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体不是麻醉椒内酯。
实施方案76：如实施方案53-75中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体不是黄芩或黄芩成分。
实施方案77：如实施方案53-76中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体不是缬草或缬草成分。
实施方案78：一种用于促进哺乳动物中表达GABAA受体的细胞的复制的试剂盒，所述试剂盒包括：包含GABA受体活化配体的容器；以及包含GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)的容器。
实施方案79：如实施方案78所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM在同一容器中。
实施方案80：如实施方案78所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM在单独容器中。
实施方案81：如实施方案78-80中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体比在包含单独的GABA或GABA类似物的治疗制剂中在更低的单位剂量下存在，并且/或者所述PAM比在包含单独的所述PAM的治疗制剂中处于更低的单位剂量下。
实施方案82：如实施方案78-80中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体比在包含单独的GABA或GABA类似物的治疗制剂中在更低的单位剂量下存在。
实施方案83：如实施方案82所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体在当所述GABA受体活化配体单独存在时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所提供的剂量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下存在。
实施方案84：如实施方案78-83中任一项所述的试剂盒，其中所述PAM比在包含单独的所述PAM的治疗制剂中处于更低的单位剂量下。
实施方案85：如实施方案78-84中任一项所述的试剂盒，其中所述阳性变构调节剂在当所述PAM单独使用时实现所述PAM被设计和/或批准的活性所存在的量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下存在。
实施方案86：如实施方案78-85中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM以足以提供刺激表达GABAA受体的细胞的复制的协同活性的浓度存在。
实施方案87：如实施方案78-85中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM以足以提供刺激β细胞的复制和/或促进β细胞的存活和/或改善β细胞的功能的协同活性的浓度存在。
实施方案88：如实施方案78-87中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM以足以提供比当任一药剂单独施用时促进哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能的功效大至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少1.2倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少10倍的浓度存在。
实施方案89：如实施方案78-88中任一项所述的试剂盒，其中所述PAM包括选自由巴比妥酸盐、苯并二氮杂、喹唑啉酮、以及神经类固醇组成的组的药剂。
实施方案90：如实施方案89所述的试剂盒，其中所述PAM包括巴比妥酸盐。
实施方案91：如实施方案90所述的试剂盒，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的巴比妥酸盐：阿洛巴比妥(5,5-二烯丙基巴比妥酸盐)、异戊巴比妥(5-乙基-5-异戊基-巴比妥酸盐)、阿普比妥(5-烯丙基-5-异丙基-巴比妥酸盐)、烯丙苯巴比妥(5-烯丙基-5-苯基-巴比妥酸盐)、巴比妥(5,5-二乙基巴比妥酸盐)、溴烯比妥(5-烯丙基-5-(2-溴-烯丙基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-(1-甲基丁基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-苯基巴比妥酸盐)、司可巴比妥(5-[(2R)-戊-2-基]-5-丙-2-烯基-巴比妥酸盐)。
实施方案92：如实施方案89所述的试剂盒，其中所述PAM包括苯并二氮杂。
实施方案93：如实施方案92所述的试剂盒，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的苯并二氮杂：阿普唑仑、溴西泮、利眠宁、咪达唑仑、氯硝西泮、氯氮、地西泮、艾司唑仑、氟西泮、哈拉西泮、凯他唑仑、劳拉西泮、硝西泮、奥沙西泮、普拉西泮、夸西泮、替马西泮、以及三唑仑。
实施方案94：如实施方案92所述的试剂盒，其中所述PAM包括阿普唑仑。
实施方案95：如实施方案92所述的试剂盒，其中所述PAM包括氯硝西泮。
实施方案96：如实施方案92所述的试剂盒，其中所述PAM包括咪达唑仑。
实施方案97：如实施方案89所述的试剂盒，其中所述PAM包括神经类固醇。
实施方案98：如实施方案97所述的试剂盒，其中所述PAM包括选自由别孕烷醇酮和孕烷醇酮组成的组的神经类固醇。
实施方案99：如实施方案78-98中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体包括GABA。
实施方案100：如实施方案78-98中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体包括选自由以下组成的组的药剂：巴马鲁唑、gabamide、GABOB、加波沙朵、鹅膏蕈氨酸、异去甲槟榔次碱、异哌啶甲酸、蝇蕈醇、非尼布特、匹卡米隆、氟柳双胺、quisqualamine、氟柳双胺酸(SL 75102)、硫代蝇蕈碱、普加巴林、氨己烯酸、6-氨基烟酸、高牛磺酸、以及XP13512[(±)-1-([(α-异丁酰氧基乙氧基)羰基]氨基甲基)-1-环己烷乙酸]。
实施方案101：如实施方案78-100中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体不是醇。
实施方案102：如实施方案78-101中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体不是麻醉椒内酯。
实施方案103：如实施方案78-102中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体不是黄芩或黄芩成分。
实施方案104：如实施方案78-103中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体不是缬草或缬草成分。
定义
术语“GABA受体活化配体”指代是GABA受体中的一种或多种的激动剂的药剂。在某些实施方案中，GABA受体活化配体是至少GABAA受体的激动剂。
术语“GABAA受体的阳性变构调节剂”或(PAM)指代增加脊椎动物中枢神经系统中的GABAA受体蛋白的活性的分子。与GABAA受体激动剂不同，GABAA-R PAM不在与γ-氨基丁酸(GABA)神经递质分子相同的活性位点处结合。在各种实施方案中，PAM触发或强化GABAA受体以打开其氯化物通道。
术语“β细胞功能”指代β细胞的功能，特别是关于胰岛素产生、分泌和β细胞面积的功能。增加β细胞功能指代增加β细胞的胰岛素含量和/或增加由β细胞进行的胰岛素分泌和/或增加胰岛素阳性β细胞的数量。
当关于PAM使用时，术语“亚治疗剂量”指代低于当针对PAM最初被设计和/或批准的活性所使用时PAM的批准的和/或建议的和/或识别的剂量的剂量。因此，例如，苯并二氮杂(诸如阿普唑仑)的亚治疗剂量指代低于此苯并二氮杂针对抑郁、惊恐症和/或焦虑的批准的和/或建议的和/或识别的剂量的剂量。在某些实施方案中，亚治疗剂量是PAM被设计和/或批准的活性(例如，抑郁、惊恐症和/或焦虑)的建议剂量的小于90％或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％。
当有关使用本文所述的活性剂使用时，短语“结合(in conjunction with)”或“组合(in combination with)”(例如，与本文所述的一种或多种其他药物(例如，一种或多种PAM)结合的一种或多种GABA受体活化配体)指示施用GABA受体活化配体和PAM，使得其对于生物体、并且具体地对于β细胞的生理活性存在至少某一时间重叠。因此，在各种实施方案中，GABA受体活化配体和PAM可同时和/或顺序施用。在顺序施用中，在施用第二部分之前，可甚至存在某一相当大的延迟(例如，几分钟或甚至几小时或几天)，只要当第二施用药剂施用或在生物体中变得具有活性时，第一施用药物/药剂已施加对于生物体的某一生理改变即可。
附图简述
图1示出展示GABA受体亚单元的示意图。此图仅示出苯并二氮杂结合位点。存在对于其他种类的PAM的其他结合位点。
图2.在3H胸腺嘧啶的存在下，在具有或没有阿普唑仑(30ng/ml)的培养基中孵育人类胰岛(50个/孔)4天。所示的数据是相对于在单独的培养基的情况下培养物的增殖(标示为1)的增殖的平均速率。N＝使用一式三份培养物的两个独立的研究。数据在两个研究中非常相似。
图3在3H胸腺嘧啶的存在下，将人类胰岛(50IEQ/孔)与指示剂量的GABA连同或不连同阿普唑仑(30ng/ml)孵育4天。所示的数据是相对于在没有GABA或阿普唑仑的情况下培养物的增殖(标示为1)的增殖的平均速率。N＝两个独立的研究
图4，图片A和图片B，示出咪达唑仑增强INS-1细胞的增殖。图片A)示出在10倍增长的宽剂量范围上的结果。图片B)示出在较小剂量增量的较小剂量范围上的结果。
图5，图片A和图片B，示出使用咪达唑仑或氯硝西泮进行的处理增强体外GABA诱导的INS-1细胞增殖。
图6示出使用AP325或AP3进行的处理不刺激体外INS-1细胞增殖。数据表达为来自至少三个单独实验的相对于没有任何处理的对照的细胞增殖％的平均值±SD。对照细胞增殖标示为100。
图7示出AP325增强体外GABA刺激的INS-1细胞增殖。数据表达为来自至少三个单独实验的相对于没有任何处理的对照的细胞增殖的平均值±SD。对照细胞增殖标示为1。
图8示出AP3增强体外GABA诱导的INS-1细胞增殖。数据表达为来自至少三个单独实验的对于没有任何处理的对照的相对细胞增殖的平均值±SD。对照细胞增殖标示为1。诱导与对照的显著差异的处理在实施例3中阐明)。
图9，图片A-图片H：图片A)INS-1细胞中的GAD酶活性。将INS-1细胞和293T细胞(在生长期中收获)以及新鲜小鼠大脑和人类胰岛在-80C下保存，直至使用为止。将样品均化到具有蛋白酶抑制剂的GAD活性测定缓冲液中。使用标准CO2捕集测定(一式四份)评估均化物内的GAD酶活性，如先前所述的(Kaufman等人(1991)J.Neurochem.56:720-723)。所示的数据是来自三个实验的来自代表性测定的平均CPM+/-SEM。图片B)PAM对于INS-1细胞增殖的作用。将INS-1细胞与在10-9M至10-6M的剂量范围下的指示PAM一起培养并且评估其增殖。所示的数据是相对于在单独的培养基的情况下培养物的增殖(标示为1)的增殖的平均速率。将阿普唑仑(图片C)、咪达唑仑(图片D)、氯硝西泮(图片E)、AP325(图片F)、或AP3(图片G)在指示浓度下与一定剂量范围的GABA一起孵育。对照培养物在指示浓度下与单独的GABA一起孵育。相对于在单独培养基的情况下的对照培养物。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001相对于在相同剂量的GABA的情况下的培养物。H)将INS-1细胞与GABA(0.3mM)和咪达唑仑或氯硝西泮(100nM)在具有或没有TSPO抑制剂PK11195(1uM)的情况下一起培养48h。
图10示出阿普唑仑增强人类胰岛细胞复制。将新鲜人类胰岛使用指示剂量的GABA连同或不连同指示的PAM进行处理，如在方法中所描述的。所示的数据是相对于在单独的培养基的情况下培养物的增殖(标示为1)的增殖的平均速率。N＝使用一式三份培养物的两个独立的研究。结果在两个研究中非常相似。*p<0.05
