CN108690817A - 一种多功能广谱性复合微生物菌剂及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多功能广谱性复合微生物菌剂，是由地衣芽孢杆菌（Bacillus LicheniformisTG119）和土曲霉（Aspergillus terreus）复配而成。经试验证明，本发明多功能广谱性复合微生物菌剂对番瓜绵疫菌、小麦赤霉菌、黄瓜枯萎菌、辣椒疫霉菌、辣椒炭疽菌、马铃薯立枯丝核菌及黄瓜灰霉菌等具有明显的拮抗作用，抑制率均高达70%以上，其中对小麦赤霉菌的抑制率最高，可达89%。该菌剂可以防治植物疫病、立枯病、灰霉病、炭疽病和赤霉病等植物病害，同时具有促进植物生长和兼顾土壤改良及地下线虫防治等功效，从而达到农作物增产增收的目的。

Description

一种多功能广谱性复合微生物菌剂及其制备和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种复合型微生物菌剂，尤其涉及一种由地衣芽孢杆菌（Bacillus LicheniformisTG119）和土曲霉（Aspergillus terreus）复配的复合型微生物菌剂，主要用于植物病虫害、土壤改良和线虫的防治。
背景技术
目前全世界作物损失的1/3由土壤病虫害引起，仅线虫病造成的危害损失每年就高达1250亿美元。土壤病虫害化学防治往往缺少有效的解决办法，成为世界各国农业生产最头疼的难题。长期以来，我国农田病虫害防治都是依靠各种化学农药，而化学农药也确实为我国农业发展做出了重大的贡献。但是化学农药带来的环境污染，化学残留，土质恶化等等副作用也是不容忽视的。为了解决化学农药的这些弊病，生物农药应运而生。微生物农药为无公害农药，对人畜无害，不污染环境，无残留，对病虫害杀伤的特异性强，且不伤害天敌及有益微生物，能保持生态平衡，可稳定殖于植物体或者根际土壤，作用持续时间长。另外，微生物农药生产原料和有效成分为天然产物，易降解，可回归大自然，有利于可持续性发展。
土壤是生态环境的重要组成部分，是农业生产的物质基础。近几十年来，随着工业的迅速发展，工业、农业生产以及生活垃圾中各种污染物直接或间接的排放，进入土壤并且超过土壤自净能力，造成土壤污染。土壤生物退化是土壤中动物、微生物、土壤酶活性等一系列土壤生物指标的退化。土壤生物退化会对土壤造成不利影响，引发土壤板结、养分平衡失调等问题。土壤污染程度日益严重，在众多土壤污染修复中，微生物修复是最具发展和应用前景的生物修复技术，具有经济和生态双重优势。
目前市场上的微生物农药存在诸多的不足，主要体现在以下几个方面：（1）防治谱窄，只能防治特定作物特定病虫害，广谱高效的微生物菌剂明显不足；（2）功能单一，目前市场上的微生物菌剂普遍存在防治功能单一，要么只具有抗菌性，要么具有杀虫性，集防病、杀虫和土壤改良的产品严重不足。利用对环境友好、生态和谐和有利食品安全等措施来防控农作物病虫害已经成为了世界农业发展的新趋势，是保障当前国内外普遍关心的粮食安全和环境安全的重要措施之一。开发符合当地环境条件下的微生物农药尤为重要，即促进了当地绿色农业的发展、又参与国际农产品市场竞争、同时保护了环境和保证人类健康。
发明内容
本发明的第一目的，是针对现有微生物菌剂抗菌谱窄的缺陷，提供一种多功能广谱性复合微生物菌剂；
本发明的第二目的，是提供一种制备上述功能广谱性复合微生物菌剂的方法；
本发明的第三目的，是提供上述功能广谱性复合微生物菌剂的具体生物活性和用途。
本发明的多功能广谱性复合微生物菌剂，是由地衣芽孢杆菌和土曲霉复配而成。其中，地衣芽孢杆菌菌株的拉丁文名称为B. Licheniformis，标记为TG119，该菌株已于2014年4月14日保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 9048。地衣芽孢杆菌（B. Licheniformis）具有广谱性杀菌活性和促生能力，不易产生抗药性，安全性高，制备环保性好。
土曲霉的的拉丁文名称为Aspergillus terreus，是一种曲霉属微生物。曲霉是一类耐高温及高渗透压、遗传性状稳定的真菌微生物。有关曲霉属微生物资源在植物保护方面的应用已进行大量研究，如在农药残留和污染土壤、水源或实验室驯化下分离筛选得到的15种曲霉，被证明对特定农药残留具有较强的生物降解能力；有6种曲霉及其次级代谢产物具有一定的农药活性，对农作物具有一定的保护作用。土曲霉通过常规市场购买所得。
