CN108676924A - 小空间小体积加样管的分段加样方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小空间小体积加样管的分段加样方法，采用管径0.5~4mm，容积≤100μL的小空间管，首先采用tip头或加样针吸取5~50μL溶液，移至小空间管底部或预加溶液的液面高度后，出液口缓慢上抬同时开始注液，注液时出液口沿一个方向运动，液面随动，保持注液口始终位于液面上，完成第一次注液；tip头或加样针继续吸液，移至第一次注液后的液面高度后开始注液，注液方法同上，完成第二次注液；重复第二步，完成所有溶液加样。本发明将常规盛装溶液和样本提纯物的标准管改为小空间加样管，分次进行加样，整个加样过程不会产生气泡、溅液等现象，保证了最终检测结果的准确性；同时本发明方法具有通用性，可以与多种加样装置配合使用。

Description

小空间小体积加样管的分段加样方法

技术领域

本发明涉及生物实验过程中反应溶液的加样方法，尤其是涉及一种小空间小体积加样管的分段加样方法。

背景技术

在生物实验中，将反应溶液添加到反应管中的过程称之为加样。加样时，微量生物试剂快速、精确的分配操作，是蛋白质结晶操作、新药研制、基因测序、生物化学实验等生物工程技术领域不可或缺的实验手段。特别是随着高通量筛选技术的发展和进步，实验中需要分配的试剂种类繁多，分配体积越来越小，采用手工操作已经不能满足微量、精确、快速的试剂分配要求。因此，研究自动化的微量生物试剂分配技术对提高分配精度、减少分配体积、提高分配速度，从而促进生物工程领域实验技术水平的提高，具有重要意义。

随着生物技术水平不断提高，单次实验中所操作的试剂体积不断减少，对样品处理的速度、精度等要求不断提高。与手工操作相比，采用自动化的试剂分配技术可以分配更小体积试剂，在等量样本情况下可以做更多的实验来选择最优条件；自动化试剂操作可以更精确分配样本试剂，提高实验成功率，避免了手工操作的枯燥性，可以将实验者从大量繁杂的实验中解脱出来，更好的进行实验规划和结果分析，提高效率。

虽然采用自动化的试剂分配技术优点多多，但是在具体操作时仍然会存在一些溅液等缺陷。

如：基因扩增技术即聚合酶链式反应（polymerase chain reaction简称PCR），可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍,从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。由于该技术能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含一个靶DNA分子的样品，因而该方法在分子生物学、微生物学、医学等领域得到广泛的应用和发展。

医院或检测机构的体外诊断设备（如全自动化学发光免疫分析系统、生化分析仪、核酸仪和尿仪等）在进行样品检测时需要采用基因扩增技术对样品进行前处理，这时需要用PCR管来存储溶液和样本提纯物，然后放置在PCR扩增仪上进行扩增反应。

目前对PCR管加样的方式主要分为两种：一种方法是采用直径小且能提高扩增效率的毛细管，溶液和样本提纯物采用手动分别添加进毛细管中，然后在离心机上进行离心处理（处理时加样管需要倾斜放置），故此种方式需要人工操作，不易实现自动化，且由于离心机安装空间大，导致整个设备体积增大；另一种是采用全自动加样平台，在加样位放置标准PCR管（直径5.35mm），使用加样泵和tip头配合悬空自动加样，但该种加样方法存在的缺陷较多：1、加样时管内容易产生气泡以及加样后溶液和提纯物不能充分混匀，其结果将直接影响后续的扩增反应，降低扩增效率，最终造成检测结果出现偏差甚至失败；2、悬空加样易出现溅液，溅液会造成PCR管周围被污染，增大了交叉污染的风险；3、由于标准PCR管直径较大，扩增时与加热件接触面小，温度升降效率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小空间小体积加样管的分段加样方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的小空间小体积加样管的分段加样方法，加样管采用管径0.5~4mm的小空间管，具体加样步骤为：