图11示出GABA结合位点阻断剂/抑制剂荷包牡丹碱消除阿普唑仑增强胰岛细胞复制的能力。将人类胰岛与阿普唑仑(100nM)连同标准剂量范围的荷包牡丹碱(0-50uM)一起孵育。所示的数据是相对于在单独的培养基的情况下培养物的增殖(标示为1)的增殖的平均速率。
图12示出阿普唑仑增强GABA促进人类胰岛细胞复制的能力。在3H胸腺嘧啶的情况下，将人类胰岛与一定剂量范围的GABA连同阿普唑仑(100ng/ml)一起孵育4天。所示的数据是在代表性研究中相对于在单独的培养基的情况下培养物的增殖(标示为1)的增殖的平均速率。N＝使用一式三份培养物的两个独立的研究。和针对GABA或GABA+阿普唑仑相对于对照培养基。*p<0.05和***P<0.01针对GABA+阿普唑仑相对于单独的GABA。
详细描述
本文所述的组合物和方法涉及以下发现：与GABAA受体的阳性变构调节剂组合的GABA受体活化配体可促进哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能。此外，使用与阳性变构调节剂组合的GABA受体活化配体比单独使用的GABA受体活化配体提供对于β细胞复制和/或存活和/或功能的显著更大作用。不受特定理论的限制，似乎GABA受体活化配体和PAM的组合对于β细胞复制和/或存活和/或功能具有协同作用。
鉴于GABA受体活化配体和PAM的组合所提供的改善的作用，认识到GABA受体活化配体和/或PAM可在比当GABA受体活化配体或PAM单独使用以促进哺乳动物中(例如，接受胰岛细胞移植的哺乳动物中)β细胞的复制和/或存活和/或功能时所使用的剂量低的剂量下使用。
因此，在各种实施方案中，提供促进哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能的方法，其中所述方法涉及将与GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)结合的GABA受体活化配体施用到有需要的哺乳动物(例如，接受胰岛细胞移植的受试者)，其中所述GABA受体活化配体在比当单独使用时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所使用的剂量低的剂量下使用并且/或者所述阳性变构调节剂在亚治疗剂量下使用。在某些实施方案中，施用两种药剂促进β细胞的复制。在某些实施方案中，施用两种药剂促进β细胞的存活。在某些实施方案中，施用两种药剂促进β细胞的功能(例如，增加胰岛素含量和/或分泌)。在某些实施方案中，施用两种药剂增加胰岛素阳性β细胞的数量。
在某些实施方案中，提供包含GABA受体活化配体和GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)的药学制剂。在某些实施方案中，还设想用于实践本文所述的方法的试剂盒。在各种实施方案中，此类试剂盒包括：包含GABA受体活化配体的容器和包含GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)的容器以及任选地说明性材料教义，特别是这些药剂在本文所述的方法中的用途。
GABA受体活化配体
GABA受体活化配体是本领域的技术人员熟知的。此类配体包括例如γ-氨基丁酸(GABA)，它是GABA受体的天然配体。其他GABA受体活化配体包括但不限于高牛磺酸、巴马鲁唑、gabamide、GABOB、加波沙朵、鹅膏蕈氨酸、异去甲槟榔次碱、异哌啶甲酸、蝇蕈醇、非尼布特、匹卡米隆、氟柳双胺、quisqualamine、氟柳双胺酸(SL 75102)、硫代蝇蕈碱、普加巴林、氨己烯酸、6-氨基烟酸、XP13512((±)-1-([(α-异丁酰氧基乙氧基)羰基]氨基甲基)-1-环己烷乙酸)等。
这些GABA受体活化配体意图是例示性且非限制性的。其他GABA受体活化配体是本领域的技术人员已知的，并且设想其在本文所述的方法、制剂和试剂盒中的用途。
GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)
GABAA受体的阳性变构调节剂(PAM)是本领域的技术人员熟知的。例示性PAM包括但不限于醇(例如，乙醇、异丙醇)、齐墩螨素(例如，伊维菌素)、巴比妥酸盐(例如，戊巴比妥)、苯并二氮杂、溴化物(例如，溴化钾)、氨基甲酸酯(例如，甲丙氨酯、卡立普多)、氯醛糖、氯美扎酮、氯美噻唑、二氢麦角灵(例如，二氢麦角碱(ergoloid)(二氢麦角碱(dihydroergotoxine)))、依他西平、艾替伏辛、咪唑(例如，甲苄咪唑)、麻醉椒内酯(发现于麻醉椒中)、氯瑞唑、刺激神经的类固醇(例如，别孕烷醇酮、加奈索酮)、非苯并二氮杂(例如，扎来普隆、唑吡坦、佐匹克隆、右佐匹克隆)、培曲氯醛、苯酚(例如，异丙酚)、哌啶二酮(例如，格鲁米特、甲乙哌啶酮)、丙泮尼地、吡唑并吡啶(例如，伊他唑酯)、喹唑啉酮(例如，安眠酮)、黄芩成分(例如，黄芩属的成分，包括但不限于类黄酮诸如黄芩素)、司替戊醇、磺酰基烷烃(例如，眠砜甲烷、四乙眠砜、台俄那)、缬草成分(例如，戊酸、戊烯酸)、以及某些挥发物/气体(例如，水合氯醛、氯仿、二乙醚、七氟烷)。在各种实施方案中，与GABA受体活化配体组合使用的PAM排除醇、和/或麻醉椒内酯、和/或黄芩或黄芩成分、和/或缬草或缬草成分、和/或挥发性气体。
在某些实施方案中，PAM包括选自由巴比妥酸盐、苯并二氮杂、喹唑啉酮、以及神经类固醇组成的组的药剂。例示性巴比妥酸盐包括但不限于阿洛巴比妥(5,5-二烯丙基巴比妥酸盐)、异戊巴比妥(5-乙基-5-异戊基-巴比妥酸盐)、阿普比妥(5-烯丙基-5-异丙基-巴比妥酸盐)、烯丙苯巴比妥(5-烯丙基-5-苯基-巴比妥酸盐)、巴比妥(5,5-二乙基巴比妥酸盐)、溴烯比妥(5-烯丙基-5-(2-溴-烯丙基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-(1-甲基丁基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-苯基巴比妥酸盐)、司可巴比妥(5-[(2R)-戊-2-基]-5-丙-2-烯基-巴比妥酸盐)等。
例示性苯并二氮杂包括但不限于阿普唑仑、溴西泮、利眠宁、氯硝西泮、氯氮、地西泮、艾司唑仑、氟西泮、哈拉西泮、凯他唑仑、劳拉西泮、硝西泮、奥沙西泮、普拉西泮、夸西泮、替马西泮、三唑仑等。
例示性神经类固醇包括但不限于别孕烷醇酮和孕烷醇酮。
在某些实施方案中，具有特定用途的PAM包括阿普唑仑
这些PAM意图是例示性且非限制性的。其他PAM是本领域的技术人员已知的，并且设想其在本文所述的方法、制剂和试剂盒中的用途。
组合制剂。
在各种实施方案中，设想包含一种或多种GABA受体活化配体和GABAA受体的一种或多种阳性变构调节剂的药学制剂。在某些实施方案中，GABA受体活化配体比在包含单独的GABA受体活化配体的治疗制剂中在更低的单位剂量下存在，并且/或者PAM比在包含单独的PAM的典型的和/或批准的和/或建议的治疗制剂中处于更低的单位剂量下。
在某些实施方案中，组合制剂中的GABA受体配体包括以下中的一种或多种：γ-氨基丁酸(GABA)、高牛磺酸、巴马鲁唑、gabamide、GABOB、加波沙朵、鹅膏蕈氨酸、异去甲槟榔次碱、异哌啶甲酸、蝇蕈醇、非尼布特、匹卡米隆、氟柳双胺、quisqualamine、氟柳双胺酸(SL75102)、硫代蝇蕈碱、普加巴林、氨己烯酸、6-氨基烟酸、XP13512((±)-1-([(α-异丁酰氧基乙氧基)羰基]氨基甲基)-1-环己烷乙酸)等，例如，如本文所述的。
在某些实施方案中，组合制剂中的PAM包括以下中的一种或多种：醇(例如，乙醇、异丙醇)、齐墩螨素(例如，伊维菌素)、巴比妥酸盐(例如，戊巴比妥)、苯并二氮杂、溴化物(例如，溴化钾)、氨基甲酸酯(例如，甲丙氨酯、卡立普多)、氯醛糖、氯美扎酮、氯美噻唑、二氢麦角灵(例如，二氢麦角碱(ergoloid)(二氢麦角碱(dihydroergotoxine)))、依他西平、艾替伏辛、咪唑(例如，甲苄咪唑)、麻醉椒内酯(发现于麻醉椒中)、氯瑞唑、刺激神经的类固醇(例如，别孕烷醇酮、加奈索酮)、非苯并二氮杂(例如，扎来普隆、唑吡坦、佐匹克隆、右佐匹克隆)、培曲氯醛、苯酚(例如，异丙酚)、哌啶二酮(例如，格鲁米特、甲乙哌啶酮)、丙泮尼地、吡唑并吡啶(例如，伊他唑酯)、喹唑啉酮(例如，安眠酮)、黄芩成分(例如，黄芩属的成分，包括但不限于类黄酮诸如黄芩素)、司替戊醇、磺酰基烷烃(例如，眠砜甲烷、四乙眠砜、台俄那)、缬草成分(例如，戊酸、戊烯酸)。在各种实施方案中，与GABA受体活化配体组合使用的PAM排除醇、和/或麻醉椒内酯、黄芩或黄芩成分等，例如，如本文所述的。
在某些实施方案中，组合制剂包含GABA和阿普唑仑。
活性剂(例如，本文所述的GABA受体活化配体和PAM)可以“天然”形式或以盐、酯、酰胺、前药、衍生物等形式(若需要)配制和施用，前提是盐、酯、酰胺、前药或衍生物是药理学上合适的，即在本发明的方法中是有效的。活性剂的盐、酯、酰胺、前药和其他衍生物可使用标准程序来制备，所述标准程序是合成有机化学领域的技术人员已知的并且例如由March(1992)Advanced Organic Chemistry；Reactions,Mechanisms and Structure，第4版N.Y.Wiley-Interscience进行描述并且如上所述。
例如，药学上可接受的盐可针对具有能够形成盐的功能性的本文所述的药剂(例如，本文所述的GABA受体活化配体和PAM)中的任一种来制备。药学上可接受的盐是保留母体化合物的活性并且不对其被施用的受试者和在其被施用的环境中的受试者赋予任何有害或不良作用的任何盐。
在各种实施方案中，药学上可接受的盐可衍生自有机或无机碱。盐可以是单价或多价离子。特别感兴趣的是无机离子、锂、钠、钾、钙、和镁。有机盐可使用胺、特别是铵盐诸如单烷基、二烷基和三烷基胺或乙醇胺来制备。--盐也可使用咖啡碱、氨丁三醇和类似分子来形成。
将药学活性剂配制为盐、酯、酰胺、前药等的方法是本领域的技术人员熟知的。例如，盐可使用通常涉及与合适的酸的反应的常规方法由游离碱制备。通常，药物的碱形式在极性有机溶剂(诸如甲醇或乙醇)中溶解，并且向其添加酸。所得的盐发生沉淀或可通过添加极性较低的溶剂来从溶液析出。用于制备酸加成盐的合适的酸包括但不限于有机酸以及无机酸两者，有机酸例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。酸加成盐可通过使用合适的碱进行处理来转化为游离碱。本文的活性剂的某些特别优选的酸加成盐包括卤化物盐，诸如可使用盐酸或氢溴酸制备的卤化物盐。相反，本发明的活性剂的碱性盐的制备使用药学上可接受的碱以相似的方式制备，所述药学上可接受的碱诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等。特别优选的碱性盐包括碱金属盐，例如钠盐和铜盐。
对于盐形式的碱性药物的制备，反离子的pKa优选地比药物的pKa低至少约2个pH单位。相似地，对于盐形式的酸性药物的制备，反离子的pKa优选地比药物的pKa高至少约2个pH单位。这允许反离子将溶液的pH调节至比pH最大低的水平以达到盐稳定，此时盐的稳定性相比于游离酸或游离碱的稳定性占优势。活性药学成分(API)中以及酸或碱中的可离子化基团的pKa单位的差异的广义规则意味着使质子传递在能量上是有利的。当API和反离子的pKa不是显著地不同时，固态复合物可形成，但是可在水性环境中快速失衡(即，分解成药物和反离子的个体实体)。
优选地，反离子是药学上可接受的反离子。合适的阴离子盐形式包括但不限于乙酸盐、苯甲酸盐、苄酸盐、酒石酸氢盐、溴化物、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘化物、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、磷酸盐和二磷酸盐、水杨酸盐和二水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘、戊酸盐等，而合适的阳离子盐形式包括但不限于铝、苄星、钙、乙二胺、赖氨酸、镁、葡甲胺、钾、普鲁卡因、钠、氨丁三醇、锌等。
酯的制备通常涉及存在于活性剂的分子结构内的羟基和/或羧基的官能化。在某些实施方案中，酯通常是游离醇基团的酰基取代的衍生物，即衍生自具有式RCOOH的羧酸的部分，其中R是烷基，并且优选地是低级烷基。酯可通过使用常规氢解或水解程序转化为游离酸(若需要)。
酰胺也可使用本领域的技术人员已知的或在相关文献中描述的技术来制备。例如，酰胺可使用合适的胺反应物由酯制备，或者它们可通过与氨或低级烷基胺的反应由酸酐或酰氯制备。
在各种实施方案中，本文识别的活性剂(例如，组合的GABA受体活化配体和PAM)可用于胃肠外施用、局部施用(topical administration)、口服施用、鼻部施用(或以其他方式吸入)、直肠施用、或局部施用(local administration)，诸如通过气溶胶或经皮地施用，以用于促进哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能。
