CN108685935A - 一种含有腺苷受体激动试剂的食品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及氮6‑（2‑羟乙基）腺苷[N(6)‑(2‑hydroxyethyl)‑adenosine，HEA]及其衍生物作为腺苷A₁受体激动剂在食品制备中的用途：HEA及其衍生物用于治疗与腺苷受体调质剂有关的神经系统疾病，如镇静催眠、抗惊厥、脑保护、帕金森氏病、药物成瘾等。本发明为预防神经系统疾病提供了一种功能食品。

Description

一种含有腺苷受体激动试剂的食品

本发明申请是发明专利申请，申请号：2015102267454的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种新的腺苷A1受体激动剂，特别的，涉及氮6-(2-羟乙基)腺苷[N(6)-(2-hydroxyethyl)-adenosine，HEA]及其衍生物作为腺苷A1受体激动剂；和其作为腺苷A1受体激动剂在药物制备或食品制备中可用于治疗与腺苷受体调质剂有关的神经系统疾病的新用途。

背景技术

蝉花虫草为多座线虫草[Ophiocordyceps sobolifera(Hill ex Watson)G.H.Sung,J.M.Sung,

Hywel-Jones&Spatafora，]寄生山蝉(Cicada flammatus Distant)、竹蝉(Platylomia pieli koto)若虫而形成的虫体内充满菌丝头部长出多根子实体的虫草。传统中医记载其具有镇静催眠、抗惊痫、瘈疭、夜啼等功效，但是并无证据表明是那种具体的物质在起作用，作用的机理如何。(裘洁宋捷民蝉花的药理作用研究进展中国民族民间医药2009,9：4-6；雷帮星不同培养条件对粉被虫草产N6-(2-羟乙基)腺苷的影响菌物学报15January 2014,33(1):103‐113)。

众多的研究结果提示腺苷受体与神经元兴奋、运动能力调节等生理效应密切相关。对治疗精神分裂症、抑郁、癫痫和焦虑的有效药物的作用机制有影响(Franklin PH,Zhang G,Trpp ED,Murray TF,1989.Adenosine A₁receptor activation mediatessuppression of(-)-bicuculline methiodide-induced seizures in rat prepiriformcortex.The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics.251(3):1229-1236；Lai DM,Tu YK,Liu IM,Cheng JT 2005，Increase of adenosine A₁receptor geneexpression in cerebral ischemia of Wistar rats Neuroscience Letters387:59–6；Dunwiddie TV,Worth T,1982.Sedative and anticonvulsant effects of adenosineanalogs in mouse and rat.The Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics.,220(1):70-76；Ismayilova N,Crossman A,Verkhratsky A,et al.Effects of adenosine A₁,dopamine D1and metabotropic glutamate 5receptors-modulating agents on locomotion of the reserpinised rats[J].Eur J Pharmacol,2004,497(2):187-195.)。

腺苷受体作为一种兴奋性神经递质，分布于全身各部位，由A₁、A_2A、A_2B、A₃，4种亚型组成，且4种亚型都是G蛋白偶联受体。其中A₁受体对腺苷的敏感性最高，作用最为广泛。A_2A受体为机体重要的免疫分子，与炎症反应密切相关。A₁、A_2a受体普遍参与了腺苷对睡眠、情绪等诸多生理和病理过程的调节。由于缺少A_2B的特异性配体，目前对A2b的研究不是很深入，但zhou和zhong等人提及在某些病理状态下腺苷高度聚集可激活A2B,并发现A2BR可以增加星形胶质细胞释放IL-6，预示着A2b可能参与炎症过程。A3受体在脑内的水平和其对腺苷亲和力的水平都远低于A1和A2A受体，其生理作用目前还不是十分清楚(王任烨潘建春腺苷及其受体在神经系统中的生物学作用国外医学药学分册2006年8月第33卷第4期；ZhouAM,Li WB,Li QJ,et al.A short cerebral ischemic preconditioning up-regulatesadenosine receptors in the hippocampal CA1regionof rat s[J].Neurosci Res,2004,48(4):397-404.Zhong H,Belardinelli L,Maa T,et al.Synergy between A2Badenosine receptors and hypoxia in activating human lung fibroblast s[J].AmJRespir Cell Mol Biol,2005,32(1):2-8.)。