本发明采用地衣芽孢杆菌（Bacillus LicheniformisTG119）和土曲霉（Aspergillus terreus）进行复配，使二者的活性产生协同，进一步促进了植物生长、改良土壤、防治病害和地下线虫侵害的功效，为农林产品提供绿色无公害的生防产品。
本发明多功能广谱性复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）地衣芽孢杆菌菌粉的制备：将地衣芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行液态种子培养及液态发酵培养，得到活菌数大于1.5×109CFU/mL的地衣芽孢杆菌发酵液，低温负压干燥，得到地衣芽孢杆菌菌粉。
上述牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成：蛋白胨：5~15g/L，牛肉膏：3~5g/L，NaCl：5~10 g/L，pH：7.0~8.0。优选：蛋白胨：10 g/L，牛肉浸膏：3 g/L，NaCl：5g/L，pH：7.0。
上述地衣芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行液态种子培养及液体发酵培养的条件为：接种量为5~15%，发酵温度为25~37℃，发酵时间16~24h，转速170~220r/min，发酵液pH值控制在7.0~8.0。优选培养条件为：接种量为10%，发酵温度为30℃，发酵时间20h；转速180r/min，pH值7.0。
低温负压干燥条件：温度-20~-10℃，压力＜10 Pa。
（2）土曲霉菌粉制备：将土曲霉接种于液体PDA培养基进行种子液培养，制得土曲霉种子液；再将所得土曲霉种子液接种于大豆粉液体发酵培养基中进行发酵培养，得到土曲霉活菌数大于1.0×109CFU/mL的发酵液，低温负压干燥，得到土曲霉菌粉。
上述液体PDA培养基的组成为：马铃薯150~220g/L，煮沸取汁；葡萄糖15~25g/L，自然pH值；优选：马铃薯200g/L，煮沸取汁，葡萄糖20 g/L，自然pH值。
上述土曲霉种子液的培养条件：接种量5~15%，培养温度25~30℃，培养时间：24~36h；优选条件：接种量10%，培养温度28℃，培养时间24h。
上述大豆粉液体发酵培养基的组成为：大豆粉50~100g/L，蔗糖50~100g/L，自然pH值；优选：大豆粉85 g/L，蔗糖85 g/L，自然pH值。
上述土曲霉在大豆粉液体培养基中液体发酵条件为：接种量1~10%，发酵温度20~30℃，发酵时间120~240 h，通气量500~1000 L/h，每天搅拌2~3次，每次间隔8~16h；自然pH值。优选发酵条件：接种量10%、通气量800 L/h，发酵温度28℃，发酵时间168 h。
低温负压干燥条件：温度-20~-10℃，压力＜10 Pa。
（3）将上述所得地衣芽孢杆菌菌粉和土曲霉孢子粉按1:0.5~1:5的质量比混合均匀，即得多功能复合微生物菌剂。
本发明的复合微生物菌剂的具体组成及使用方法可根据作物的品种、生长情况、土壤情况、病害类型及病情指数等，做适当的调整。
本发明多功能广谱性复合微生物菌剂的使用方法：叶面喷施、灌根和拌种，可以与有机肥复配追肥等。
本发明多功能广谱性复合微生物菌剂可根据不同的用途制备成不同剂型：如可湿性粉剂、水分散粒剂及悬浮剂。
经试验验证，本发明多功能广谱性复合微生物菌剂对番瓜免疫菌、小麦赤霉菌、黄瓜枯萎菌、辣椒疫霉菌、辣椒炭疽菌、马铃薯立枯丝核菌及黄瓜灰霉菌等具有很好的抑制作用。可以防治植物疫病、立枯病、灰霉病、炭疽病和赤霉病等植物病害，同时兼顾土壤改良和地下线虫防治等功效，促进植物生长、改良土壤、防治病害和地下线虫侵害，以达到增产增收。具体试验数据见表1：
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明多功能广谱性复合微生物菌剂的制备、性能及使用做进一步说明。
实施例1、可湿性粉剂的制备