在各种实施方案中，本文所述的活性剂还可与药学上可接受的载体(赋形剂)组合以形成包含两种药剂的药理学组合物。药学上可接受的载体可包含一种或多种生理上可接受的化合物，所述化合物例如作用来使组合物稳定或增加或降低活性剂的吸收。生理上可接受的化合物可包括例如碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化剂诸如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质、保护和吸收增强剂诸如脂质、减少活性剂的清除或水解的组合物、或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲液。
其他生理上可接受的化合物、特别是用于制备片剂、胶囊、凝胶帽等的化合物包括但不限于粘结剂、稀释剂/填料、崩解剂、润滑剂、悬浮剂等。
在某些实施方案中，为了制造口服剂型(例如，片剂)，将例如赋形剂(例如，乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇等)、任选的崩解物(例如，碳酸钙、羧甲基纤维素钙、淀粉羟乙酸钠、交聚维酮等)、粘结剂(例如，α-淀粉、阿拉伯胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、环糊精等)、以及任选的润滑剂(例如，滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇6000等)添加到一种或多种活性组分(例如，阿拉丙酯和本文所述的其他化合物、或其互变异构体或立体异构体、或所述阿拉丙酯和其他化合物、所述立体异构体、或所述互变异构体的药学上可接受的盐或溶剂合物、或其类似物、衍生物、或前药)，并且压缩所得的组合物。在需要的情况下，压缩的产物例如使用已知的方法进行包衣以用于掩盖味道或用于肠衣溶解或持续释放。合适的包衣材料包括但不限于乙基纤维素、羟甲基纤维素、聚氧乙烯乙二醇(yethylene glycol)、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、以及Eudragit(Rohm&Haas，德国；甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物)。
其他生理上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或具体地可用于阻止微生物的生长或作用的防腐剂。各种防腐剂是熟知的，并且包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域的技术人员将理解，选择药学上可接受的载体(包括生理上可接受的化合物)取决于例如活性剂的施用途径和活性剂的具体物理化学特征。
在某些实施方案中，赋形剂是无菌的并且通常不含不合需要的物质。这些组合物可通过常规的、熟知的灭菌技术进行灭菌。对于各种口服剂型，不需要赋形剂诸如片剂和胶囊灭菌。USP/NF标准通常是足够的。
药学组合物可取决于施用方法以各种单位剂型施用。合适的单位剂型包括但不限于粉剂、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、栓剂、贴片、鼻部喷雾剂、可注射剂、可植入持续释放制剂、粘膜粘附膜、局部用清漆、脂质复合物等。
包含本文所述的活性剂(例如，GABA受体活化配体和PAM)的药学组合物可通过以下手段制造：常规混合、溶解、粒化、糖衣制备、研磨、乳化、封装、包载或冻干过程。药学组合物可使用有助于将活性剂加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和助剂以常规方式来配制。适合的制剂取决于所选施用途径。
在某些实施方案中，组合活性剂(例如，GABA受体活化配体和PAM)被配制用于口服施用。口服施用的合适制剂可易于通过将活性剂与本领域熟知的适于口服递送的药学上可接受的载体组合来制备。此类载体使得本文所述的活性剂能够配制为片剂、丸剂、糖衣、囊片、锭剂、凝胶帽、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等以用于待治疗的患者进行口服摄入。对于口服固体制剂例如像粉末、胶囊和片剂，合适的赋形剂可包括填料诸如糖(例如，乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇)、纤维素制品(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)、合成聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮(PVP))、粒化剂；以及结合剂。若需要，可添加崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐诸如藻酸钠。若需要，固体剂型可使用标准技术进行糖包衣或肠衣包衣。肠衣包衣的颗粒的制备例如在美国专利号4,786,505和4,853,230中进行公开。
对于通过吸入进行的施用，活性剂(例如，本文所述的GABA受体活化配体和PAM)使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加压包装或喷雾器以气溶胶喷雾剂形式方便地递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供阀以递送计量的量来确定。可配制包含化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物的用于在吸入器或吹入器中使用的例如明胶的胶囊和药筒。
在各种实施方案中，本文所述的活性剂被配制用于根据本领域的技术人员熟知的标准方法进行全身性施用(例如，作为可注射的)。全身性制剂包括但不限于被设计用于通过注射(例如，皮下、静脉内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射)进行施用的那些制剂以及被设计用于进行经皮、透粘膜口服或肺部施用的那些制剂。对于注射，本文所述的活性剂可被配制为水性溶液，优选地为生理上相容的缓冲液诸如汉克斯溶液(Hanks solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水缓冲液和/或为某些乳液制剂。所述溶液可包含配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。在某些实施方案中，活性剂可以粉末形式提供以用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)重构。对于透粘膜施用和/或对于血/脑屏障途径，可在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的。可注射的制剂和可吸入的制剂通常提供为无菌或基本上无菌的制剂。
除先前所述的制剂之外，活性剂(例如，本文所述的GABA受体活化配体和PAM)还可配制为储库制品。此类长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。因此，例如，活性剂可与合适的聚合物材料或疏水性材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或配制为微溶的衍生物，例如，配制为微溶盐。
在某些实施方案中，本文所述的活性剂还可使用常规经皮药物递送系统通过皮肤递送，所述经皮药物递送系统即经皮“贴片”，其中活性剂通常包含在充当附贴到皮肤的药物递送装置的层合结构内。在此结构中，药物组合物通常包含在上部背衬层下面的层或“储器”中。应理解，此环境中的术语“储器”指代最终可用于递送到皮肤表面的“活性成分”的量。因此，例如，“储器”可包括呈贴片的背衬层上的粘合剂形式或呈本领域的技术人员已知的任何各种不同基质制剂形式的活性成分。贴片可包含单个储器，或者它可包含多个储器。
在一个例示性实施方案中，储器包括在药物递送期间作用来将所述系统附贴到皮肤的药学上可接受的接触粘合剂材料的聚合物基质。合适的皮肤接触粘合剂材料的实例包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等。可替代地，包含药物的储器和皮肤接触粘合剂作为单独的且不同的层存在，其中粘合剂在储器下面，在此情况下，储器可以是如上所述的聚合物基质，或可以是液体或水凝胶储器，或可采取某一其他形式。在这些层合材料中的背衬层(其充当装置的上表面)优选地用作“贴片”的主要结构元件并且为装置提供其大部分柔性。选择用于背衬层的材料优选地对于活性剂和存在的任何其他材料是基本上不可透过的。
可替代地，可采用其他药学递送系统。例如，脂质体、乳液和微乳液/纳米乳液是可用于保护和递送药学上活性的化合物的递送媒介物的熟知的实例。还可采用某些有机溶剂诸如二甲基亚砜，虽然通常代价是毒性较高。
在某些实施方案中，组合制剂包含的GABA受体活化配体和/或PAM处于比当GABA受体活化配体或PAM单独使用时所提供的剂量低的剂量(单位剂量)下。在某些实施方案中，GABA受体活化配体在当GABA受体活化配体单独使用时促进β细胞的复制和/或存活和/或功能所需要的GABA受体活化配体的小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％、或小于约5％下存在。
在某些实施方案中，PAM在亚治疗剂量下提供。这指代低于当针对PAM最初被设计和/或批准的活性所使用时PAM的批准的和/或建议的和/或识别的剂量的剂量。
因此，例如，用于治疗惊恐症的阿普唑仑(立即释放片剂)的建议的/批准的剂量是一天口服3次0.5mg的初始剂量和在分次剂量中1至10mg/天的维持剂量，其中在分次剂量中，平均剂量是5至6mg/天。延长释放阿普唑仑的建议的/批准的剂量是一天一次0.5mg至1mg，并且维持剂量是一天一次1至10mg，其中平均剂量是一天一次3至6mg。用于治疗成年人抑郁的阿普唑仑(立即释放片剂)的建议的/批准的剂量是一天口服3次0.5mg的初始剂量，其在分次剂量中增加至每日口服3mg的平均有效剂量。针对焦虑的老年剂量在年长或虚弱患者中在一天口服2至3次0.25mg的初始剂量下提供，并且大于2mg的每日剂量作为对于较老成年人的使用潜在地不适当的药物处理满足Beers准则。
在一种制剂中，亚治疗剂量通常在治疗方法中小于最低建议的/批准的单位剂型，例如在阿普唑仑的情况下，作为单位剂型小于0.25mg并且每日小于0.5mg的总剂量。在某些实施方案中，亚治疗剂量是此建议的/批准的剂量的小于90％或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％。
这些剂量意图是例示性且非限制性的。施用到受试者的GABA受体活化配体和PAM的实际剂量可由物理和生理因素决定，所述物理和生理因素诸如体重、病状的严重性、先前或并行的治疗干预、患者的特发病以及施用途径。取决于施用的剂量和途径，优选剂量和/或有效量的施用数量可根据受试者的应答而变化。在任何事件中，负责施用的从业者将决定组合物中的活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。
试剂盒。
在某些实施方案中，提供用于实践本文所述的方法的试剂盒。在各种实施方案中，所述试剂盒包括：包含GABA活化配体的容器；和包含如本文所述的GABAA受体的阳性变构调节剂的容器。在某些实施方案中，试剂盒包含GABA和阿普唑仑。
在某些实施方案中，GABA受体活化配体和PAM可提供在单位剂量制剂(例如，片剂、囊片、贴片等)中，并且/或者可任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。在某些实施方案中，GABA受体活化配体和PAM可提供在单独的容器中。在某些实施方案中，GABA受体活化配体和PAM可提供在同一容器中。在某些实施方案中，GABA受体活化配体和PAM可作为组合制剂提供在同一容器中。
另外，试剂盒任选地包括提供用于实践本发明的方法的指导(即，方案)的标签和/或说明性材料。某些标签或说明性材料描述GABA受体活化配体和PAM的组合促进哺乳动物(例如，接受胰岛细胞移植的哺乳动物)中β细胞的复制和/或存活和/或功能的用途。所述标签或说明性材料还可任选地教导优选的剂量/治疗方案、禁忌症等。
虽然所述说明性材料通常包括书面或打印材料，但是它们并不限于这些。本发明设想能够存储此类说明并将其传达到终端用户的任何媒介。此类媒介包括但不限于电子存储媒介(例如，磁盘、磁带、磁片盒、芯片)、光学媒介(例如，CD ROM)等。此类媒介可包括提供此类说明性材料的互联网站的网址。
实施例
提供以下实施例来说明但不是限制所要求保护的发明。
实施例1
与阿普唑仑组合的GABA受体活化配体增强β细胞复制的用途