大量研究表明选择性A₁腺苷受体激动剂作为内源性神经保护物质具有多种神经保护功能：如Taiwo等的研究证明外周感觉末梢上的A₁受体被激活后，可抑制腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，AC)，使胞内第二信使环磷酸腺苷(cAMP)浓度下降，进而产生镇痛作用；Kaster等发现腺苷的抗抑郁样作用似乎是通过A1受体和A2A受体的激活实现的；MillanMJ的实验表明，致焦虑和抗焦虑作用分别与A1受体的阻断和激动有关,A1R基因缺失的小鼠有更多焦虑表现(Taiwo YO，Levine JD.Further confirmation of the role of adenylcyclase and of cAMP－dependent protein kinase in primary afferenthyperalgesia[J].Neuroscience，1991，44(1):131～135；Kaster MP,Rosa AO,Rosso MM,et al.Adenosine administration produces an antidepressant like effect inmice:evidence for the involvement of A1and A2A receptors[J].Neurosci Lett,2004,355(1):21-24.；Millan MJ.The neurobiology and control of anxious states[J].Prog Neurobiol,2003,70(2):83-244；)。

腺苷A1受体为含有326个氨基酸的糖蛋白，分子量为36 600。激活A1受体可以发挥保护神经元的作用。目前认为其可能的机制为：一方面，A1受体能抑制兴奋性神经递质如谷氨酸的释放，通过降低细胞的兴奋性来保护细胞。另一方面，激活突触后膜上的A1受体能使细胞内钾外流增加，因兴奋性降低从而保护神经元。(宗楷淇腺苷A1受体的作用研究进展中国药理学通报2008 24(5):573～6)

早年Jacobson KA等人报道腺苷因其代谢不稳定性妨碍其在临床药物上的使用。此后，相继合成了一些较为稳定的类似物，这些化合物主要是针对腺苷N⁶-、2-和5’位的修饰。据文献记载，N⁶-取代的腺苷类似物被证实具有A₁受体选择性，如CPA和CHA具有400～800的A₁选择性。CCPA为1500倍，S-ENBA的A₁选择性则更强，达4700倍。而5’-取代腺苷类似物NECA已被广泛用于解释由A₂受体激活所引起的生物效应。其他核糖的结构修饰作用中，2’-位的取代作用可完全失去亲和性，3’-位未取代的羟基是高效所必须的。(kennethA.Jacobson腺普受体的药理及构效关系药学进展1992 16卷第4期)

现在已有的A₁激动剂大多为N⁶取代的腺苷衍生物，包括CCPA、CHA、CPA等，他们对A₁都具有较强的选择性。

发明内容

本发明惊讶的发现，氮6-(2-羟乙基)腺苷以及衍生物是一种新的腺苷受体激动试剂。他们对A₁都具有较强的选择性。这种通过特异结合A1受体并产生一系列的生理生化活动，从而调节神经方面的功能。

一方面，本发明涉及一种新的腺苷受体的激动试剂，该试剂包括氮6-(2-羟乙基)腺苷以及衍生物。

在一些具体的实施方式中，所述的腺苷受体为A₁、A_2A、A_2B、A₃中的一种或几种。

在一些优选的实施方式中，腺苷受体为A₁受体。

在一些具体的实施方式中，氮6-(2-羟乙基)腺苷以及衍生物是一种新的特异结合A1受体的激动试剂。

在一些方式中，所述的氮6-(2-羟乙基)腺苷[N(6)-(2-hydroxyethyl)-adenosine，HEA]如下结构

在另一些具体实施方式中，所述的HEA的衍生物为如下通式(1)

其中，R1为支链或直链的烷基或羟基。在一些优选的方式中，R1为C(CH3)2CH2OH、CH(CH3)CH2OH或C(CH3)3。

另一方面，本发明提供一种氮6-(2-羟乙基)腺苷以及衍生物在用于制备治疗或者预防惊厥、中风、帕金森或阿片类药物成瘾试剂中的用途。

发明的又一目的在于提供一种预防和治疗惊厥、脑中风、帕金森、药物成瘾等神经系统疾病中的药物试剂，其中该试剂包括HEA及其衍生物。

发明的另一目的就提供一种预防和治疗惊厥、脑中风、帕金森、药物成瘾等神经系统疾病中的食品，其中该食品包括HEA及其衍生物。

另一方面，本发明提供一种氮6-(2-羟乙基)腺苷以及衍生物在用于制备改善睡眠障碍或提高睡眠质量的试剂中的用途。

一方面，本发明提供一种用于提高睡眠、预防惊厥、镇静的药物试剂，其中该试剂包括HEA及其衍生物。

优选的，根据所述的用途或试剂，所述的试剂是作为药物试剂、食品试剂。

优选的，根据所述的用途或试剂，氮6-(2-羟乙基)腺苷的其衍生物包括如下结构通式：

其中，R1为支链或直链的烷基。

优选的，R1为C(CH3)2CH2OH、CH(CH3)CH2OH或C(CH3)3。

优选的，根据所述的用途或试剂，起到改善睡眠障碍或提高睡眠质量是因为氮6-(2-羟乙基)腺苷以及其衍生物作为腺苷受体激动剂而实现的。优选的，腺苷受体为A₁、A_2A、A_2B、A₃中的一种或几种。优选的，腺苷受体为A₁受体。