第一步，采用tip头或加样针吸取5~50μL溶液，移至小空间管底部或预加溶液的液面高度（保持tip头或加样针口在液面高度±1mm位置处）后，出液口缓慢上抬同时开始注液，注液时出液口沿一个方向运动，液面随动，保持注液口始终位于液面上，完成第一次注液；

第二步，tip头或加样针继续吸液；移至第一次注液后的液面高度后开始注液，注液方法同第一步，完成第二次注液；

第三步，重复第二步，完成所有溶液加样。

为满足溶液的定量要求，每一步操作完成后可在液面上进行吐气操作。

如果所加溶液之间不能自溶（自混），则在第三步注液完成后，需要增加吸打混匀步骤，其操作方法为：tip头或加样针抽气，降至液面后出液口开始抽液，抽液过程中，出液口随液面下降同步下降，至一定位置（从管底向上计，一般可降至管内溶液高度5%~10%的深度）后，按第二步注液方法将抽入的溶液再次注入管内。该操作方法既能保证各溶液之间混合均匀，也不会产生气泡或出现溅液现象。

如果用于PCR扩增反应，采用单卡盒提取实验平台时，所述小空间管可采用直径2.5mm的小空间PCR管，其加样步骤一般分为三次注液，三次注液的溶液量分别为20μL、10μL、30μL。

为便于调整注液速度和tip头或加样针的上升速度，设定每次注液的高度为H(单位mm），±0.05（H值的正负偏差量是考虑到加样管底部的球形结构）, 其中V为加样体积，d为容器的平均直径；此时由电机控制的tip头或加样针上升速度和由加样泵控制的注液速度之间的关系应满足：

注液速度/上升速度=注液体积/电机输入脉冲值×分辨率×电机细分数；

其中电机输入脉冲值=H/电机分辨率×电机驱动部件周长×机械传动比。

本发明的优点在于将常规盛装溶液和样本提纯物（反应溶液）的标准管（如PCR扩增反应用的直径5.35mm）改为小空间加样管（直径0.5~4mm，容积≤100μL），且分次进行加样，既满足了自动化PCR前处理的需要，而且整个加样及吸打混匀过程中不会产生气泡、溅液等不良现象，保证了最终检测结果的准确性，避免了PCR管周围被污染；在后续扩增反应时直径较细的PCR管与加热件接触面增大，温度升降效率得以提高，即提高了扩增效率。

本发明方法具有通用性，既可以与申请人公司专门设计的加样装置配合使用，也可以在其他具有此功能的现有加样装置（如Tecan的移液平台和汉密尔顿公司的ZEUS通用移液器）上使用。

具体实施方式

下面结合汉密尔顿公司的ZEUS通用移液器对本发明方法做更加详细的介绍。

本次加样是在PCR扩增反应前将溶液和样本提纯物添加到PCR管中的过程。

本次需要添加20μL溶液1、10μL溶液2和30μL样本提纯物，加样时溶液和提纯物的加样顺序可以互换。

按照本发明的分段加样方法，加样（添加溶液和提纯物）用PCR管采用管径2.5mm，容积100μL的小空间PCR管，具体加样步骤为：

第一步，采用tip头吸取20μL溶液1，移至小空间PCR管底部，当tip头出液口接触到管底后，出液口缓慢上抬同时开始注液，注液时出液口沿一个方向运动（即从小空间PCR管底部相出口方向移动），液面随动，保持注液口始终位于液面上（处于液面±1mm范围内），完成第一次注液，并在液面上进行吐气操作，以满足定量要求；注液时控制泵的注液速度和tip头上抬速度（正常情况下，可控制注液速度10μL~20μL/s,tip上抬速度2~3mm/s；当加样管的直径较大时， tip头的上抬速度要适当减小，保持注液速度和tip头上抬速度相匹配），使注液口和液面的运动速度基本一致，可有效解决加样时产生气泡、溅液及加样完成后混匀效果不佳的问题；