在此实施例中，研究苯并二氮杂阿普唑仑与GABA的组合对于β细胞增殖和/或存活的作用。阿普唑仑被广泛地开处方以用于治疗焦虑和惊恐症。在1981年引入之后，阿普唑仑快速成为热门药物，开处方次数超过50百万次。当如所指导的使用时，它对于长期使用是安全的(参见www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2011/018276s045lbl.pdf处的FDA批准的标签)以及(Jonas和Cohon(1993)J.Clin.Psychiatry.54增刊:25-45；讨论6-8))。选择研究阿普唑仑是基于1)其长期安全性特征，和2)其与适当的GABAA-R亚单元的相互作用。
GABA受体活化配体。
GABA对于人类食用是安全的。GABA作为营养品在柜台售卖。观察到进行26周的GABA处理没有显著改变脾单核细胞的总数量或CD4+、CD8+、T和B淋巴细胞的百分比(Tian等人(2004)J.Immunol.173(8):5298-5304)，它也没有使自身反应性T细胞对于GABA介导的抑制脱敏(Tian(2004)J.Immunol.173(8):5298-5304；Tian(2011)Autoimmunity，44:465-470)。在20世纪50年代-20世纪80年代在人类临床试验中测试了长期口服GABA处理在数百个个体中减少癫痫性发作和改善脑血管病症的能力(Otomo等人(1981)Arzneimittelforschung.31(9):1511-1523；Loeb等人(1987)Epilepsy Res.1(3):209-212；Tower和Roberts编Inhibition in the Nervous System and GABA.New York:Pergamon Press，1960；Kuriyama和Sze(1971)Neuropharmacol..10(1):103-108)。结果没有显示不利作用，但是也没有显示临床益处，这可能是因为GABA没有穿过血脑屏障。
药学兴趣关注于可通过血脑屏障并且调控CNS神经元上的GABA-R以改善癫痫病症、焦虑和失眠的药物。GABA不能通过血脑屏障使其对于调控外周GABA-R而没有CNS副作用是理想的。GABA下调炎性应答的能力是适度的，这被视为是有利的，因为对于免疫系统功能的干扰较少并且没有如在其他免疫抑制剂的情况下的白细胞减少。虽然GABA的作用轻微，但是其在具有不同遗传背景的小鼠中高效地预防T1D(Tian等人(2004)J.Immunol.173(8):5298-5304:Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697)、EAE(Bhat(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，107(6):2580-2585)以及类风湿关节炎(Tian(2011)Autoimmunity，44:465-470)，并且改善T2D(Tian等人(2011)PloS one.6(9):e25338)。
GABAA-R和GABAB-R。
存在两种不同类型的GABA-R；GABAA-R和GABAB-R。免疫细胞主要表达GABAA-R(Tian等人(1999)J.Neuroimmunol.96(1):21-28；Tian等人(2004)J.Immunol.173(8):5298-5304；Bhat(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，107(6):2580-2585；Bjurstom等人(2008)J.Neuroimmunol.205:44-50)，而β细胞表达GABAA-R和GABAB-R两者(Ligon等人(1997)Diabetologia，50(4):764-773；Tian等人(2013)Diabetes，62(11):3760-3765；Braun等人(2010)Diabetes，59(7):1694-2701；Gu等人(1993)Life Sci.52(8):687-694；Brice等人(2002)Diabetologia，45(2):242-252；Martin等人(1988)Neuropsychobiology，19(3):146-148)。GABAA-R是具有形成快速作用的氯化物通道的不同亚单元的五聚物。GABAB-R是具有仅两个亚单元的异源二聚体，但是其特性可通过其他细胞蛋白质改变(Schwenk等人(2010)Nature，465(7295):231-235)。GABAB-R形成缓慢作用G-蛋白偶联受体(Bettler等人(2004)Physiol.Rev.84(3):835-867)。因此，GABAA-R和GABAB-R是相当不同的(氯化物通道相对于G-蛋白偶联受体)。此实施例中的关注点在于GABAA-R，因为它们具有同时抑制自身免疫应答并且促进β细胞复制和存活的能力。
存在19种不同的GABAA-R亚单元：六种类型的α亚单元、三种不同的β亚单元、三种γ亚单元、以及一种δ、ε、π、和θ亚单元，加上三种非典型ρ亚单元。五种亚单元以不同的方式组合以形成通常由两种α亚单元、两种β亚单元和其他亚单元类型中的一种组成的GABAA通道(参见图1中的示意图)。具有不同亚单元组合的GABAA-R具有不同的药理学特性和特定的激动剂和拮抗剂(Olsen和Tobin(1990)FASEB J.4(5):1469-1480；Luddens等人(1995)Neuropharmacology，34(3):245-254)。在β细胞中，GABAA-R氯通道的活化导致去极化、电压依赖性钙通道的打开、以及Ca2+-依赖性Pi3K/Akt细胞生长和存活信号传导通路的活化(Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697；Purwana等人(2014)Diabetes，；63(12):4197-4205；Braun等人(2010)Diabetes，59(7):1694-2701)。
苯并二氮杂。
苯并二氮杂不结合到GABA结合位点，而是结合到GABAA-R上的其他地方(图中的“BZD”位点)。虽然它们不能打开氯化物通道，但是当GABA结合到受体时，它们充当增加氯电导的阳性变构调节剂。与具有很少或没有能力穿过血脑屏障的GABA不同，苯并二氮杂可穿过血脑屏障并且增强由CNS神经元产生的GABA的作用。不同的苯并二氮杂优先地结合到具有不同亚单元组成的不同GABAA-R(亚类型)。
具有不同GABAA-R亚类型特异性的苯并二氮杂已用于改善癫痫、失眠或焦虑。在此实施例中，研究苯并二氮杂阿普唑仑阿普唑仑被广泛地开处方以用于治疗焦虑和惊恐症.在1981年引入之后，阿普唑仑快速成为热门药物，开处方次数超过50百万次。当如所指导的使用时，它对于长期使用是安全的(参见www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2011/018276s045lbl.pdf处的FDA批准的标签以及(Jonas和Cohon(1993)J.Clin.Psychiatry.54增刊:25-45；讨论6-8))。选择研究阿普唑仑是基于1)其长期安全性特征，2)适当的GABAA-R亚单元在人类胰岛中表达(Braun等人(2010)Diabetes，59(7):1694-2701)以及3)阿普唑仑降低具有较差葡萄糖控制的个体中的HbA1C水平的能力(Lustman等人(1995)Diabetes Care，18(8):1133-1139，参见以下)。
阿普唑仑减少具有较差葡萄糖控制的患者中的HbA1c。
假设结合到由人类β细胞表达的特定GABAA-R亚类型的苯并二氮杂可增强在胰岛内局部地释放的GABA的作用。在临床研究中，阿普唑仑施用到患有T1D或T2D的具有较差葡萄糖控制(约12的HbA1c平均值)的焦虑和非焦虑个体。进行8周处理之后，HbA1c水平在接受阿普唑仑的患者中显著降低，但是在接受安慰剂的患者中没有显著降低(Lustman等人(1995)Diabetes Care，18(8):1133-1139)。此作用在焦虑和非焦虑患者两者中是相似的，从而指示HbA1c的减少不取决于焦虑的改善。
阿普唑仑促进体外人类胰岛细胞增殖。
在实验性研究中，测试单独的阿普唑仑和与低水平的GABA组合的阿普唑仑是否可增强体外人类胰岛细胞复制。测试单独的阿普唑仑是因为虽然苯并二氮杂本身不能打开GABAA-R氯化物通道，但是β细胞表达GAD并且分泌GABA。因此，假设阿普唑仑可增强内源性产生的胰岛GABA的作用。
阿普唑仑在递送0.5-6.0mg/天的延长释放片剂中开处方，并且其浓度范围通常在治疗学上在接受药物的人类的血清中是10-100ng/ml(Jones等人(2007)Therap.DrugMonitor.29(2):248-360；Fraser和Bryan(1991)J.Analyt.Toxicol.，15(2):63-65)。将人类胰岛与或不与30ng/ml阿普唑仑一起培养。发现与没有阿普唑仑的培养物相比，阿普唑仑使人类胰岛细胞增殖促进约123％(图2)。因为没有向这些培养物添加GABA，所以可能阿普唑仑与从β细胞分泌的GABA一起作用来促进胰岛细胞增殖。在这种情况下，从50个培养的胰岛/孔分泌的GABA可能非常快地扩散开并且限制阿普唑仑的有效性，并且此想法由GABA添加到培养基的研究的结果支持(参见以下)。
在新诊断患有T1D的患者中，β细胞质量极大地减小，使得胰岛内分泌的GABA的水平应该是低的。假定，剩余的GABA分泌与阿普唑仑一起可增强GABA对于残余β细胞复制和存活的作用，并且可解释阿普唑仑如何降低患有T1D和T2D的患者中的HbA1C水平。值得注意的是，显示GABA单一疗法可增强新患糖尿病的NOD小鼠中的β细胞复制和存活(Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697；Tian等人(2014)Diabetes.63(9):3128-3134)。
此研究中测试的假设是残余β细胞分泌GABA的能力是亚最佳的，并且外源性GABA处理对于促进新患糖尿病小鼠中的β细胞复制和存活是有益的。此外，还测试使用GABA和阿普唑仑进行的组合治疗是否具有促进β细胞复制和存活的增强的能力和/或是否可减少实现这些作用所需要的药物的量。
阿普唑仑和GABA协同作用来在减小剂量下促进体外人类胰岛细胞复制。
接下来将具有或没有阿普唑仑(30ng/ml)的包含一定剂量范围的GABA的人类胰岛培养物中的人类胰岛细胞增殖进行比较。虽然使用0.03mM GABA进行的处理没有显著增强人类胰岛细胞增殖处理，但是相同剂量的GABA与阿普唑仑一起使人类胰岛细胞增殖增强138％(图3)。为了实现相似水平的增殖，使用单独的GABA需要10倍高水平的GABA(0.3mM)。因此，阿普唑仑极大地减少诱导相当稳健的β细胞增殖所需要的GABA的量。这些数据证明GABA和阿普唑仑的组合对于体外人类胰岛细胞增殖具有协同正作用。
组合的阿普唑仑GABA协同作用来抑制β细胞自身免疫性。
将GABA与阿普唑仑一起施用的另一个优点是协同抑制自身反应性T细胞并促进Treg的潜力。血液中的GABA的水平非常低(CNS外存在非常少的GAD来产生GABA，并且GABA在循环中具有非常短的半衰期)。在没有GABA的情况下，单独的阿普唑仑对于免疫细胞不应具有很大作用，但是组合起来它们可协同作用来抑制炎症并促进Treg，可能使用减少剂量的每种药物。虽然阿普唑仑+GABA对于免疫应答的作用的研究引起极大兴趣，但是它们在此研究范围以外，此研究关注于人类β细胞复制。阿普唑仑用于增强人类中β细胞复制和存活的可转化性。阿普唑仑不导致免疫抑制或增加人类对于感染的易感性(参见在http://labeling.pfizer.com/ShowLabeling.aspx？id＝547处的阿普唑仑资料单)，这与在没有GABA的情况下阿普唑仑不能活化人类免疫细胞上的GABA-R的想法一致。阿普唑仑的主要副作用是困倦。
在长期阿普唑仑使用之后，通常发生停药和反弹症状并且需要逐渐减少剂量(Verster和Volkerts(2004)CNS Drug Rev.，10(1):45-76)。在啮齿动物研究中，阿普唑仑抑制受激大鼠的脊髓中的EAE和炎症(Nunez-Iglesias等人(2010)Pharmacol.Biochem.,Behav.97(2):350-356)，这是有趣的，因为阿普唑仑可增强神经元产生的GABA对于浸润性免疫细胞的作用。在这种情况下，它可具有对于胰岛-浸润性免疫细胞的相似的有益作用。影响免疫系统的阿普唑仑的仅其他报告是1)一个组报告阿普唑仑抑制小鼠淋巴细胞的增殖性应答并且减少由T细胞进行的IL-2产生和巨噬细胞进行的TNF产生(Chang等人(1991)Int.J.Pharmacol.，13(2-3):259-266；Chang等人(1992)Int.J.Pharmacol.，14(2):227-337)，和2)与此不同，另一个组报告阿普唑仑增强促分裂素诱导的淋巴细胞增殖和NK细胞活性(Fride等人(1990)Life Sci.，47(26):2409-2420)。