优选的，在上述的试剂或用途，所述的氮6-(2-羟乙基)腺苷来自动植物、微生物、微生物培养物的提取物。优选的，所述的氮6-(2-羟乙基)腺苷来自自蝉花虫草、蛹虫草、冬虫夏草及其人工培养物的提取物。

优选的，在上述的试剂或用途，所述的试剂为食品。优选的，所述的试剂为食品包括保健食品。

在一些具体的实施方式中，这种新的用途、试剂、食品或保健食品是通过该氮6-(2-羟乙基)腺苷以及衍生物作用腺苷受体来实现的。在一些具体的实施方式中，所述的腺苷受体为A₁、A_2A、A_2B、A₃中的一种或几种。在一些优选的实施方式中，腺苷受体为A₁受体。在一些具体的实施方式中，氮6-(2-羟乙基)腺苷以及衍生物是一种新的特异结合A1受体的激动试剂，在一些方式中，所述的氮6-(2-羟乙基)腺苷[N(6)-(2-hydroxyethyl)-adenosine，HEA]如下结构

在另一些具体实施方式中，所述的HEA的衍生物为如下通式(1)

其中，R1为支链或直链的烷基或羟基。在一些优选的方式中，R1为C(CH3)2CH2OH、CH(CH3)CH2OH或C(CH3)3。

蝉花虫草具有与冬虫夏草相似的功能，可以作为其替代品，具有多重神经系统调节作用，但蝉花虫草镇静、催眠、抗惊厥等神经保护的化学本质及作用机理未见报道。

在另一些优选的方式中，氮6-(2-羟乙基)腺苷来自动植物或微生物或微生物的提取，或微生物培养物的提取物。优选的，氮6-(2-羟乙基)腺苷从蝉花虫草、蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link]、冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora]及其人工培养物中都可以分离获得活。

本研究基于动物实验发现HEA及其衍生物具有预防和治疗神经系统疾病的作用。进一步的研究发现，HEA的神经保护作用可被A₁受体拮抗剂减弱，提示HEA及其衍生物可作为一种新型的A₁腺苷受体激动剂用于治疗镇静、催眠、抗惊厥、中风、帕金森和对抗成瘾等多种神经系统疾病。

本专利所述的HEA同样为N⁶取代的腺苷衍生物，是在腺苷的腺嘌呤基团的氨基上连接有一个“2－羟乙基”基团，保留9位的β-D-呋喃核糖对保持生物活性至关重要，N6取代基中,OH基替换为NH₂，COOH则失去活性,可能酸、碱取代基对活性不利,N6取代基为链状烷烃可以提高镇静催眠活性,且随着碳链增长活性亦增强,这可能与取代基的疏水性提高有关。

在本发明中我们探究了HEA与A1和A2a受体亲和力的关系以及开展动物实验，我们发现HEA具有与腺苷A1受体结合的高亲能性并且可以充当腺苷A1受体的激动剂，发挥其合理的医药用途。

另一方面，本发明提取了蝉花虫草中的有效活性成分HEA，通过联合腺苷受体亲和力实验，首次证明HEA为一种新的选择性腺苷A₁受体激动剂。临床上可用的安全的选择性腺苷A₁受体激动剂有限，因此蝉花虫草可因其含有这一活性成分而具有极高的药用食用价值。本发明有望开发成为预防神经系统疾病的潜力药物，并可制成相关功能食品、保健品发挥对疾病有益的用途。

HEA的来源可以为自然提取或人工合成。

自然提取

本发明采用化学方法从蝉花虫草中提取分离一种天然活性化合物HEA，经过药理试验发现HEA作为一种腺苷类A₁受体激动剂可以在制备和预防惊厥等神经系统药物中得到应用。

本发明采用人工培养的蝉花虫草为原料，制备过程如下：蝉花虫草子实体50％乙醇回流提取物经膜分离、大孔树脂和Sephadex LH20柱分离纯化，得到单一活性成分HEA。

HEA结构式如下：

它的分子式为：C₁₂H₁₇N₅O₅分子量为：311.297化学名称为：N(6)-(2-hydroxyethyl)-adenosineHEA的提取纯化方法参考专利。

人工合成

本发明的HEA或衍生物也可以人工合成。

定义：

惊厥，是由于多种原因所致的脑神经功能紊乱，表现为突然的全身或局部肌群呈强直性和阵挛性抽搐，常伴有意识障碍。若不及时就医采取止痉措施，可危及生命。且惊厥易反复发作，其抽搐行为可在短时间内缓解，但病理生化变化却长期进行性发展。目前，多药联合治疗惊厥十分普遍，但是大部分会引起毒副作用和不良反应。