（1）地衣芽孢杆菌菌粉的制备：将地衣芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行液态种子培养及液态发酵培养，得到活菌数大于1.5×109CFU/mL的地衣芽孢杆菌发酵液，低温负压干燥（-20~-10℃，压力＜10 Pa），得到地衣芽孢杆菌菌粉。
其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成：蛋白胨：10 g/L，牛肉浸膏：3 g/L，NaCl：5g/L，pH：7.0。
液态发酵培养条件为：接种量为10%，发酵温度为30℃，发酵时间20h；转速170r/min，pH值7.0。
（2）土曲霉菌粉制备：将土曲霉接种于液体PDA培养基进行种子液培养，制得土曲霉种子液；再将所得土曲霉种子液接种于大豆粉液体发酵培养基中进行发酵培养，得到土曲霉活菌数大于1.0×109CFU/mL的发酵液，低温负压干燥（-20~-10℃，压力＜10 Pa），得到土曲霉菌粉。
其中，液体PDA培养基的组成为：马铃薯200g/L，煮沸取汁，葡萄糖20 g/L，自然pH值。土曲霉种子液的培养条件为：接种量5%，培养温度25℃，培养时间36 h。
大豆粉液体发酵培养基的组成为：大豆粉85 g/L，蔗糖85 g/L，自然pH值。液体发酵条件为：接种量5%、通气量500 L/h，发酵温度28℃，发酵时间：180 h。每天搅拌2~3次，每次5~10分钟。
（3）将上述所得地衣芽孢杆菌菌粉和土曲霉孢子粉按1:0.5的质量比混合均匀，即得多功能复合微生物菌剂。
以微生物粉剂为原药，选择合适的载体、分散剂和润湿剂等助剂，制成可湿性粉剂，通过叶面喷施，主要用于植物病害的防治。
实施例2、水分散粒剂的制备
（1）地衣芽孢杆菌菌粉的制备：将地衣芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行液态种子培养及液态发酵培养，得到活菌数大于1.5×109CFU/mL的地衣芽孢杆菌发酵液，低温负压干燥（-20~-10℃，压力＜10 Pa），得到地衣芽孢杆菌菌粉。
其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成：蛋白胨：5g/L，牛肉膏：5g/L，NaCl：10 g/L，pH：7.0。
上述液体发酵培养条件为：接种量为15%，发酵温度为25℃，发酵时间24h，转速220r/min，发酵液pH值控制在7.0~8.0。
（2）土曲霉菌粉制备：将土曲霉接种于液体PDA培养基进行种子液培养，制得土曲霉种子液；再将所得土曲霉种子液接种于大豆粉液体发酵培养基中进行发酵培养，得到土曲霉活菌数大于1.0×109CFU/mL的发酵液，低温负压干燥（-20~-10℃，压力＜10 Pa），得到土曲霉菌粉。
其中，液体PDA培养基的组成为：马铃薯200g/L，煮沸取汁；葡萄糖20 g/L，自然pH值。土曲霉种子液的培养条件：接种量10%，培养温度30℃，培养时间：20 h。
大豆粉液体发酵培养基的组成为：大豆粉50g/L，蔗糖100g/L，自然pH值。液体发酵条件为：接种量1%、发酵温度30℃，通气量800 L/h，发酵时间：120 h。每天搅拌2~3次，每次5~10分钟。
（3）将上述所得地衣芽孢杆菌菌粉和土曲霉孢子粉按1:1的质量比混合均匀，即得多功能复合微生物菌剂。
以微生物粉剂为原药，选择合适的水乳分散剂、崩解剂、填料等助剂，制成水分散粒剂，通过灌根和拌种，主要用于植物土传病害的防治和地下线虫的防控。
实施例3、悬浮剂的制备
（1）地衣芽孢杆菌菌粉的制备：将地衣芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行液态种子培养及液态发酵培养，得到活菌数大于1.5×109CFU/mL的地衣芽孢杆菌发酵液，低温负压干燥（-20~-10℃，压力＜10 Pa），得到地衣芽孢杆菌菌粉。
其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成：蛋白胨： 15g/L，牛肉膏：3g/L，NaCl：8 g/L，pH：7.0。液体发酵培养条件为：接种量为5%，发酵温度为37℃，发酵时间24h，转速170r/min，发酵液pH值控制在7.0。
（2）土曲霉菌粉制备：将土曲霉接种于液体PDA培养基进行种子液培养，制得土曲霉种子液；再将所得土曲霉种子液接种于大豆粉液体发酵培养基中进行发酵培养，得到土曲霉活菌数大于1.0×109CFU/mL的发酵液，低温负压干燥（-20~-10℃，压力＜10 Pa），得到土曲霉菌粉。