阿普唑仑不应与对于免疫系统和CNS具有不利副作用的其他苯并二氮杂(诸如地西泮(安定)和劳拉西泮)混淆。并不知道阿普唑仑显著结合到先前已知为“外周苯并二氮杂受体”的蛋白质的任何报告，所述蛋白质现在已知为外线粒体膜上的移位蛋白(TSPO)(Papadopoulos等人(2006)Trend.Pharmacol.Sci.27(8):402-409)，并且是地西泮的第二结合位点。
如上指出的，阿普唑仑显著减少具有较差葡萄糖控制的患者中的HbA1c(Lustman等人(1995)Diabetes Care，18(8):1133-1139)。实验性研究显示适度水平的阿普唑仑(单独的)对于体外人类胰岛细胞增殖具有相当稳健的作用(图2)。阿普唑仑和GABA的组合对于人类胰岛细胞增殖具有协同作用，使得需要十倍高水平的GABA(单独的)来实现相似的增殖作用(图3)。这表明与GABA组合，较低水平的阿普唑仑可促进β细胞复制和存活。因为阿普唑仑不需要通过血脑屏障，所以比针对抗焦虑(抗焦虑(anti-anxiety))作用所使用的剂量低的剂量的阿普唑仑可有效于调控外周中的β细胞GABAA-R。另外，在CNS中，GABAA-R在神经元突触上簇集在一起，而额外的突触GABA-R具有扩散分布(Craig等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(26):12373-12377)。据信，因为对于GABA的亲和力降低，簇集的GABAA-R与扩散的额外的突触GABA-R相比对于GABA具有3-4倍高的EC50并且失活更快(Chen等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(21):11557-11562)。认为簇集的GABA-R之间的蛋白质-蛋白质相互作用影响结合位点或通道活化(Chen等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(21):11557-11562)。不受特定理论的限制，认为可能的是，β细胞上的GABAA-R是扩散的并且对于GABA和变构调控是更敏感的。
应强调，如果针对β细胞的自身免疫应答不能被显著削减，则促进β细胞再生和健康可能几乎没有用。就此而言，由于其同时抑制自身反应性T细胞并促进Treg的能力，认为所提出的阿普唑仑+GABA组合疗法能力突出。值得注意的是，阿普唑仑的抗焦虑剂量能够降低糖尿病患者中的HbA1c(Lustman等人(1995)Diabetes Care，18(8):1133-1139)。主张即使需要阿普唑仑的抗焦虑剂量来促进β细胞存活和复制，短期阿普唑仑处理的益处也超过副作用(主要是困倦)。例如，在胰岛移植的情况下，阿普唑仑处理将限于胰岛植入之后的较短时间段，以便减少由于低氧和压力造成的β细胞损失。在新发作T1D的情况下，阿普唑仑处理可与GABA和例如抗CD3组合短期给予--这可协同抑制自身免疫并诱导Treg，从而使C肽水平比在使用单独的抗CD3进行的处理之后保持更长的时间段。
实施例2
测试咪达唑仑和氯硝西泮对于体外INS-1细胞增殖的作用
此实验的目的是测试以下化合物对于体外INS-1细胞增殖的作用：
咪达唑仑(MW 325)：在6.25mM下可溶于液体中；以及
氯硝西泮(MW315)：在50mM下溶解在乙醇中。
方法：
1.3H-胸腺嘧啶并入测定：将INS-1细胞在1x105个/孔下一式三份使用指示浓度的个体化合物进行处理，并且在0.3μCi/孔的3H-胸腺嘧啶的存在下在10％FCS RPMI164培养基中培养48小时(最佳时间段)。收获细胞并且通过β计数器测量单个孔中的3H-胸腺嘧啶吸收的水平。
2.MTT测定：将INS-1细胞在1x105个/孔下一式四份使用指示的化合物在10％FCSRPMI164培养基(不含苯酚)中处理44小时。将细胞暴露于20ml的MTT(20mg/ml)4小时，并且去除培养细胞的上清液。将所得的产物溶解在100ml DMSO中并且在微板读取器中在540/650nm的吸光度下进行测量。
结果:
1.使用咪达唑仑进行的处理具有增强体外INS-1细胞的增殖的一定能力，但是使用氯硝西泮进行的处理不具有此能力。发现使用在10-4-10-9M下的氯硝西泮进行的处理没有显著改变INS-1细胞的增殖。使用在10-5M下的咪达唑仑进行的处理对于INS-1细胞具有轻微的毒性，并且使用10-7-10-8M进行的处理显著增强体外INS-1细胞增殖(图4A，p<0.05)。基于这些结果，接下来测试较小剂量范围内的在另外中间剂量情况下的这些药物，并且观察到在10-7-3x10-8M下的咪达唑仑显著增强体外INS细胞的增殖(图4B)。通过MTT测定观察到相似的细胞增殖模式(数据未示出)。
2.使用咪达唑仑或氯硝西泮进行的处理增强体外GABA刺激的INS-1细胞增殖。接下来，测试咪达唑仑和氯硝西泮对于体外GABA诱导的INS-1细胞增殖的作用。发现使用在1-0.1mM下的GABA进行的处理刺激体外INS-1细胞增殖。使用在10-7M或3x10-8M下的咪达唑仑进行的处理增强GABA诱导的INS-1细胞增殖。虽然使用在0.03-0.01mM下的GABA进行的处理没能诱导INS-1细胞增殖，但是使用在此类低剂量下的GABA和在10-7M或3x10-8M下的咪达唑仑两者进行的处理显著增强INS-1细胞增殖。使用低剂量的GABA和咪达唑仑两者处理的细胞中的INS-1细胞增殖的程度高于使用单独的咪达唑仑处理的细胞中的INS-1细胞增殖的程度，从而指示咪达唑仑强化GABA诱导的细胞增殖。相似地，使用在10-7M或3x10-8M下的咪达唑仑进行的处理显著增强体外GABA刺激的INS-1细胞增殖。通过MTT测定检测到这些药物对于GABA诱导的细胞增殖的相似的药理学作用模式。
咪达唑仑或氯硝西泮的增强作用不由可结合一些苯并二氮杂的移位蛋白(18kDa)(TSPO)介导。
为了测试咪达唑仑和氯硝西泮的作用是否部分地通过TSPO介导，测试TSPO抑制剂PK11195对于咪达唑仑或氯硝西泮增强的GABA诱导的INS-1细胞增殖的影响。发现使用指示的GABA或咪达唑仑进行的处理诱导INS-1细胞增殖，但是使用氯硝西泮或PK11195进行的处理不诱导INS-1细胞增殖。使用GABA和咪达唑仑或者GABA和氯硝西泮两者进行的处理均增强细胞增殖，这不被PK11195影响。这些数据指示由咪达唑仑或氯硝西泮进行的INS-1细胞的增强增殖不通过活化INS-1细胞中的TSPO来介导。
实施例3
测试AP325和AP3对于体外INS-1细胞增殖的作用
此实验的目的是测试以下化合物对于体外INS-1细胞增殖的作用：
AP325(MW 310)：在50mM下可溶于DMSO中；以及
AP3(MW 276.33)：在50mM下溶解在DMSO中。
方法：
1.3H-胸腺嘧啶并入测定：将INS-1细胞在1x105个/孔下一式三份使用指示浓度的个体化合物进行处理，并且在0.3μCi/孔的3H-胸腺嘧啶的存在下在10％FCS RPMI164培养基中培养48小时(最佳时间段)。收获细胞并且通过β计数器测量单个孔中的3H-胸腺嘧啶吸收的水平。
2.MTT测定：将INS-1细胞在1x105个/孔下一式四份使用指示的化合物在10％FCSRPMI164培养基(不含苯酚)中处理44小时。将细胞暴露于20ml的MTT(20mg/ml)4小时，并且去除培养细胞的上清液。将所得的产物溶解在100ml DMSO中并且在微板读取器中在540/650nm的吸光度下进行测量。
结果:
使用AP325或AP3(单独的)进行的处理不刺激体外INS-1细胞的增殖。
发现使用在10-4-10-5M下的AP325或AP3进行的处理显著抑制体外INS-1细胞增殖(图6)。虽然使用在10-6-10-10下的任一化合物进行的处理并不抑制INS-1细胞的增殖，但是所述处理不显著增加INS-1细胞的增殖。值得注意的时，使用在10-7-10-8下的AP325进行的处理稍微增加INS-1细胞的增殖，但是使用在10-7-10-8下的AP3进行的处理没有稍微增加INS-1细胞的增殖(但是这是非显著的)。通过MTT测定检测到相似的细胞存活模式(数据未示出)。因此，在高剂量下的两种化合物均具有针对INS-1细胞的毒性，并且在10-6-10-10下的这些化合物没有显示对体外INS细胞增殖的任何刺激。
使用AP325进行的处理增强体外GABA刺激的INS-1细胞增殖。
接下来，测试AP325或AP3对于体外GABA诱导的INS-1细胞增殖的作用。发现使用在1-0.1mM下的GABA进行的处理刺激体外INS-1细胞增殖，但是使用在0.03或0.01mM下的GABA进行的处理没有显著刺激体外INS-1细胞增殖(图7)。使用在10-6M下的AP325进行的处理没有显著改变INS-1细胞的增殖(数据未示出)。然而，使用在10-7–10-8M下的AP325进行的处理显著增强GABA诱导的INS-1细胞增殖，特别是使用在3x10-7-3x10-8M下的AP325进行的处理。值得注意的是，虽然使用在0.03mM或0.01mM下的单独的GABA进行的处理在实验条件下没能刺激INS-1细胞增殖，但是使用在3x10-7-10-8M下的AP325与0.03mM GABA一起进行的处理显著促进INS-1细胞增殖。此外，使用在10-7下的AP325与0.01mM GABA一起进行的处理也显著刺激体外INS-1细胞增殖。从MTT测定获得相似的数据模式(数据未示出)。因此，这些数据指示AP325增强体外GABA刺激的INS-1细胞增殖。
使用AP3进行的处理增强体外GABA刺激的INS-1细胞增殖。
AP3的分析揭示使用在10-6M下的AP3进行的处理没有显著改变INS-1细胞的增殖(数据未示出)。然而，使用在3x 10-7–3x10-8M下的AP3进行的处理显著增强0.1mM GABA诱导的INS-1细胞增殖(图8)。值得注意的是，使用在3x10-7-10-8M下的AP3与0.03mM GABA一起进行的处理显著促进INS-1细胞增殖。此外，使用在10-7-10-8下的AP3与0.01mM GABA一起进行的处理也显著刺激体外INS-1细胞增殖。从MTT测定获得相似的数据模式(数据未示出)。因此，这些数据指示AP3增强体外GABA刺激的INS-1细胞增殖。
结论：
AP325和AP3可增强体外GABA诱导的INS-1细胞增殖。
实施例4
临床上可应用的GABA受体阳性变构调节剂可促进β细胞复制
1型糖尿病(T1D)研究的关键目标是开发安全促进人类β细胞复制的治疗。最近认识到，β细胞上的γ-氨基丁酸受体(GABA-R)的活化可促进其存活和复制。增强GABA对于神经元GABAA-R的作用的多种阳性变构调节剂(PAM)正在临床使用中。由于其增强从β细胞分泌的或外源性地施用的GABA促进β细胞复制和存活的能力的安全性和潜力，再利用这些GABAA-R PAM来帮助治疗糖尿病是理论上吸引人的。在此，显示临床上可应用的GABAA-R PAM可增强INS-1β细胞复制，并且这通过外源性GABA施加来扩大。此外，GABAA-R PAM促进体外人类胰岛细胞复制。此作用通过GABAA-R拮抗剂来消除，从而表明从β细胞释放的GABA可具有可由PAM增强的自分泌促有丝分裂作用。PAM和低水平的外源性GABA的组合具有促进人类β细胞复制的增加的能力。这些研究识别用于T1D治疗的潜在新种类的药物，并且可解释GABAA-R PAM减少糖尿病患者中的HbA1c的过去的观察。
引言
T1D研究的目标是寻找可安全促进β细胞复制的方式。然而，很少发现可增强人类β细胞复制的药剂。很早已知啮齿动物和人类β细胞表达GABA-R，GABAA-R和GABAB-R两者(Braun等人(GABA)(2010)Diabetes，59:1694-1701)，但是最近才显示其活化可促进β细胞存活、复制和质量(Ligon等人(2007)Diabetologia，50:764-773；Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697；Tian等人(2013)Diabetes，62:3760-3765；Prud'homme等人(2103)Transplantation，96(7):616-623；Purwana等人(2014)Diabetes，63(12):4197-4205)。GABAA-R PAM增强GABA的作用。它们不结合到GABA结合位点，而是结合到GABAA-R上的其他地方，并且虽然它们不能打开GABAA-R氯化物通道，但是当GABA结合到受体时，它们增加Cl-电导。因为GABA具有很少至没有能力穿过血脑屏障(BBB)，所以开发BBB可透过的GABAA-R PAM(诸如苯并二氮杂)来增强由CNS神经元分泌的GABA的作用，以便治疗CNS病状诸如癫痫、失眠和焦虑。理论上，可再利用这些PAM来增强在胰岛内释放的GABA的作用以促进β细胞有丝分裂。
在此，测试临床上可应用的GABAA-R PAM促进β细胞复制的能力。具体地，测试阿普唑仑、咪达唑仑和氯硝西泮(其代表不同种类的苯并二氮杂)促进β细胞系INS-1的复制的能力。阿普唑仑已广泛用于治疗焦虑，并且每年开将近50百万的处方以用于此药物处理。当如所指导的使用时，它对于长期使用是安全的(Jonas等人(1993)J.Clin.Psychiatry，54增刊:25-45；讨论46-28)和http://www.fda.gov/safety/medwatch/safetyinformation/ucm271398.htm)。另外，测试新开发的非苯并二氮杂GABAA-R PAM，AP3，它在外周被限制。然后检验在具有或没有外源性GABA的情况下阿普唑仑对于体外人类胰岛细胞复制的作用。