脑缺血(脑梗塞)是一种很常见的中枢神经损，具有严重的致残率和较高的致死率。据中华医学会调查：目前脑中风已成为我国城市和农村人口的第一位致残和死亡原因。脑缺血性卒中的诊治领域低估、误判现象严重；住院率仅约为6％，远低于发达国家30％左右的比例，而且尚无真正确切有效的药物能让脑梗死患者受益。

帕金森病(PD)又名震颤麻痹，是最常见的神经退行性疾病之一。流行病学显示，患病率为15～328/10万人口，>65岁人群约1％；发病率为10～21/10万人口/年。本病的最大危害在于患者生活质量严重下降，生活不能自理，并常出现多种并发症，如睡眠障碍等。

睡眠障碍系指睡眠-觉醒过程中表现出来的各种功能障碍。据不完全统计，我国各类睡眠障碍者占人群的38％，高于世界27％的比例。长期睡眠不足的危害除了会影响精神状态之外，还会降低人体的免疫力，因而会导致种种疾病发生。研究表明，睡眠障碍与糖尿病、脑卒中、癫痫、痴呆、儿童智力发育、肾功能损伤、性功能障碍等多种疾病相关联。

阿片类药物包括天然的阿片生物碱如吗啡，或人工合成的镇痛药如哌替啶，他们的成瘾是由于有些慢性疼痛患者，连续反复使用吗啡后，其效力会逐渐减弱，形成耐受性，表现为吗啡使用量逐渐增大和用药时间间隔缩短。患者会发生病态性嗜好而产生依赖性，包括精神依赖性和身体依赖性。一旦停药可在6～10小时后产生戒断症状，出现烦躁不安、失眠、疼痛、流涕、流泪、出汗、震颤、呕吐、腹泻、虚脱，甚至危及生命。此类病人都有强烈渴求用药的欲望，可不择手段去获取药品，不仅严重损害用药者的健康，还可造成严重的社会问题。

“食品”在这里的意思是指任何可以供人类或哺乳动物食用的物质。这种食品也包括任何保健食品，功能食品，或者一般通常理解的食品，存在的形式可以是以饮料、片剂、溶液等形式存在。这些食品可以是固体、半固体、流体形式存在。

“药物试剂”是本领域通常意义上的试剂，可以为片剂，溶剂、半固体溶液或注射液体等等。这里所指的药物试剂可以是具有治疗疾病的药物形式，也可以是起到保健药物的作用而存在。

有益效果

本发明提供一种新的腺苷受体的激动试剂，特别的，提供一种新的A1腺苷受体的激动试剂。该新的试剂为治疗或预防该类疾病提供了新的途径。

附图说明：

图1.1[³H]-DPCPX与大鼠皮质膜受体结合的饱和曲线(图1.1A)和Scatchard(图1.1B)作图,其中，B.放射性核素结合蛋白；F.游离蛋白(Kd＝0.12nmol/L，Bmax＝2140fmol/mg蛋白)。

图1.2[³H]-MSX-2与大鼠皮质膜受体结合的饱(图1.2A)和曲线和Scatchard((图1.2B))作图,注:B.放射性核素结合蛋白；F.游离蛋白(Kd＝10.90nmol/L，Bmax＝5235fmol/mgprotein)。

图2.1 HEA(15mg/kg、40mg/kg、60mg/kg，ip)对戊四唑致惊厥发生率的影响，结果显示HEA(40mg/kg，ip)能显著延长生存时间，体现出抗惊厥的作用(n＝8；*P<0.05，**P<0.01与对照组比)。

图2.2腺苷A₁受体选择性拮抗剂对HEA抗惊厥作用的影响，DPCPX能使HEA的抗惊厥效果明显回落(n＝8；a P<0.05，b P<0.01与对照组比，A P<0.05，B P<0.01与给药组比)。

图2.3腺苷A_2A受体选择性拮抗剂对HEA抗惊厥作用的影响，Zm241385对HEA的抗惊厥作用没有明显影响(n＝8；a P<0.05，b P<0.01与对照组比，A P<0.05，B P<0.01与给药组比)。

图3.1 HEA(5mg/kg、7.5mg/kg、12mg/kg，ip)对dMCAO皮层的大鼠神经功能状态评分，结果显示与模型组相比，HEA可使脑损伤的神经功能得到明显改善。(n＝8；*P<0.05，**P<0.01与对模型组比)。

图3.2 HEA(5mg/kg、7.5mg/kg、12mg/kg，ip)对dMCAO皮层的TTC染色测量梗死面积，结果显示与模型组相比，HEA(7.5mg/kg，ip)可使脑损伤的梗死面积得到明显减小。(n＝8；*P<0.05，**P<0.01与模型组比)。