其中，液体PDA培养基的组成为：马铃薯200g/L，煮沸取汁；葡萄糖20 g/L，自然pH值。土曲霉种子液的培养条件：接种量10%，培养温度28℃，培养时间：24h。
大豆粉液体发酵培养基的组成为：大豆粉100g/L，蔗糖50g/L，自然pH值。液体发酵条件为：接种量10%、发酵温度28℃，通气量800 L/h，发酵时间：168 h。每天搅拌2~3次，每次5~10分钟。
（3）将上述所得地衣芽孢杆菌菌粉和土曲霉孢子粉按1:5的质量比混合均匀，即得多功能复合微生物菌剂。
以微生物粉剂为原药，选择合适的润湿分散剂、增稠剂、防腐剂等助剂，制成悬浮剂，通过灌根，主要用于植物土传病害的防治、地下线虫的防治和土壤改良。

Claims (10)

1.一种多功能广谱性复合微生物菌剂，是由地衣芽孢杆菌和土曲霉按配制而成。
2.如权利要求1所述多功能广谱性复合微生物菌剂，其特征在于：剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂。
3.如权利要求1所述多功能广谱性复合微生物菌剂，其特征在于：用于抑制植物或土壤中的番瓜免疫菌、小麦赤霉菌、黄瓜枯萎菌、辣椒疫霉菌、辣椒炭疽菌、马铃薯立枯丝核菌、黄瓜灰霉菌。
4.如权利要求1所述多功能广谱性复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）地衣芽孢杆菌菌粉的制备：将地衣芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行液态种子培养及液态发酵培养，得到活菌数大于1.5×109CFU/mL的地衣芽孢杆菌发酵液，低温负压干燥，得到地衣芽孢杆菌菌粉；
（2）土曲霉菌粉制备：将土曲霉接种于液体PDA培养基进行种子液培养，制得土曲霉种子液；再将所得土曲霉种子液接种于大豆粉液体发酵培养基中进行发酵培养，得到土曲霉活菌数大于1.0×109CFU/mL的发酵液，低温负压干燥，得到土曲霉菌粉；
（3）将上述所得地衣芽孢杆菌菌粉和土曲霉孢子粉按1:0.5~1:1的质量比混合，即得多功能复合微生物菌剂。
5.如权利要求1所述多功能广谱性复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成：蛋白胨：5~15g/L，牛肉膏：3~5g/L，NaCl：5~10 g/L，pH：7.0~8.0。
6.如权利要求1所述多功能广谱性复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述地衣芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨液体培养基中的培养条件为：接种量为5~15%，发酵温度为25~37℃，发酵时间16~24h，转速170~220r/min，发酵液pH值控制在7.0~8.0。
7.如权利要求1所述多功能广谱性复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述液体PDA培养基的组成：马铃薯150~220g/L，煮沸取汁；葡萄糖15~25g/L，自然pH值。
8.如权利要求1所述多功能广谱性复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述土曲霉种子液的培养条件：接种量为5~15%，培养温度25~30℃，培养时间：24~36h。
9.如权利要求1所述多功能广谱性复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述大豆粉液体发酵培养基的组成为：大豆粉50~100g/L，蔗糖50~100g/L，自然pH值。
10.如权利要求1所述多功能广谱性复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述土曲霉在大豆粉液体培养基中液体发酵条件为：接种量1~10%，发酵温度20~30℃，发酵时间120~240 h，通气量500~1000 L/h，每天搅拌2~3次，每次5~10分钟。
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