研究设计和方法
阿普唑仑、咪达唑仑、氯硝西泮、PK11195、以及荷包牡丹碱购自Sigma-Aldrich，并且AP3由Algiax Pharmaceuticals股份有限公司提供。将阿普唑仑(在DMSO中10mM)、咪达唑仑(在水中6.25mM)、氯硝西泮(在ETOH中50mM)、或AP3(在DMSO中50mM)的储备溶液稀释到培养基中至指示的浓度。
增殖测定。
将INS-1细胞在1x105个/孔下一式三份使用指示浓度的个体化合物进行处理，并且在3H-胸腺嘧啶(0.3μCi/孔)的存在下在10％FCS RPMI164培养基中培养48小时(最佳时间段)。通过闪烁计数器测量单个孔中的3H-胸腺嘧啶吸收的水平。
从Integrated Islet Distribution Program获得新鲜人类胰岛，并且将胰岛(50-75IEQ/孔)在3H-胸腺嘧啶(0.2μCi/孔)的存在下使用指示剂量的GABA连同或不连同指示的PAM进行处理4天。
结果
INS-1细胞表达苯并二氮杂结合GABAA-R亚单元。
GABA可增强INS-1细胞增殖(Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697)，但是INS-1细胞是否表达对于苯并二氮杂敏感的GABAA-亚单元是未知的。使用qRT-PCR针对赋予对于苯并二氮杂的敏感性的GABAA-R亚单元(α1、α2、α3、和α5)的表达测试INS-1细胞RNA。检测到α1、α3和α5转录物以及β1、γ1、γ2、γ3亚单元(数据未示出)，从而指示INS-1细胞可表达对于苯并二氮杂敏感的GABAA-R。
INS-1细胞具有合成GABA的相对低的能力。
β细胞表达GAD并且分泌可以自分泌方式起作用的GABA。INS-1细胞是否也合成GABA是未知的。因此测试INS-1细胞中的GAD酶活性。发现INS-1细胞中的GAD活性远小于人类胰岛中的GAD活性，人类胰岛中的GAD活性进而小于小鼠脑中的GAD活性(图9，图片A)。然而，INS-1细胞中的GAD活性始终是阴性对照293T细胞中的GAD活性的约2倍大，从而表明它们能够产生可以自分泌方式起作用的低水平的GABA。
GABAA-R PAM促进体外INS-1增殖。
测试不同浓度的每种PAM对于体外INS-1细胞的增殖的影响。使用在10nM和/或100nM下的阿普唑仑或咪达唑仑进行的处理显著刺激INS-1细胞的增殖，但是使用氯硝西泮或AP3进行的处理没有显著刺激INS-1细胞的增殖(图9，图片B)。此外，使用在0.03-0.3mM下的GABA(单独的)进行的处理刺激INS-1细胞增殖(图9，图片C-图片G)，与先前的观察相似(Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697)。虽然使用0.01mM GABA进行的处理没有刺激INS-1增殖(图9，图片C-图片G)，但是在30nM或100nM阿普唑仑的存在下相同剂量的GABA显著增加INS-1细胞增殖，这显著高于单独的阿普唑仑或甚至10倍高浓度的单独的GABA(0.1mM，图9，图片C)的情况下的INS-1细胞增殖。然而，在高浓度的GABA(0.1mM或0.3mM)下，阿普唑仑增强GABA的促有丝分裂作用的能力较小，这可能是因为高浓度的GABA已诱导最大的GABAA-R应答。相似地，低剂量的咪达唑仑、氯硝西泮或AP3增强GABA刺激的INS-1细胞增殖(图9，图片D-图片G)。因此，GABAA-R PAM可强化GABA诱导的β细胞增殖。
一些苯并二氮杂结合到线粒体移位蛋白(TSPO)，其先前称为“外周苯并二氮杂受体”。阿普唑仑不结合到TSPO(Schmoutz等人(2014)Behav.Brain.Res.271:269-276)。为了测试咪达唑仑和氯硝西泮是否可通过TSPO增强INS-1细胞增殖，将INS-1细胞与TSPO抑制剂PK11195一起培养并且在咪达唑仑或氯硝西泮的存在下使用0.3mM GABA进行刺激。使用PK1119进行的处理不影响GABA和测试的苯并二氮杂增强INS-1细胞增殖的能力(图9，图片H)，从而指示此作用不通过TSPO介导。
阿普唑仑增强胰岛产生的GABA促进人类胰岛细胞复制的能力。
接下来测试PAM是否可增强人类胰岛细胞复制。关注于测试阿普唑仑，这是因为其安全性记录并且发现阿普唑仑治疗减少糖尿病患者中的HbA1c(Lustman等人(1995)Diabetes Care18:1133-1139)。将培养的人类胰岛与一定剂量范围的阿普唑仑一起培养，并且观察到低浓度的阿普唑仑促进人类胰岛细胞增殖(图10)。绝大多数复制的胰岛细胞可能是β细胞，因为免疫组织学研究显示GABA增加人类β细胞复制，但是对于α-细胞复制没有作用(Purwana等人(2014)Diabetes，63(12):4197-4205)和未公布的观察)，并且其他胰岛细胞类型不表达GABA-R。向这些培养物添加Ca2+通道阻断剂硝苯地平(1uM)阻断阿普唑仑的促有丝分裂作用(数据未示出)，这与此PAM增强PI3K/Akt通路的GABAA-R诱导的活化的想法一致(Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697)。
因为阿普唑仑不能够独立于GABA而显著活化GABAA-R，所以可能阿普唑仑与从胰岛β细胞分泌的GABA结合作用来使β细胞复制增加超过其基准水平。将阿普唑仑与竞争性地抑制GABA结合到GABAA-R的GABAA-R拮抗剂荷包牡丹碱一起添加到人类胰岛培养物(Johnston(2013)Br.J.Pharmacol.169:328-336)。观察到荷包牡丹碱施加消除阿普唑仑促进胰岛细胞增殖的能力(图11)。这表明胰岛产生的GABA可以自分泌方式促进β细胞复制，并且增强GABAA-R活性可使β细胞复制提高到更高的水平。
阿普唑仑和GABA的组合具有在低剂量下促进体外人类胰岛细胞复制的增强的能 力。
接下来测试阿普唑仑是否可强化外源性GABA促进体外人类胰岛细胞复制的能力。将人类胰岛在100nM阿普唑仑的存在或不存在下使用或不使用不同浓度的GABA进行处理。发现在0.3-3mM下的GABA(单独的)以剂量依赖性方式显著增强人类胰岛细胞增殖，但是在低剂量下的GABA(单独的)没有显著增强人类胰岛细胞增殖(图12)。使用阿普唑仑和GABA进行的共处理相对于对应的GABA(单独的)剂量显著增加人类胰岛细胞增殖(图12)。值得注意的是，虽然使用0.03mM GABA进行的处理没有显著增强人类胰岛细胞增殖处理，但是相同剂量的GABA与阿普唑仑一起显著增强人类胰岛细胞增殖(图12)。为了实现相似水平的增殖，使用单独的GABA需要10倍高水平的GABA(0.3mM)。因此，阿普唑仑极大地减少诱导β细胞增殖所需要的GABA的量。
讨论
GABA-R活化可防止β细胞的细胞凋亡并且促进其复制(Ligon等人(2007)Diabetologia，50:764-773；Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697；Tian等人(2013)Diabetes，62:3760-3765；Prud'homme等人(2103)Transplantation，96(7):616-623；Purwana等人(2014)Diabetes，63(12):4197-4205)。口服GABA处理使人类β细胞复制增加若干倍，通常从胰岛异种植入物中的成年人类β细胞的小于1％增加至约2％-3％(Tian等人(2013)Diabetes，62:3760-3765；Purwana等人(2014)Diabetes，63(12):4197-4205)，这与在出生之后立即发生的β细胞复制的最大水平相似。此增强在进行五周GABA处理之后不减弱，并且导致人类胰岛异种植入物中β细胞质量和功能增加(Purwana等人(2014)Diabetes，63(12):4197-4205)。因此，再利用临床上可应用的PAM来增强在胰岛内产生的GABA的活性或外源性GABA的作用是用于帮助治疗T1D的有吸引力的策略。
首先测试三种临床上可应用的BBB可透过的苯并二氮杂PAM以及在外周被限制的非苯并二氮杂PAM是否可促进INS-1细胞增殖。发现INS-1细胞表达应赋予苯并二氮杂敏感性的GABAA-R亚单元并且这些细胞可产生低水平的GABA。观察到四种测试的PAM中的两种在所测试的剂量中的至少一个下具有促进INS-1复制的显著的但是低的能力。当GABA被外源性地提供到培养基时，所有测试的PAM增大低水平的GABA诱导INS-1细胞增殖的能力。实际上，在纳米水平的每种PAM的存在下，具有很少或没有能力来促进INS-1细胞复制的低水平的外源性GABA诱导INS-1细胞复制的能力增大。
在INS-1细胞上测试的四种PAM中，因为阿普唑仑的安全性特征和阿普唑仑治疗减少糖尿病患者中的HbA1c水平的先前观察，将阿普唑仑用于研究其对于人类胰岛细胞复制的作用((Lustman等人(1995)Diabetes Care18:1133-1139)，参见以下)。观察到阿普唑仑(单独的)增强体外人类胰岛细胞复制，这最可能是因为其与从β细胞分泌的GABA结合起作用。实际上，阻断GABA与拮抗剂荷包牡丹碱的结合消除阿普唑仑增强胰岛细胞复制的能力。这表明从β细胞释放的GABA可具有对于β细胞的促有丝分裂活性，并且此活性可通过PAM增强。向这些培养物添加硝苯地平阻断阿普唑仑的促有丝分裂作用，从而表明其增强PI3K/Akt通路的GABAA-R介导的活化(Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697)。
组合起来的阿普唑仑和外源性GABA具有促进人类β细胞复制的更大的能力，并且实现与在十倍高水平下的GABA所实现的β细胞复制水平相似的β细胞复制水平。在测定中经历复制的绝大多数胰岛细胞可能是β细胞，因为免疫组织学分析显示GABA增加人类β细胞复制，但是对于α-细胞复制没有作用(Purwana等人(2014)Diabetes，63(12):4197-4205)和未公布的观察)，并且已知胰岛δ细胞和PP细胞不表达GABA-R。
在20世纪90年代早期实施的临床试验使用阿普唑仑治疗患有较差控制的糖尿病的焦虑和非焦虑个体来确定减少焦虑的临床试验是否可帮助焦虑患者更好地管理其糖尿病。意料之外的发现是阿普唑仑处理降低HbA1c水平，但是安慰剂不降低HbA1c水平，无论患者是否患有焦虑症(Lustman等人(1995)Diabetes Care18:1133-1139)。认为这些结果源自于阿普唑仑使神经递质和神经激素释放减弱。鉴于这些发现，可能的是，阿普唑仑对于HbA1C的有益作用可至少部分地由于增强胰岛GABA促进β细胞存活和复制的能力而产生。
预想通过其这些发现可导致临床益处的若干不同路径。第一，可能使用在低于针对CNS适应症所使用的剂量的剂量下的BBB可透过的PAM来改善糖尿病患者中的β细胞质量和功能。第二，因为T1D发作之后β细胞质量的量是决定干预性疗法的成功的主要因素，所以短期PAM处理可帮助保持残余的β细胞质量并且因此改善干预性疗法的结果。沿此思路，GABA处理增强新患糖尿病的NOD小鼠中的β细胞复制和存活(Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697；Tian等人(2014)Diabetes，63:3128-3134)，从而指示增强GABA-R活性在β细胞自身反应性的存在下可以是有益的，甚至当保持很少β细胞质量时也是如此。第三，短期PAM处理可帮助减少在胰岛移植之后由于低氧和压力造成的β细胞损失，如通过GABA处理改善人类胰岛异种移植物中的β细胞存活的能力所表明的(Tian等人(2013)Diabetes，62:3760-3765；Purwana等人(2014)Diabetes，63(12):4197-4205)。最后，免疫细胞也表达GABA-R并且其活化可抑制促炎免疫应答，使得GABA处理改善T1D、实验性自身免疫性脑脊髓炎、类风湿关节炎以及T2D的小鼠模型中的疾病(Soltani等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108:11692-11697；Prud'homme等人(2103)Transplantation，96(7):616-623；Tian等人(2014)Diabetes，63:3128-3134；Mendu等人(2011)Mol.Immunol.48:399-407；Bhat等人(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，107:2580-2585；Huang等人(2015)J.Cell Physiol.230:1438-1447；Duthey等人(2010)Exp.Dermatol.19:661-666；Tian等人(2011)PLoS One，6(9):e25338；Tian等人(2014)J.Immunol.173:5298-5304；Tian等人(2011)Autoimmunity，44:465-470)。因此，使用与低剂量GABA组合的在外周限制的GABAA-R PAM或亚临床剂量的BBB可透过的PAM可避免CNS作用并且促进β细胞质量/功能，并且帮助控制自身反应性T细胞应答。