图3.3 HEA(7.5mg/kg，ip)组对dMCAO皮层的脑缺血的保护作用和DPCPX(1mg/kg，ip)阻断HAE脑保护作用的大鼠大脑组织形态学染色HE(400X)，结果显示与模型组相比，HEA组可使细胞肿胀程度和细胞核改变均有所改善，细胞数增多。

图3.4 HEA(7.5mg/kg，ip)组对dMCAO皮层的脑缺血的保护作用和DPCPX(1mg/kg，ip)阻断HAE脑保护作用的tunel检测大鼠大脑皮层细胞凋亡情况(400X)，结果显示与模型组相比，HEA组可使用大鼠大脑皮质梗死半暗带区细胞凋亡率明显降低。

图4.1.HEA(5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg，ip)对MPTP引起小鼠运动功能障碍的影响。(n＝8；*P<0.05，**P<0.01与对照组比；#P<0.05，##P<0.01与模型组比)

图4.2 HEA(5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg，ip)对MPTP引起的多巴胺能神经元减少的影响。(n＝8；*P<0.05，**P<0.01与对照组比；#P<0.05，##P<0.01与模型组比)

图5.1 HEA联合腺苷受体对小鼠自主活动的影响，结果显示HEA(15mg/kg)可显著降低正常小鼠5min内自主活动次数，在DPCPX(4mg/kg)的作用下，HEA的镇静作用受到明显的拮抗(n＝8；*P<0.05，**P<0.01与溶剂组比；#P<0.05，##P<0.01与给药组比)。

图6.1 HEA(25mg/kg，sc)单独作用时对小鼠阈剂量戊巴比妥钠所致的睡眠时间有一定程度的延长,对睡眠潜伏期没有明显影响,联合腺苷受体拮抗剂时，HEA的催眠作用明显被抑制(n＝8；*P<0.05，**P<0.01与溶剂组比；#P<0.05，##P<0.01与给药组比)。

图7.1是HEA及包含HEA的蝉花虫草及其提取物对CPP建立阶段吗啡诱导成瘾的影响(n＝8；*P<0.05，**P<0.01与对照组相比)

图7.2是HEA及包含HEA的蝉花虫草及其提取物对CPP点燃复吸阶段吗啡诱导复吸成瘾的影响(n＝8；*P<0.05，**P<0.01与对照组相比；#P<0.05，##P<0.01与吗啡组相比)。

具体实施方式

实施例1

1.HEA是A₁受体的选择性激动剂

1.1膜受体蛋白的制备

采用Wistar大鼠断头取脑，分离出大脑皮质和纹状体，分别称重，按1:10加入10倍体积冰冷的Tris-HCL缓冲液(50mM，PH7.5)，组织匀浆，混悬液离心后弃上清，重复上述溶液洗涤3次后，再次离心弃上清，将沉淀重新混于50mM Tris-HCL缓冲液，用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定出大鼠大脑皮质蛋白浓度为0.8mg/ml，大鼠纹状体脑组织匀浆蛋白含量为1.3mg/ml。分装后贮存于-80℃备用。(Li M,Kang RX,Shi JG,Liu GT,Zhang JJ,2013.Anticonvulsant Activity of B2,an Adenosine Analog,on ChemicalConvulsant-Induced Seizures,PLoS One Jun 25；8(6):e67060)

1.2腺苷受体配体结合试验

反应管中加入膜蛋白和相应的配体(腺苷A1受体配体结合实验：大鼠皮质脑组织匀浆与相应的配体为0.2nM[3H]DPCPX的结合；腺苷A2A受体配体结合实验：大鼠纹状体脑组织匀浆与相应的配体为0.75nM[3H]MSX-2的结合)，分别测定[³H]-DPCPX([³H]-MSX-2)与大鼠皮质腺苷A₁(大鼠纹状体腺苷A_2AR)结合的饱和曲线，以Scatchard线性转换法，求得平衡解离常数(A1结合的Kd值为0.14nmol/L，Bmax为2290fmol/mg；A_2A结合的Kd值为11.48nmol/L，Bmax为5657fmol/mg)。

测定管加入不同浓度的HEA(10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5mol/L)，混匀后于水浴摇床25℃孵育30min，采用细胞收集器抽吸反应液，使其透过GF/B玻璃滤膜(Watman)，终止反应，用Tris-HCl缓冲液冲洗3次，每次3ml将滤膜取下烘干后装入含4ml闪烁液的闪烁瓶中测定放射活性。通过闪烁计数器对滤膜进行放射活性计数。测定不同浓度的化合物存在时相应的3[³H]-DPCPX或[³H]-MSX-2结合百分数。(Li W,Wang YF,Li M,YUE ZG,Shi JG,Zhang JJ,2011,Sedative and hypnotic effects of a novel ligand YZG-404for adenosineA1receptor,J Int Pharm Res,Vol.38,No.3,June)