第二步，tip头继续吸取10μL溶液2；移至第一次注液后的液面高度后开始注液，同样需要保持注液口和液面的运动速度基本一致，按照第一步的注液方法完成第二次注液，并在液面上进行吐气操作；

第三步，tip头继续吸取30μL样本提纯物，移至第二次注液后的液面高度后开始注液，继续保持注液口和液面的运动速度基本一致，完成第三次注液，同样需要在液面上进行吐气操作。

三次加样完成后，针对不同的溶液可能会在小空间PCR管内产生分层现象，且靠自身的扩散很难达到混匀的效果时，可以增加一次吸打混匀过程来达到消除分层现象，其具体操作方法为：tip头抽气，进行液面探测（现有成熟技术，采用电容式或压力式液面探测均可），当tip头降至探测到的液面后出液口开始抽液，抽液过程中，出液口随液面下降同步下降，至一定位置（一般可降至管内溶液总高度的5%~10%的深度）后，出液口上抬并按第二步注液方法（注液口和液面的运动速度基本一致）将抽入的溶液再次注入管内，并在液面上进行吐气操作，完成整个加样工作。

如果本次加样采用直径2.5mm、容积100μL的小空间PCR管，20μL溶液的高度应为4.75mm，10μL溶液的高度应为2.12mm，30μL溶液的高度应为6.36mm。采用贝克曼公司的自动加样装置，电机的分辨率为2细分，电机驱动部件周长为12mm，机械传动比为1:1， 按照下式，可计算出添加20μL溶液1、10μL溶液2和30μL样本提纯物时tip头上升速度（Z轴速度）和注液速度（泵的速度）之间的比值：

计算得到添加20μL溶液1、10μL溶液2和30μL样本提纯物时tip头上升速度（Z轴速度）和注液速度（泵的速度）之间的比值分别为：泵速度/Z轴速度=50.5（加20μL溶液1），泵速度/Z轴速度=56.6（加10μL溶液2），泵速度/Z轴速度=56.6（加30μL样本提纯物），其中注液体积单位μL、H和周长单位均为mm。由于第一步中添加溶液1时，加样管的底部为半球形，相应的泵速度/Z轴速度的比值较后两步要小。

按照上述计算数据控制加样平台进行操作，可保证在整个加样过程中不会产生气泡，不会出现溅液等不良现象。

Claims (4)

1.一种小空间小体积加样管的分段加样方法，其特征在于：加样管采用管径0.5~4mm的小空间管，具体加样步骤为：

第一步，采用tip头或加样针吸取5~50μL溶液，移至小空间管底部或预加溶液的液面高度后，出液口缓慢上抬同时开始注液，注液时出液口沿一个方向运动，液面随动，保持注液口始终位于液面上，完成第一次注液；

第二步，tip头或加样针继续吸液；移至第一次注液后的液面高度后开始注液，注液方法同第一步，完成第二次注液；

第三步，重复第二步，完成所有溶液加样。

2.根据权利要求1所述的小空间小体积加样管的分段加样方法，其特征在于：所述第三步完成后，进行吸打混匀，其操作方法为：tip头或加样针抽气，降至液面后出液口开始抽液，抽液过程中，出液口随液面下降同步下降，至一定位置后，按第二步注液方法将抽入的溶液再次注入管内。

3.根据权利要求1所述的小空间小体积加样管的分段加样方法，其特征在于：所述小空间管为直径2.5mm的小空间PCR管，其加样步骤分为三次注液，三次注液的溶液量分别为20μL、10μL、30μL。

4.根据权利要求1所述的小空间小体积加样管的分段加样方法，其特征在于：设定每次注液的高度为H，±0.05,其中V为加样体积，d为容器的平均直

径；则由电机控制的tip头或加样针上升速度和由加样泵控制的注液速度之间的关系应满足：注液速度/上升速度=注液体积/电机输入脉冲值×分辨率×电机细分数；其中电机输入脉冲值=H/电机分辨率×电机驱动部件周长×机械传动比。