应了解，本文所述的实施例和实施方案仅用于例示性目的，并且建议本领域的技术人员根据其进行各种修改或变化，并且它们将包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有公布、专利和专利申请出于所有目的据此以引用的方式整体并入本文。

Claims (104)

1.一种促进哺乳动物中β细胞的复制、生长、和/或存活和/或功能的方法，所述方法包括将GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)以足以促进所述哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或增加所述哺乳动物中β细胞的质量和/或功能的量施用到所述哺乳动物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)与GABA受体活化配体结合施用。
3.如权利要求2所述的方法，其中当与所述PAM结合使用时，所述GABA受体活化配体比当任一药剂单独施用时更有效于促进所述哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能。
4.如权利要求3所述的方法，其中当与PAM结合使用时，所述GABA受体活化配体比当任一药剂单独施用时至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少1.2倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少10倍更有效于促进所述哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述GABA受体活化配体在比当单独使用时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所使用的剂量低的剂量下使用，并且/或者所述阳性变构调节剂在比当所述PAM单独使用时实现所述PAM被设计和/或批准的活性所使用的剂量低的剂量下使用。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述GABA受体活化配体在当所述GABA受体活化配体单独使用时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所使用的剂量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下使用。
7.如权利要求5-6中任一项所述的方法，其中所述阳性变构调节剂在当所述PAM单独使用时实现所述PAM被设计和/或批准的活性所使用的剂量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下使用。
8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体在比当单独使用时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所使用的剂量低的剂量下使用，并且/或者所述阳性变构调节剂在亚治疗剂量下使用。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述施用促进β细胞的复制。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述施用增加β细胞的质量。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述施用促进β细胞的存活。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述施用促进β细胞的功能。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述施用增加胰岛素含量和/或由β细胞分泌的胰岛素的量。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述施用通过增加胰岛素阳性β细胞的数量来促进功能。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述哺乳动物是诊断患有I型糖尿病的人类。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述哺乳动物诊断为前驱糖尿病的。
18.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是非人类哺乳动物。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM协同作用来改善所述β细胞的复制和/或存活和/或生长和/或功能。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述PAM包括选自由AP325和AP3组成的组的药剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述PAM包括AP325。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述AP325在比针对神经性疼痛或脊髓损伤所使用的剂量低的剂量下施用。
23.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述PAM包括选自由巴比妥酸盐、苯并二氮杂、喹唑啉酮、以及神经类固醇组成的组的药剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述PAM包括巴比妥酸盐。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的巴比妥酸盐：阿洛巴比妥(5,5-二烯丙基巴比妥酸盐)、异戊巴比妥(5-乙基-5-异戊基-巴比妥酸盐)、阿普比妥(5-烯丙基-5-异丙基-巴比妥酸盐)、烯丙苯巴比妥(5-烯丙基-5-苯基-巴比妥酸盐)、巴比妥(5,5-二乙基巴比妥酸盐)、溴烯比妥(5-烯丙基-5-(2-溴-烯丙基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-(1-甲基丁基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-苯基巴比妥酸盐)、司可巴比妥(5-[(2R)-戊-2-基]-5-丙-2-烯基-巴比妥酸盐)。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述PAM包括苯并二氮杂。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的苯并二氮杂：阿普唑仑、溴西泮、利眠宁、咪达唑仑、氯硝西泮、氯氮、地西泮、艾司唑仑、氟西泮、哈拉西泮、凯他唑仑、劳拉西泮、硝西泮、奥沙西泮、普拉西泮、夸西泮、替马西泮、以及三唑仑。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述PAM包括阿普唑仑。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述阿普唑仑在比治疗焦虑症、惊恐症和/或由抑郁导致的焦虑所使用的剂量小的剂量下施用。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述阿普唑仑如下施用：作为立即释放片剂口服小于1.5mg/天或口服小于1.0mg/天、或口服小于0.5mg/天，或者作为延长释放片剂口服小于0.5mg/天、或口服小于约0.4mg/天或口服小于约3mg/天。
31.如权利要求26所述的方法，其中所述PAM包括咪达唑仑。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述咪达唑仑在比减少焦虑、或在医疗程序或手术之前产生睡意或麻醉、或维持镇静或麻醉所使用的剂量小的剂量下施用。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述咪达唑仑在小于1mg的剂量下IV施用、或在小于约0.8mg的剂量下IV施用、或在小于约0.5mg的剂量下IV施用、或在小于约0.01mg/kg的剂量下IV施用、或在小于约0.07mg/kg的剂量下IM施用、或在小于约0.05mg/kg的剂量下IM施用、或在小于约0.03mg/kg的剂量下IM施用、或在小于约0.01mg/kg的剂量下施用。
34.如权利要求26所述的方法，其中所述PAM包括氯硝西泮。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述氯硝西泮在比治疗癫痫病症(包括失神癫痫或伦-加综合征)所使用的剂量小或比治疗成年人中的惊恐症(包括广场恐怖症)所使用的剂量小的剂量下施用。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述氯硝西泮在小于约0.5mg/天的剂量下口服施用、或在小于约0.25mg/天的剂量下口服施用、或在小于约0.01mg/kg/天的剂量下施用、或在小于约0.005mg/kg/天的剂量下施用。
37.如权利要求23所述的方法，其中所述PAM包括神经类固醇。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述PAM包括选自由别孕烷醇酮(3α-羟基-5α-孕烷-20-酮)和孕烷醇酮组成的组的神经类固醇。
39.如权利要求2-38中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体包括GABA。
40.如权利要求2-38中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体包括选自由以下组成的组的药剂：巴马鲁唑、gabamide、GABOB、加波沙朵、鹅膏蕈氨酸、异去甲槟榔次碱、异哌啶甲酸、蝇蕈醇、非尼布特、匹卡米隆、氟柳双胺、quisqualamine、氟柳双胺酸(SL75102)、硫代蝇蕈碱、普加巴林、氨己烯酸、6-氨基烟酸、高牛磺酸、以及XP13512[(±)-1-([(α-异丁酰氧基乙氧基)羰基]氨基甲基)-1-环己烷乙酸]。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述方法在胰岛移植之后增加β细胞存活。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述方法在胰岛移植之后增加胰岛中的β细胞复制。
43.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述方法在胰岛植入之后进行以便减少由于低氧和压力造成的β细胞损失。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述方法在植入后进行多至3天、或植入后进行多至1周、或植入后进行多至2周、或植入后进行多至3周、或植入后进行多至4周、或植入后进行多至5周、或植入后进行多至6周、或植入后进行多至7周、或植入后进行多至8周、或植入后进行多至3个月、或植入后进行多至4个月、或植入后进行多至5个月、或植入后进行多至6个月。
45.如权利要求2-44中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体不是醇。
46.如权利要求2-45中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体不是麻醉椒内酯。
47.如权利要求2-46中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体不是黄芩或黄芩成分。
48.如权利要求2-47中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体不是缬草或缬草成分。
49.如权利要求2-48中任一项所述的方法，其中所述GABA受体活化配体不是挥发性气体。
50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物不针对选自由以下组成的组的一种或多种病状进行治疗：神经性疼痛、脊髓损伤、焦虑症、惊恐症、由抑郁导致的焦虑、癫痫病症(包括失神癫痫或伦-加综合征)、以及月经性癫痫。