1.3试验结果

实验测得HEA与腺苷A₁竞争结合的Ki值为89.5nmol/L，与腺苷A_2A竞争结合的Ki值约为8921.4nmol/L。HEA对腺苷A₁的亲和力约是其对腺苷A_2A亲和力的100倍，结果提示HEA对A₁具有较高的选择性。

2.HEA衍生物的实验

所实验用的衍生物为下列结构式的3中衍生物：

其中，R1为C(CH3)2CH2OH(衍生物1)、CH(CH3)CH2OH(衍生物2)或C(CH3)3(衍生物3)等三种物质进行了与本实验类似的实验，测得HEA的衍生物1-3与HEA的结果类似(具体实验数据略)，结果也提示HEA衍生物1-3对A₁具有较高的选择性。

实施例2.HEA在抗惊厥中的应用

2.1动物模型及给药方法

雄性ICR小鼠，18～22g；购自温州医学院动物实验中心。实验前动物适应环境至少5d。室温保持在25℃，自由进食和进水。健康雄性ICR小鼠按体重随机分为对照组(1％DMSO，ip)、模型组、CCPA组(0.1mg·kg^-1,ip)、HEA组(15mg/kg、40mg/kg、60mg/kg)、DPCPX组(2mg·kg^-1，ip)、ZM241385组(1mg·kg^-1、5mg·kg^-1，ip)、DPCPX+HEA(2mg·kg^-1+40mg/kg，ip)组和ZM241385+HEA(1mg·kg^-1+40mg/kg，5mg·kg^-1+40mg/kg ip)组。其中腺苷A₁R受体拮抗剂DPCPX(或A₂R受体拮抗剂ZM241385)在给药10min之前给予腹腔注射，给药完成15min之后再给予戊四唑(100mg·kg^-1,ip)诱导小鼠惊厥；单独应用拮抗剂组，在给予拮抗剂5min后给予戊四唑(100mg·kg^-1,ip)，观察小鼠对PTZ致惊厥的反应。

2.2检测指标

分别记录各组惊厥发生后的生存时间和死亡率。

2.3试验结果

动物的行为学试验结果提示我们HEA 40mg·kg^-1组，可极显著降低戊四唑所致小鼠惊厥的死亡率。此外，特异性A₁受体拮抗剂DPCPX(2mg·kg^-1，ip)能明显抑制HEA的抗惊厥作用，而特异性A_2A受体拮抗剂ZM241385(1mg·kg^-1、5mg·kg^-1，ip)对HEA的抗惊厥作用没有明显影响。由此，我们推测HEA可能是通过激动A₁受体参与了调节惊厥的作用，可用于惊厥的临床治疗和预防。

实施例3.HEA在脑缺血中的应用

3.1动物模型及给药方法

采用大鼠大脑中动脉远端阻塞脑缺血模型。①根据大鼠体重用10％水合氯醛(3ml/kg)给予腹腔注射麻醉。②将大鼠右侧卧并固定，在眼内眦与外耳道连线处开1cm皮肤切口，分离筋膜、肌肉组织，暴露出颅骨；③用棉花球吸少量生理盐水擦颅骨至视野清晰；④在手术显微镜下分离筋膜、暴露颅骨，在靠近骨脊上1/3处钻直径为2mm圆孔；⑤用少量生理盐水冲洗多余骨屑，拨开脑膜，暴露出大脑中动脉MCA；⑥将大鼠仰卧位固定，沿颈前部正中切口，分离两侧颈总动脉CCA，用手术线穿过，暂时不予结扎；⑦在手术显微镜下找到MCA，用单极电凝器烧灼后再用生理盐水冲洗降温；⑧电凝完后立即结扎双侧颈总动脉，阻塞60min；⑨缝合头部伤口，1h后两侧颈总动脉绳子，缝合皮肤造模完成。SD大鼠随机分为6组：假手术组(1％DMSO，ip)、模型组、HEA 5mg/kg组、HEA 7.5mg/kg组、HEA12mg/kg组、HEA7.5mg/kg+DPCPX1mg/kg组。各组药物分别在dMCAO术前30min分别给予腹腔注射一次，假手术组和模型组给予1％二甲基亚砜，假手术组大鼠仅开颅暴露大脑中动脉，不凝闭大脑中动脉及腹腔注药，A₁选择性腺苷受体拮抗剂DPCPX在给药10min之前给予腹腔注射。

3.2指标测定

3.2.1神经功能评分动物清醒时按照Longa EZ等^[4]的神经缺陷5级4分法标准对大鼠行为学进行评分。0分:无明显神经功能缺损；1分:不能伸展对侧前肢；2分:行走时向对侧旋转；3分:行走时向对侧倾倒；4分:不能自发行走，意识丧失。

3.2.2 TTC染色对脑梗死面积的测定：造模完成24h后，将大鼠麻醉后打开胸腔暴露心脏，250mL生理盐水灌注后，断髓取出脑组织，置于负80℃冰冻。将冻硬的大鼠脑置切脑模具中，从额极至枕极(不含小脑部分)，连续切5片，片厚2mm。用镊子小心将脑片放置于装有2％TTC的避光盒中，常温孵育15min，将数码相机固定于脑片垂直上方30cm处拍照。正常脑组织中线粒体内的琥珀酸脱氢酶与TTC反应呈鲜红色，梗死区由于缺少线粒体而不着色。梗死面积以梗死区域占全脑的百分比来表示。

3.2.3大脑组织形态学染色HE：大鼠造模完成24小时之后，麻醉，心脏灌流取脑组织于4％多聚甲醛中固定；常规脱水、包埋、冠状切片，切片后用苏木素-伊红染色。

3.2.4 tunel检测大脑皮层细胞凋亡情况

取脑组织于多聚甲醛中固定，石蜡切片完成之后按照试剂盒的要求进行tunel法显色水洗,脱水,透明,封片。

3.3实验结果

实验结果显示HEA(7.5mg/kg)明显改善dMCAO大鼠的神经症状，同时显著减小脑梗死面积，减少缺血引起的大脑皮质组织结构变疏松，细胞数明显减少等，大鼠大脑皮质梗死半暗带区细胞凋亡率明显降低。所上述保护作用可被选择性腺苷A₁受体拮抗剂所拮抗，提示HEA具有一定的脑保护作用，而且这一神经保护作用有可能是通过腺苷A₁介导的。

实施例4.HEA在帕金森中的应用

4.1动物模型及给药方法

24±1g雄性C57BL/6小鼠，随机分为5组，采用1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，6-tetrahydropyridine，MPTP)诱导的小鼠PD模型，HEA(5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg)分别连续腹腔注射14天并于第11天在给药前1h，腹腔注射MPTP30mg/kg，连续4天，最后一次给药后1天，进行爬杆能力的行为学测试，4天后拉颈处死取纹状体。对照组给予等量生理盐水，模型组在第11天给予生理盐水前1h，腹腔注射MPTP30mg/kg，连续4天。

4.2指标测定

4.2.1爬杆法测定小鼠运动能力

将小鼠头朝下，置于长50cm，粗10mm的木杆顶端，记录小鼠顺杆从上到下所需要的时间，计算造模前后的时间差，并做统计学分析。

4.2.2免疫组织化学法测定中脑黑质内TH阳性细胞的数量

行为学检测完毕后，心脏用4％多聚甲醛灌注取脑，固定，常规脱水、包埋、取黑质区域不同部位冠状切片，以酪氨酸羟化酶作为神经元的特异性标记。一抗为单克隆小鼠TH抗体(1；1000，Sigma)，二抗为Alexa fluor 488荧光标记山羊抗小鼠(1；1000，MolecularProbes).荧光显微镜拍照，对黑质TH阳性细胞计数。

4.3试验结果

试验结果表明HEA(10mg/kg，ip)显著改善提高小鼠的肢体协调能力，增加TH阳性细胞数量，提示HEA可用于帕金森病的临床治疗和预防。

实施例5.HEA在制备镇静药物中的应用

5.1动物分组及给药方法

雄性ICR小鼠随机分为4组,选用腺苷A₁R拮抗剂DPCPX。小鼠分为溶剂组、HEA(15mg/kg)组、DPCPX(4mg/kg)以及DPCPX+HEA(4mg/kg+15mg/kg)组；其中DPCPX+HEA组由小鼠腹腔注射拮抗剂10min后,再腹腔注射HEA。

5.2检测方法

完成给药15min后将小鼠放入单个不透明的方形自主活动箱(50cm×50cm×40cm)内,摄像机记录5min内的踏格数。以小鼠四肢走入同一格计算,作为动物活动指标。

5.3实验结果

HEA(15mg/kg,ip)对小鼠自主活动的抑制效果显著。提示HEA可在神经系统中发挥镇静作用。

实施例6.HEA在制备睡眠药物中的应用

6.1动物分组及给药方法

雄性ICR小鼠随机分为4组，分别为对照组、阳性地西泮(1mg/kg)组、HEA(25mg/kg)组以及DPCPX+HEA(2mg/kg+25mg/kg)组。小鼠灌胃给药30min后，各组动物均腹腔注射阈剂量戊巴比妥钠50mg/kg。