51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中不施用所述PAM来在医疗程序或手术之前产生睡意或麻醉或维持镇静或麻醉。
52.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其中是BBB可透过的所述PAM在低于针对CNS适应症所使用的剂量的剂量下施用。
53.一种药学制剂，其包含GABA受体活化配体和GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)。
54.如权利要求53所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体比在包含单独的GABA受体活化配体的治疗制剂中在更低的单位剂量下存在，并且/或者所述PAM比在包含单独的所述PAM的治疗制剂中处于更低的单位剂量下。
55.如权利要求54所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体比在包含单独的GABA或GABA类似物的治疗制剂中在更低的单位剂量下存在。
56.如权利要求55所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体在当所述GABA受体活化配体单独存在时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所提供的剂量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下存在。
57.如权利要求53-56中任一项所述的制剂，其中所述PAM比在包含单独的所述PAM的治疗制剂中处于更低的单位剂量下。
58.如权利要求57所述的制剂，其中所述阳性变构调节剂在当所述PAM单独使用时实现所述PAM被设计和/或批准的活性所存在的量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下存在。
59.如权利要求53-58中任一项所述的制剂，其中所述GABA或GABA类似物和所述PAM以足以提供刺激表达GABAA受体的细胞的复制的协同活性的浓度存在。
60.如权利要求53-58中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM以足以提供刺激β细胞的复制和/或促进β细胞的存活和/或改善β细胞的功能的协同活性的浓度存在。
61.如权利要求53-60中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM以足以提供比当任一药剂单独施用时促进哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能的功效大至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少1.2倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少10倍的浓度存在。
62.如权利要求53-61中任一项所述的制剂，其中所述PAM包括选自由巴比妥酸盐、苯并二氮杂、喹唑啉酮、以及神经类固醇组成的组的药剂。
63.如权利要求62所述的制剂，其中所述PAM包括巴比妥酸盐。
64.如权利要求63所述的制剂，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的巴比妥酸盐：阿洛巴比妥(5,5-二烯丙基巴比妥酸盐)、异戊巴比妥(5-乙基-5-异戊基-巴比妥酸盐)、阿普比妥(5-烯丙基-5-异丙基-巴比妥酸盐)、烯丙苯巴比妥(5-烯丙基-5-苯基-巴比妥酸盐)、巴比妥(5,5-二乙基巴比妥酸盐)、溴烯比妥(5-烯丙基-5-(2-溴-烯丙基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-(1-甲基丁基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-苯基巴比妥酸盐)、司可巴比妥(5-[(2R)-戊-2-基]-5-丙-2-烯基-巴比妥酸盐)。
65.如权利要求62所述的制剂，其中所述PAM包括苯并二氮杂。
66.如权利要求65所述的制剂，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的苯并二氮杂：阿普唑仑、溴西泮、利眠宁、咪达唑仑、氯硝西泮、氯氮、地西泮、艾司唑仑、氟西泮、哈拉西泮、凯他唑仑、劳拉西泮、硝西泮、奥沙西泮、普拉西泮、夸西泮、替马西泮、以及三唑仑。
67.如权利要求65所述的制剂，其中所述PAM包括阿普唑仑。
68.如权利要求65所述的制剂，其中所述PAM包括咪达唑仑。
69.如权利要求65所述的制剂，其中所述PAM包括氯硝西泮。
70.如权利要求62所述的制剂，其中所述PAM包括神经类固醇。
71.如权利要求70所述的制剂，其中所述PAM包括选自由别孕烷醇酮和孕烷醇酮组成的组的神经类固醇。
72.如权利要求53-71中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体包括GABA。
73.如权利要求53-71中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体包括选自由以下组成的组的药剂：巴马鲁唑、gabamide、GABOB、加波沙朵、鹅膏蕈氨酸、异去甲槟榔次碱、异哌啶甲酸、蝇蕈醇、非尼布特、匹卡米隆、氟柳双胺、quisqualamine、氟柳双胺酸(SL75102)、硫代蝇蕈碱、普加巴林、氨己烯酸、6-氨基烟酸、高牛磺酸、以及XP13512[(±)-1-([(α-异丁酰氧基乙氧基)羰基]氨基甲基)-1-环己烷乙酸]。
74.如权利要求53-73中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体不是醇。
75.如权利要求53-74中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体不是麻醉椒内酯。
76.如权利要求53-75中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体不是黄芩或黄芩成分。
77.如权利要求53-76中任一项所述的制剂，其中所述GABA受体活化配体不是缬草或缬草成分。
78.一种用于促进哺乳动物中表达GABAA受体的细胞的复制的试剂盒，所述试剂盒包括：
包含GABA受体活化配体的容器；以及
包含GABAA受体阳性变构调节剂(PAM)的容器。
79.如权利要求78所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM在同一容器中。
80.如权利要求78所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM在单独容器中。
81.如权利要求78-80中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体比在包含单独的GABA或GABA类似物的治疗制剂中在更低的单位剂量下存在，并且/或者所述PAM比在包含单独的所述PAM的治疗制剂中处于更低的单位剂量下。
82.如权利要求78-80中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体比在包含单独的GABA或GABA类似物的治疗制剂中在更低的单位剂量下存在。
83.如权利要求82所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体在当所述GABA受体活化配体单独存在时实现对于β细胞复制和/或存活和/或功能的相同作用所提供的剂量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下存在。
84.如权利要求78-83中任一项所述的试剂盒，其中所述PAM比在包含单独的所述PAM的治疗制剂中处于更低的单位剂量下。
85.如权利要求78-84中任一项所述的试剂盒，其中所述阳性变构调节剂在当所述PAM单独使用时实现所述PAM被设计和/或批准的活性所存在的量的小于约95％、或小于约90％、或小于约80％、或小于约70％、或小于约60％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％、或小于约20％、或小于约10％下存在。
86.如权利要求78-85中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM以足以提供刺激表达GABAA受体的细胞的复制的协同活性的浓度存在。
87.如权利要求78-85中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM以足以提供刺激β细胞的复制和/或促进β细胞的存活和/或改善β细胞的功能的协同活性的浓度存在。
88.如权利要求78-87中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体和所述PAM以足以提供比当任一药剂单独施用时促进哺乳动物中β细胞的复制和/或存活和/或功能的功效大至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少1.2倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少10倍的浓度存在。
89.如权利要求78-88中任一项所述的试剂盒，其中所述PAM包括选自由巴比妥酸盐、苯并二氮杂、喹唑啉酮、以及神经类固醇组成的组的药剂。
90.如权利要求89所述的试剂盒，其中所述PAM包括巴比妥酸盐。
91.如权利要求90所述的试剂盒，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的巴比妥酸盐：阿洛巴比妥(5,5-二烯丙基巴比妥酸盐)、异戊巴比妥(5-乙基-5-异戊基-巴比妥酸盐)、阿普比妥(5-烯丙基-5-异丙基-巴比妥酸盐)、烯丙苯巴比妥(5-烯丙基-5-苯基-巴比妥酸盐)、巴比妥(5,5-二乙基巴比妥酸盐)、溴烯比妥(5-烯丙基-5-(2-溴-烯丙基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-(1-甲基丁基)-巴比妥酸盐)、戊巴比妥(5-乙基-5-苯基巴比妥酸盐)、司可巴比妥(5-[(2R)-戊-2-基]-5-丙-2-烯基-巴比妥酸盐)。
92.如权利要求89所述的试剂盒，其中所述PAM包括苯并二氮杂。
93.如权利要求92所述的试剂盒，其中所述PAM包括选自由以下组成的组的苯并二氮杂：阿普唑仑、溴西泮、利眠宁、咪达唑仑、氯硝西泮、氯氮、地西泮、艾司唑仑、氟西泮、哈拉西泮、凯他唑仑、劳拉西泮、硝西泮、奥沙西泮、普拉西泮、夸西泮、替马西泮、以及三唑仑。
94.如权利要求92所述的试剂盒，其中所述PAM包括阿普唑仑。
95.如权利要求92所述的试剂盒，其中所述PAM包括氯硝西泮。
96.如权利要求92所述的试剂盒，其中所述PAM包括咪达唑仑。
97.如权利要求89所述的试剂盒，其中所述PAM包括神经类固醇。
98.如权利要求97所述的试剂盒，其中所述PAM包括选自由别孕烷醇酮和孕烷醇酮组成的组的神经类固醇。
99.如权利要求78-98中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体包括GABA。
100.如权利要求78-98中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体包括选自由以下组成的组的药剂：巴马鲁唑、gabamide、GABOB、加波沙朵、鹅膏蕈氨酸、异去甲槟榔次碱、异哌啶甲酸、蝇蕈醇、非尼布特、匹卡米隆、氟柳双胺、quisqualamine、氟柳双胺酸(SL75102)、硫代蝇蕈碱、普加巴林、氨己烯酸、6-氨基烟酸、高牛磺酸、以及XP13512[(±)-1-([(α-异丁酰氧基乙氧基)羰基]氨基甲基)-1-环己烷乙酸]。
101.如权利要求78-100中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体不是醇。
102.如权利要求78-101中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体不是麻醉椒内酯。
103.如权利要求78-102中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体不是黄芩或黄芩成分。
104.如权利要求78-103中任一项所述的试剂盒，其中所述GABA受体活化配体不是缬草或缬草成分。
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