6.2检测指标：

以15min内小鼠翻正反射消失达1min为入睡标准，记录各组小鼠的睡眠潜伏期与睡眠持续时间。

6.3实验结果

HEA(25mg/kg，sc)对小鼠阈剂量戊巴比妥钠所致的睡眠时间有一定程度的延长,但睡眠潜伏期与对照组比较无统计学差异，提示蝉花提取物HEA具有一定的协同戊巴比妥钠的作用。

实施例7.HEA或者含有HEA的药用菌及提取物在制备治疗和预防成瘾性药物上的 应用

7.1供试样品的制备

精密称取烘干后的蝉花虫草为原料,标记为样品A,以50％的乙醇为溶剂提取,2h/次，过滤，合并滤液，依次通过膜分离、大孔树脂纯化和Sephadex LH20柱纯化，分步提取，分别得到样品B、C、D。分别配置成含各组份样品有效量为1500mg/kg、750mg/kg、100mg/kg、20mg/kg的溶液待用。

7.2动物分组及给药方法

清洁级雄性昆明小鼠，体重18～22g，分为对照组、吗啡组、样品组(A：1500mg/kg、B：750mg/kg、C：100mg/kg、D：20mg/kg)。天然偏爱测试(d-2，d-1，d0)：实验前三天让其在箱中自由穿梭15min，根据大鼠天然偏爱黑箱，故选择白箱作为伴药箱，(d-1，d0)记录每只大鼠在白箱中的停留时间，取两天测试结果的平均值作为大鼠在伴药箱时间的基础值。Cpp建立：吗啡处理组：d1、d3、d5、d7腹腔注射盐酸(10mg/kg，ip)后,白盒训练50min，d2、d4、d6、d8腹腔注射等体积的生理盐水后,黑盒训练50min，给药组在每日注射吗啡前15min给药生理盐水组8天内都给予生理盐水Cpp表达：d9将大鼠不作任何处理头朝白盒放置两盒交界处,让其在两盒内自由活动15min记录大鼠在白箱中的停留时间情况；Cpp消退：d10天开始，实验组和对照组均给予生理盐水d10、d12、d14、d16白盒训练50min，d11、d13、d15、d17训练50min；d18将大鼠不作任何处理头朝白盒放置两盒交界处，让其在两盒内自由活动15min，记录大鼠在白箱中的停留时间情况；Cpp复燃：d19吗啡组给予5mg/kg，给药组在吗啡前15min给药,各组小鼠头朝白盒轻柔放置两盒交界处自由活动15min，记录活动情况。

7.3检测指标

位置偏爱指标：记录小鼠在不同时期的白盒停留时间，分析不同成瘾阶段，HEA或者含有HEA的药用菌及提取物对吗啡诱导的小鼠CPP效应。

7.4试验结果

实验结果表明形成期多次给予蝉花虫草样品A或其分步提取物(B、C、D)对吗啡诱导的小鼠在伴药箱的停留时间没有显著差异，但对戒断期给予蝉花虫草样品A或其分步提取物样品(B、C)处理后在伴药箱时间显著低于吗啡组，特别是样品D在伴药箱时间极显著低于吗啡组，提示HEA可以用于戒断后的觅药行为，具有一定的抗成瘾性。

Claims (9)

1.一种预防和治疗惊厥、改善睡眠、脑中风、帕金森、药物成瘾等神经系统疾病中的食品，其中该食品包括HEA及其衍生物。

2.HEA及其衍生物在制备预防和治疗惊厥、改善睡眠、脑中风、帕金森、药物成瘾等神经系统疾病中的食品原料中的用途。

3.根据权利要求1或2所述的食品，或者用途，其中，HEA的其衍生物包括如下结构通式：

其中，R1为支链或直链的烷基。

4.根据权利要求2所述的食品或者用途，其中，R1为C(CH3)2CH2OH、CH(CH3)CH2OH或C(CH3)3。

5.根据权利要求1的的食品或者用途，其中，所述的HEA来自动植物、微生物、微生物培养物的提取物。

6.根据权利要求4所述的的食品或者用途，其中，所述的HEA来自蝉花虫草、蛹虫草、冬虫夏草及其人工培养物的提取物。

7.根据权利要求1所述的的食品或者用途，其中，起到治疗或者预防惊厥、改善睡眠、中风、帕金森、或阿片类药物成瘾是因为氮6-(2-羟乙基)腺苷以及其衍生物作为腺苷受体激动剂而实现的。

8.根据权利要求7所述的的食品或者用途，其中，所述的腺苷受体为A₁、A_2A、A_2B、A₃中的一种或几种。

9.根据权利要求8所述的的食品或者用途，其中，腺苷受体为A₁受体。